專利名稱：含s盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及構(gòu)建和在基因工程上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及構(gòu)建和在基因工程上的應(yīng)用，更具體地涉及了一種含 S盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在水稻單子葉植物水稻抗病蟲基因工程中的應(yīng)用，屬于植物基因工程 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
真菌、細(xì)菌、病毒等病原微生物的侵染常造成各種農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降。培育和推 廣抗病品種是防治作物病害、保證作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)最安全有效的途徑。利用植物自身抗病基 因，通過常規(guī)育種和分子標(biāo)記輔助育種方法已培育了許多抗病新品種。然而，抗性基因在種 屬間利用具有一定的局限性。轉(zhuǎn)基因方法可克服上述局限，為作物抗病育種開辟了一條新 途徑，也是植物種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑之一。目前，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中所使用的啟動(dòng)子大多數(shù)為 組成型啟動(dòng)子，如果使用植物組織特異性啟動(dòng)子或病原誘導(dǎo)的植物啟動(dòng)子不僅會(huì)獲得目的 產(chǎn)物、達(dá)到預(yù)定目標(biāo)，而且也不會(huì)產(chǎn)生副作用。植物基因啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)、含有順式作用元件的DNA序列，決 定著下游基因轉(zhuǎn)錄的特異性、方向和效率，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。高等植物啟動(dòng)子區(qū)域存在各 種特征元件，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、TATA盒、起始因子和不同的順式作用元件等。其中，TATA 框是依賴于RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄所必需的，決定著轉(zhuǎn)錄起始，并調(diào)控著上游激活蛋白的行為； 起始因子的功能與TATA盒相似，可影響轉(zhuǎn)錄的方向和起始點(diǎn)的定位，但一般不能改變啟動(dòng) 子內(nèi)包含2個(gè)核心序列因子的TATA活性。植物的許多性狀與啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及其調(diào)控方式 密切相關(guān)。因此，研究啟動(dòng)子不僅可以為基因工程提供重要的調(diào)控元件，也可促進(jìn)從遺傳分 子基礎(chǔ)上發(fā)掘具有重要利用價(jià)值的植物新資源。根據(jù)植物啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子調(diào)控的基因表達(dá)不受時(shí)空限制和某種物質(zhì)的誘導(dǎo)而在植物中表達(dá) 出來。雙子葉植物中常用的組成型啟動(dòng)子花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子是目前植物基 因工程中使用最多的啟動(dòng)子，它驅(qū)使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生組成型表達(dá)。它是異源病毒型啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn) 基因植物中具有較高的表達(dá)活性。組成型啟動(dòng)子可應(yīng)用于評(píng)價(jià)一個(gè)基因的生物學(xué)功能、轉(zhuǎn) 基因表達(dá)數(shù)量及其活性，但在改良轉(zhuǎn)基因作物的實(shí)際應(yīng)用中的主要問題是(1)組成型啟 動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因在植物各組織中均有不同程度表達(dá)，它驅(qū)動(dòng)外源基因在植物的各種組織和 所有發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)，產(chǎn)生大量異源蛋白或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破了植物原有 的代謝平衡，增加了植株的代謝負(fù)擔(dān)，有些產(chǎn)物甚至對植物的生長發(fā)育有毒，造成了物質(zhì)和 能量上的巨大浪費(fèi)，同時(shí)還會(huì)改變植物的形態(tài)，影響植物正常的生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致死亡； (2)植物所有細(xì)胞可能會(huì)全部進(jìn)入防御模式，即使在無病原侵染時(shí)仍進(jìn)行抗病反應(yīng)；(3)組 成型啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物可在人和動(dòng)物食用的植物組織中積累，但是生物安全性 要求不能有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。