專利名稱：重組鼠李糖乳桿菌工程菌株及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物分子生物學領域，具體涉及提高抗氧化能力的重組鼠李糖乳桿 菌工程菌株及其制備方法。
背景技術：
乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細 菌的泛稱，是國際公認的一大類益生菌，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品已經(jīng)成為最主要的功能性食品。乳 酸菌大多數(shù)屬于兼性厭氧細菌，生長過程一般不需要氧氣，而且氧氣的存在可能對其造成 危害。氧化脅迫主要來自于各種活性氧品種(Reactive oxygen spicies，R0S)，包括超氧 陰離子(02_)、過氧化氫(H202)、羥基自由基(·0Η)等，ROS能夠破壞蛋白質、核酸、細胞膜等 生物大分子，導致細胞衰亡，其中· OH危害性最大。在進化過程中，細菌細胞內(nèi)出現(xiàn)了各種抗氧化酶類，其中最重要的是超氧化物歧 化酶(Superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(Catalase, CAT)，前者能夠降解02_，后 者能夠清除H2O2，最終阻止· OH的積累，保護細胞不受氧化壓力的危害。然而，大多數(shù)乳桿 菌屬缺乏超氧化物歧化酶基因，只有少數(shù)菌種含有過氧化氫酶基因，因而耐氧化壓力弱。研究表明，鼠李糖乳桿菌是一種典型的具有益生功能的乳桿菌，其染色體上不含 有CAT和SOD基因，抗氧化脅迫能力較弱，作為一種常用的功能性乳酸菌，在發(fā)酵產(chǎn)品加工 過程中會受到各種氧化條件的危害，造成產(chǎn)品品質下降。近年來，通過導入外源基因的方法提高受體菌株抗氧化能力的技術飛速發(fā)展。人 們將來自于植物乳桿菌、清酒乳桿菌、枯草桿菌和嗜熱鏈球菌中的CAT基因和SOD基因轉入 各種耐氧能力弱的乳酸菌受體中，成功提高了這些乳酸菌的抗氧化水平，在鼠李糖乳桿菌 中卻并未報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組載體，攜帶有細菌過氧化氫酶基因和超氧化物歧化 酶基因，能夠表達出過氧化氫酶和超氧化物歧化酶。所述過氧化氫酶基因克隆自清酒乳桿菌，所述超氧化物歧化酶基因克隆自嗜熱鏈 球菌。所述超氧化物歧化酶基因還包括其自身啟動子。所述PCR擴增過氧化氫酶基因的引物為5，-CATGCCATGGCAAATCAACTAACGACT-3， 和5，-CCGCTCGAGAAAATAGGTGTCCCAAAC-3 ’ ；所述PCR擴增超氧化物歧化酶基因的引物為 5’ -CCGCTCGAGCAAGATTTTGTAAG-3 ‘和 5’ -GGGGTACCTGAGGATGATTCTAGAC-3 ’。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組鼠李糖乳桿菌工程菌株，該菌株含有能表達 過氧化氫化酶和超氧化物歧化酶的重組載體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組鼠李糖乳桿菌工程菌株的制備方法，包括如 下步驟
1)通過PCR的方法分別從清酒乳桿菌和嗜熱鏈球菌的基因組中擴增過氧化氫酶 基因和超氧化物歧化酶基因片段；2)將擴增得到的過氧化氫酶基因和超氧化物歧化酶基因串聯(lián)構建到大腸桿 菌-乳桿菌穿梭質粒載體pSIP502(Sorvig et al. ,2003)上，獲得重組質粒；3)將重組質粒轉化大腸桿菌，培養(yǎng)大腸桿菌并提取質粒；4)通過電穿孔法將重組質粒轉化到鼠李糖乳桿菌AS 1. 2466。其中鼠李糖乳桿菌 AS 1. 2466為中國普通微生物菌種保藏管理中心中國科學院微生物研究所保藏的標準菌 株，保藏號為CGMCC 1.2466T。本發(fā)明的另一個目的是提供所述的重組鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵食品工業(yè)上的應用。本發(fā)明提供的含有katA和sodA共整合重組質粒的鼠李糖乳桿菌能顯著提高該鼠 李糖乳桿菌的耐H202毒性的能力。經(jīng)過測定，轉入katA重組質粒和轉入katA和sodA共整 合重組質粒的鼠李糖乳桿菌在6mM H202處理lh后的存活率分別為81. 5%和100%，比含有 空白對照質粒的鼠李糖乳桿菌的存活率高出近一千倍；而轉入共整合質粒PSIPCS的鼠李 糖乳桿菌在更高濃度的H202處理之后的存活率比只含有CAT的鼠李糖乳桿菌又高出100多 倍。同時，轉入katA和sodA共整合重組質粒的鼠李糖乳桿菌，能在通氣的培養(yǎng)條件下有更 多的活菌數(shù)，存活的天數(shù)也更長，大大提高了抗氧化能力。