如果用組織、器官特異型和病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子取代組成型啟動(dòng)子，使外源基因能 夠定時(shí)、定點(diǎn)、定量地在植物中表達(dá)，可以克服組成型啟動(dòng)子帶來的問題。因此，組織特異型啟動(dòng)子和病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究與應(yīng)用是植物基因工程的重要內(nèi)容和當(dāng)今國內(nèi)外研究 的熱點(diǎn)。利用啟動(dòng)子的最好方法可能是利用一個(gè)內(nèi)源抗性基因啟動(dòng)子，這樣既可以減少植 物的代謝負(fù)擔(dān)，又可以避免植物防御反應(yīng)的假性激活。比組成型表達(dá)和組織特異型表達(dá)更理想的表達(dá)模式是，只在需要的時(shí)間和地點(diǎn)表 達(dá)而且僅在感染部位啟動(dòng)抗病相關(guān)基因表達(dá)。病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能達(dá)到上述較為理想的結(jié) 果，防止“逃離細(xì)胞死亡”現(xiàn)象出現(xiàn)，消除了對植物生長和發(fā)育影響的副作用。一種理想的 病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子應(yīng)迅速被廣譜野生型病原侵染所激活，并有廣譜抗病性。然而由于植物 對不同病原菌采取了不同的防御機(jī)制，許多重要植物抗病分子機(jī)制尚不明確，所以，目前分 離的大多數(shù)病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子很少能滿足上述要求，仍然 存在輕微的“逃離細(xì)胞死亡”的現(xiàn) 象。因此，迫切需要分離或人工構(gòu)建理想的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。植物抗病機(jī)制研究、轉(zhuǎn)錄組 學(xué)和啟動(dòng)子克隆技術(shù)的發(fā)展，為人工構(gòu)建新的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)前可使用的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子缺乏的主要原因是分離各種天然的病原誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子較少。與天然病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子相比，人工構(gòu)建病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子不僅更具有廣譜 性，而且可根據(jù)不同目的進(jìn)行靈活選擇，如消除啟動(dòng)子表達(dá)元件，可改變啟動(dòng)子的強(qiáng)度和病 原誘導(dǎo)表達(dá)基因的數(shù)量和質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子元件在不同植物品種中防御信號(hào)是相對 保守的。因此，通過收集各種植物啟動(dòng)子元件可以人工構(gòu)建病原啟動(dòng)子。啟動(dòng)子組件有許多不同的類型，包括病原誘導(dǎo)型作用元件、組織特異型作用元件、 細(xì)胞特異型作用元件和人工組建啟動(dòng)子所需的最小啟動(dòng)子區(qū)段。其中病原誘導(dǎo)型作用元件 在抗病方面是最重要的。已知的植物轉(zhuǎn)錄因子家族中有許多在抗病反應(yīng)中起重要作用的成 員，其中包括 WRKYs、ERFs, bZIPs、Mybs、Dofs、bHLHs、ffhirly, SR 和 DBPl 等。這些轉(zhuǎn)錄因 子與I3R基因特異結(jié)合的位點(diǎn)即順式作用元件，對于組建啟動(dòng)子作用元件是非常有用的。在植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)過程中，順式作用元件通過與轉(zhuǎn)錄因子的互作 發(fā)揮著重要調(diào)控作用環(huán)境刺激經(jīng)過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、傳遞后，激活防衛(wèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與 特異順式作用元件的互作，從而實(shí)現(xiàn)相關(guān)防衛(wèi)功能基因的表達(dá)。目前，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提 高植物的抗逆性已成為植物基因工程中重要的研究策略。鑒于順式作用元件的上述重要 調(diào)控作用，與早期的組成型表達(dá)的抗性基因的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用相比，使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子介導(dǎo)的 抗性基因無疑具有多方面的優(yōu)勢，因此鑒定抗性相關(guān)(特別是細(xì)菌性病原相關(guān))誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子已成為目前植物分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。迄今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種受不同病原誘導(dǎo) 的GCC box(AGC-CGCC)和受創(chuàng)傷、部分病原誘導(dǎo)的W box([T]TGAC[C/T]。在防御基因啟 動(dòng)子區(qū)經(jīng)常還含GCC box，它與調(diào)控茉莉酸、激發(fā)子誘導(dǎo)表達(dá)的JERE元件(AGACCGCC)和 調(diào)控真菌誘導(dǎo)表達(dá)的S box(AGCCACC)相似。S盒(核心序列AGCCACC)是2000年Kirsch 等人從荷蘭芹EL17基因啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的受病原真菌誘導(dǎo)的順式作用元件，是一 個(gè)類GCC (AGCCGCC)元件，與茉莉酸應(yīng)答元件JERE (AGACCGCC )、干旱應(yīng)答元件DRE/CRT (TACCGACAT)都具有高度相似性。這幾個(gè)順式作用元件都能特異性結(jié)合于AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄 因子。目前，使用組成型啟動(dòng)子的基因工程植物中，轉(zhuǎn)入抗病相關(guān)基因的持續(xù)表達(dá)可能 會(huì)引起無法控制的防御反應(yīng)，例如“逃離細(xì)胞死亡”。利用轉(zhuǎn)基因的方法來提高作物產(chǎn)量 面臨的另一個(gè)主要問題是啟動(dòng)子引起的背景表達(dá)，帶有開關(guān)并在病原侵染位點(diǎn)能迅速短暫 地誘導(dǎo)抗病基因表達(dá)的啟動(dòng)子是比較理想的啟動(dòng)子。另外，內(nèi)源啟動(dòng)子的分離與利用可以減少背景表達(dá)，但是某些啟動(dòng)子的調(diào)控元件通常既調(diào)控病原誘導(dǎo)基因的表達(dá)又調(diào)控背景表 達(dá)，因而，理想的病原誘導(dǎo)特異型啟動(dòng)子的分離迄今還比較困難。然而，隨著對啟動(dòng)子作用 元件和抗病調(diào)控機(jī)制研究的深入發(fā)展，成功地分離或人工構(gòu)建更理想啟動(dòng)子的可能性會(huì)越 來越大。
研究表明，將馬鈴薯、擬南芥、芫荽菜、長春花等雙子葉植物中鑒定的S盒與 CaMV35S核心啟動(dòng)子(-46 +8bp)融合所構(gòu)建成的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能在煙草、擬南芥等原生 質(zhì)體中瞬間表達(dá)或在轉(zhuǎn)基因植株中被病原菌或誘發(fā)子處理后驅(qū)動(dòng)^依基因表達(dá)。該結(jié)果一 方面表明S盒元件在誘導(dǎo)表達(dá)中的重要作用，另一方面也說明該順式作用元件的結(jié)合蛋白 及其上游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑在上述多種雙子葉植物中具有保守性。但是，迄今仍缺乏在水稻 以及單子葉植物中S盒等元件應(yīng)答病原菌或激發(fā)子的直接證據(jù)。進(jìn)一步在水稻中開展S盒 應(yīng)答病原菌、ET、JA信號(hào)的鑒定和應(yīng)用研究，具有十分重要的意義(1)可望找出應(yīng)答病、 蟲的順式作用元件，以這些元件為誘餌，可進(jìn)一步分離其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子基因；(2)由于順 式作用元件離開其宿主啟動(dòng)子仍可保留其應(yīng)答病原菌或誘發(fā)因子的功能，可利用這些元件 與合適啟動(dòng)子核心序列(如CaMV35S、Actl等基因啟動(dòng)子的核心序列)，構(gòu)建響應(yīng)病原菌侵 染或JA (昆蟲取食)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種含S盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及構(gòu)建和在基因工程上的應(yīng)用，將大力促進(jìn) 水稻抗病基因工程的發(fā)展與應(yīng)用。本發(fā)明的含S盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其至少含有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。構(gòu)建方法如下
本發(fā)明將雙子葉植物歐芹中鑒定的應(yīng)答逆境脅迫的S盒(其序列為 CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAA)與CaMV35S啟動(dòng)子核心序列(-46 +8bp)融合，構(gòu)建成誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子。所述 CaMV35S 啟動(dòng)子核心序列為 TCGACCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTC ATTTGGAGAGGAC。本發(fā)明的含S盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子本底表達(dá)低、應(yīng)答速度快、持續(xù)時(shí)間長、表達(dá)強(qiáng)度 適中。將上述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與抗病(蟲)等基因結(jié)合，構(gòu)建成轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化水稻，可使獲得 的轉(zhuǎn)基因水稻的外源抗性基因誘導(dǎo)表達(dá)，既發(fā)揮抗性基因在抗病(蟲)中的作用，又可避免 由于抗性基因過量表達(dá)導(dǎo)致的物質(zhì)、能量的浪費(fèi)和抗性基因表達(dá)產(chǎn)物對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞本 身的不利影響。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明的含S盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因水稻中可較好地應(yīng)答水稻稻瘟病菌侵染、稻 縱卷葉螟取食和機(jī)械損傷，對已經(jīng)分離鑒定的具有抗病作用的小分子化合物(如乙烯利、苯 丙噻二唑、茉莉酸甲酯)的處理也有明顯的應(yīng)答活性，而對干旱、低溫、高溫等非生物逆境處 理的應(yīng)答活性比較弱或者不表達(dá)。該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在單子葉植物水稻抗病、蟲基因工程中 具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值，其轉(zhuǎn)基因植物株系在誘導(dǎo)植物抗病的小分子化合物高通量篩選 中也有重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為瞬間表達(dá)載體ρΒΤΙΟ-GUS的質(zhì)粒圖譜；圖2為pDN0R-207入門載體；
圖3為pMDC-163目的載體；
圖4為瞬間表達(dá)載體ρΒΤΙΟ-GUS的結(jié)構(gòu)圖5為轉(zhuǎn)基因水稻TO代植株的目的片段PCR檢測；1-13為轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增產(chǎn)物條帶， 14為野生型擴(kuò)增條帶；15為質(zhì)粒擴(kuò)增條帶；
圖6為稻瘟病菌侵染Tl代植株5-7天后GUS染色的結(jié)果；其中1表示5天后，2表示6 天后，3表示7天后，CK為對照；
圖7為稻縱卷葉螟取食Tl代植株葉片不同時(shí)間段后GUS組織化學(xué)染色的結(jié)果；其中1 表示3h后,2表示5h后,3表示24h后。
具體實(shí)施例方式
1載體構(gòu)建過程和轉(zhuǎn) 1. 1材料與方法 材料
1. 1. 1. 1菌株和載體大腸桿菌(fecAericAia co7i)DH5 a和DB3. 1 (福建農(nóng)林大學(xué)生 命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存)；根癌農(nóng)桿菌(^rohcteriws tumefaciems) EEAlOb菌株(福建農(nóng) 林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存);pBT10_GUS瞬間表達(dá)載體(見圖1)由(Weisshaar教授惠 贈(zèng)，Sprenger-Haussels and ffeisshaar, 2000);pDN0R_207 入門載體(見圖 2)和 pMDC-163 目的載體(見圖3)均購自Invitrogen公司。1. 1. 1. 2生化試劑DNA快速回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工 程有限公司，損a/、SacU SpeU PfuTaq酶、rh^酶、T4連接酶和dNTP等購自TaKaRa公司， Gateway載體構(gòu)建試劑盒購自Irwitrogen公司，慶大霉素、卡那霉素、利福平、羧卞青霉素、 潮霉素、X-gluc等為Sigma公司產(chǎn)品。其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純。1. 1. 1. 3引物引物序列由上海生工公司合成，如表1所示。表1引物名稱和核苷酸序列
1. 1. 1. 4序列合成根據(jù)Ohme-Takagi and Shinshi中的S盒序列，(其中劃線堿基為 附加上去的，使正反鏈退火合成的雙鏈兩側(cè)分別帶有損a/和兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn))分別委托上海博亞生物技術(shù)公司合成，如表2所示。
表2合成鏈的名稱和核苷酸序列
1. 1. 1. 5外植體粳稻品種日本晴sativa μ/λ的成熟胚所誘導(dǎo)愈傷
組織為轉(zhuǎn)化所用外植體。1. 1. 1. 6生物和非生物脅迫處理稻瘟病菌(菌株為識(shí)分生孢子、稻縱卷葉 螟幼蟲。方法
1. 1. 2. 1構(gòu)建含二倍盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子瞬間表達(dá)載體將1. 1. 1. 4中合成的帶有損a/ 和SpeI限制性酶切位點(diǎn)的S盒雙鏈寡核苷酸片段插入ρΒΤΙΟ-GUS的相應(yīng)酶切位點(diǎn)上(如 圖4所示)，獲得含有單拷貝S盒的載體ρΒΤΙΟ-Χ-GUS (X-S盒，下同)，將載體pBT10_X_GUS 分別用XbaI/SacI和SpeI/SacI組合酶切(37°酶切3_5h)，回收含S盒的片段通過使用T4 連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a和驗(yàn)證，從而獲得帶有2個(gè)S盒拷貝串聯(lián)的瞬間表達(dá) 載體 pBT 10-XX-GUS。1. 1. 2. 2構(gòu)建含二倍盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子植物表達(dá)載體根據(jù)上述1. 1. 2. 1中構(gòu) 建好的瞬間表達(dá)載體ρΒΤΙΟ-ΧΧ-GUS上二倍的S盒和其下游相鄰的CaMV35S核心啟動(dòng)子 (-46 +8bp)片段設(shè)計(jì)Gateway內(nèi)側(cè)引物，運(yùn)用Gateway載體構(gòu)建技術(shù)(參考Invitrogen 公司Gateway 技術(shù))構(gòu)建植物表達(dá)載體，以pDN0R-207載體為入門載體，pMDC-163為目的載 體從而獲得可用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)表達(dá)載體PMDC-XX-163，表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株 EHA105備用(取Iug左右的pMDC-XX-163載體質(zhì)粒加入到EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰 浴30min ；液氮速凍3min ；取出后37°C水浴5min ；冰浴2min ；加入400ul不加抗生素的YEP 液體培養(yǎng)基，28 V，ISOrpm搖培4h ；取出后涂在含有50mg/L卡那霉素和利福平的YEP固體 培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)到形成單菌落，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證)。1. 1. 2. 3植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌以及對水稻的遺傳轉(zhuǎn)化用接種針挑取含目 的基因pMDC-XX-163的農(nóng)桿菌EHA105菌液，劃線于濃度為50mg/L卡那霉素和利福平的AB 固體培養(yǎng)基，置于28°C黑暗培養(yǎng)3-4d。從上述AB培養(yǎng)基上挑取一個(gè)單克隆于AAM液體培 養(yǎng)基中置于28°C搖床，直至OD值為0. 1。取脫殼的日本晴種子用70%乙醇消毒l-2min，無 菌水沖洗5遍，接著用2. 5%次氯酸鈉溶液(每50ml2. 5%次氯酸鈉溶液含一滴Tween-20)消 毒15min，用無菌水沖洗5遍，后置于滅菌過的濾紙上晾干，再接到N6D+2. 4D誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置 于32°C光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)5-7d誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。取出經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的種子，拔芽后 浸入上述OD為0. 1的AAM菌液中(含AS 10-20mg/L) lOmin，期間輕輕晃動(dòng)，后用濾紙吸干 愈傷表面的菌液。將愈傷轉(zhuǎn)移到2N6-AS培養(yǎng)基上含AAM液體培養(yǎng)基的無菌濾紙上，25°C黑 暗共培養(yǎng)3d。將共培養(yǎng)后的愈傷于無菌水中清洗5-6遍直至無混濁出現(xiàn)，接著用含500mg/ L羧芐青霉素的無菌水清洗30min，用濾紙吸干，將愈傷置于N6D篩選培養(yǎng)基上(含400mg/L 羧芐青霉素、2mg/L 2.4-D和50mg/L的潮霉素)32°C光照篩選培養(yǎng)2周。將經(jīng)篩選培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移到RE- III培養(yǎng)基上(含0. 02mg/L α -NAA、2mg/L KT、50mg/L潮霉素和400mg/L羧芐 青霉素)32°C光照分化培養(yǎng)2-3周。取分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到HF生根培養(yǎng)基上30°C誘導(dǎo) 生根培養(yǎng)1周。1. 1. 2. 4轉(zhuǎn)基因水稻DNA的提取以及分子檢測水稻基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)(sambrook and russel, 2002)方法。用Gateway內(nèi)側(cè)特異引物序列對其進(jìn)行PCR檢測(如 圖5所示)，圖中以表達(dá)載體ρΒΤΙΟ-ΧΧ-GUS為陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因水稻為陰性對照，從圖 中可以看出1 13出現(xiàn)與陽性對照一樣的PCR條帶，說明均為陽性轉(zhuǎn)基因植物。1. 1. 2. 5轉(zhuǎn)基因植株生物和非生物脅迫處理取Tl代飽滿種子經(jīng)含潮霉素的水 溶液(濃度50mg/L)抗性篩選每天12h光照、25°C、培養(yǎng)7_8d后取能正常萌發(fā)的綠色小苗種 到盛有土壤的塑料小花盆中，以尿素和有機(jī)肥作為基肥，出苗后追肥兩次尿素。3-4葉期時(shí) 采用噴霧接種法接種濃度為105個(gè)/mL的稻瘟病菌(菌株為識(shí)仏77)分生孢子后移至25°C 和80%濕度的溫室培養(yǎng)數(shù)天。稻縱卷葉螟幼蟲取食Tl代轉(zhuǎn)基因植株5-6葉期的幼嫩葉片 不同時(shí)間段后將稻縱卷葉螟幼蟲從葉片上移走。1. 1. 2. 6組織化學(xué)染色生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答結(jié)果檢測按照 (Jefferson, 1987)的方法配置⑶S染色液，于_20°C避光儲(chǔ)存。經(jīng)上述生物和非生物脅迫 處理后剪取5-6cm葉片于37°C放置12h再用70%乙醇脫色，期間更換乙醇數(shù)次。待脫色完 全后拍取其照片。2 S盒對稻縱卷葉螟和稻瘟病等生物逆境脅迫的應(yīng)答
Tl代S-GUS轉(zhuǎn)基因植株生長到3-4葉期時(shí)被稻瘟病(菌株為乃分生孢子侵染后 培養(yǎng)5-7天分別檢測⑶S報(bào)告基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，隨著接種后培養(yǎng)時(shí)間的增加病害逐漸 變得嚴(yán)重，而⑶S的表達(dá)量也隨著增加，尤其是病害嚴(yán)重的區(qū)域。在未經(jīng)稻瘟病菌侵染的Tl 代同齡植株除靠近用剪刀剪取部位外葉片其他部位未檢測到明顯的GUS活性(見圖6)。用稻縱卷葉螟幼蟲取食Tl代轉(zhuǎn)基因水稻5-6葉期植株的幼嫩葉片，從開始取食時(shí) 開始計(jì)時(shí)3h、5h、24h后輕輕將稻縱卷葉螟從葉片上移走。剪取葉片5-6cm浸入⑶S液中于 370C 12h后分別檢測上述不同時(shí)間段取食后GUS基因表達(dá)量的變化，在稻縱卷葉螟取食處 能檢測到明顯的GUS活性，隨著取食時(shí)間延長受損區(qū)域增加GUS表達(dá)相應(yīng)的增加(見圖7)。3 結(jié)論
將含有S順式作用元件的35S啟動(dòng)子連接上GUS報(bào)告基因?qū)胨?，在稻縱卷葉螟和 稻瘟病等生物逆境脅迫下，觀察到轉(zhuǎn)基因水稻中⑶S得到了一定的表達(dá)，這說明水稻中也 存在能識(shí)別S元件(或含S核心序列的元件)、并與之結(jié)合促使報(bào)告基因⑶S表達(dá)的AP2/ EREBP類轉(zhuǎn)錄因子。
權(quán)利要求
一種含S盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其至少含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的構(gòu)建方法，其特征在于將雙子葉植物歐 芹中鑒定的應(yīng)答逆境脅迫的S盒與CaMV35S啟動(dòng)子核心序列融合，構(gòu)建成誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的構(gòu)建方法，其特征在于所述S盒的核苷酸 序列為 CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的構(gòu)建方法，其特征在于所述CaMV35S啟動(dòng) 子核心序列為 TCGACCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC。
5.一種含有權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或由權(quán)利要求2所述的方法構(gòu)建的誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子在單子葉植物水稻抗病、蟲基因工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含S盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及構(gòu)建和在基因工程上的應(yīng)用，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子至少含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，構(gòu)建方法是將雙子葉植物歐芹中鑒定的應(yīng)答逆境脅迫的S盒與CaMV35S啟動(dòng)子核心序列融合構(gòu)建而成。本發(fā)明的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因水稻中可較好地應(yīng)答水稻稻瘟病菌侵染、稻縱卷葉螟取食和機(jī)械損傷，對已經(jīng)分離鑒定的具有抗病作用的小分子化合物的處理也有明顯的應(yīng)答活性，而對干旱、低溫、高溫等非生物逆境處理的應(yīng)答活性比較弱或者不表達(dá)。該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在單子葉植物水稻抗病、蟲基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值，其轉(zhuǎn)基因植物株系在誘導(dǎo)植物抗病的小分子化合物高通量篩選中也有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101886078SQ20101025449
公開日2010年11月17日 申請日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者何水林, 劉志欽, 官德義, 方開星, 牟少亮, 王小燕, 王芳權(quán), 黃定全 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)