圖1所示為重組質粒pSIPCAT和pSIPCS的構建示意圖。圖中A 大腸桿菌-乳桿 菌穿梭質粒PSIP502 ；B 重組質粒pSIPCAT ；C 共整合重組質粒pSIPCS。圖2所示為鼠李糖乳桿菌中重組質粒pSIPCS雙酶切鑒定。圖中A為Ncol/Xhol 雙酶切鑒定katA基因。M，DL15000 ;1，PCR擴增katA基因；2，質粒pSIPCS的雙酶切。B為 Xhol/Kpnl雙酶切鑒定sodA基因。M，DL15000 ；1，PCR擴增sodA基因；2，質粒pSIPCS的雙 酶切。圖3所示為重組鼠李糖乳桿菌菌體降解過氧化氫的檢測。圖中1為轉入對照載體 PSIPCK的鼠李糖乳桿菌菌體；2為轉入重組質粒pSIPCAT的鼠李糖乳桿菌菌體；3為轉入共 整合重組質粒pSIPCS的鼠李糖乳桿菌菌體。圖4所示為長期通氣條件下重組鼠李糖乳桿菌生長情況。圖中□表示含有重組質 粒pSIPCAT的鼠李糖乳桿菌； 表示含有對照載體pSIPCK的鼠李糖乳桿菌。圖5所示為低糖培養(yǎng)基中重組鼠李糖乳桿菌生長情況。圖中A表示含有共整合重 組質粒pSIPCS的鼠李糖乳桿菌； 表示含有重組質粒pSIPCAT的鼠李糖乳桿菌。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1攜帶有目的基因katA的質粒載體的構建1. 1清酒乳桿菌基因組DNA提取基因組提取采用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，方法如下(1)取培養(yǎng)至對數(shù)期的清酒乳桿菌菌液5ml，12000rpm離心1分鐘，棄去上清，加入 200 u 1 TES重懸一次，12000rpm離心1分鐘，盡量吸去上清；(2)加入180 u 1溶菌酶(20mg/ml)，37°C水浴處理1小時;(3)加入20 u 1 RNase (10mg/ml)，輕微震蕩15秒，室溫放置5分鐘；(4)加入20iU蛋白酶K溶液，輕輕混勻；(5)加入220 u 1緩沖液GB，振蕩15秒，70°C水浴處理10分鐘，簡短離心去除管蓋 和內(nèi)壁的水珠；(6)加入220 u 1無水乙醇，充分混勻15秒，簡短離心；(7)將上一步所得溶液和絮狀沉淀轉移到吸附柱CB3中，套上收集管，12000rpm離 心30秒，倒掉廢液；(8)向吸附柱中加入500 u 1緩沖液GD，12000rpm離心30秒，倒掉廢液；(9)向吸附柱中加入700 ill漂洗液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，再加入 500 u 1漂洗液PW洗滌一次；(10)將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，置于室溫放置數(shù)分 鐘，徹底晾干吸附材料中的殘余漂洗液；(11)將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50iU經(jīng) 65-70°C預熱的洗脫緩沖液TE，室溫放置5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心 管，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結果，并保存于-20°C備用。1. 2PCR擴增過氧化氫酶基因片段katA上游引物5，-CATGCCATGGCAAATCAACTAACGACT-3’；
下游引物5，-CCGCTCGAGAAAATAGGTGTCCCAAAC-3，。上下游引物中分別引物了 Nco I和Xho I酶切位點，即序列中帶橫線的部分。PCR反應程序_組分加量(單位ii 1)_清酒乳桿菌基因組DNA 1上游引物(10iiM)0.5下游引物(10iiM)0.5dNTPs(10mM each)0.5Ex Taq 酶0.510 X反應緩沖液2無菌雙蒸水15_PCR反應條件95°C預變性 5min，94°C變性 60s，58°C退火 30s，72°C延伸 60s，72°C終延伸 lOmin， 共30個循環(huán)。1. 3katA 連接到質粒 pSIP502
PCR產(chǎn)物和質粒pSIP502經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切，酶切體系見下表
權利要求
一種重組載體，其特征在于，攜帶有細菌過氧化氫酶基因和超氧化物歧化酶基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述超氧化物歧化酶基因包含自身 啟動子。
3.根據(jù)權利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述過氧化氫酶基因克隆自清酒乳 桿菌。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的重組載體，其特征在于，所述超氧化物歧化酶基因克隆自 嗜熱鏈球菌。
5.含有權利要求1 4任一項所述的重組載體的鼠李糖乳桿菌工程菌株。
6.權利要求5所述的重組鼠李糖乳桿菌工程菌株的制備方法，包括如下步驟1)通過PCR的方法分別從清酒乳桿菌和嗜熱鏈球菌的基因組中擴增過氧化氫酶基因 和超氧化物歧化酶基因；2)將擴增得到的過氧化氫酶基因和超氧化物歧化酶基因串聯(lián)構建到大腸桿菌_乳桿 菌穿梭質粒載體PSIP502上，獲得重組質粒；3)將重組質粒轉化大腸桿菌，培養(yǎng)大腸桿菌并提取質粒；4)通過電穿孔法將重組質粒轉化到鼠李糖乳桿菌中。
7.權利要求5所述的重組鼠李糖乳桿菌工程菌株在發(fā)酵食品工業(yè)中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組鼠李糖乳桿菌工程菌株及其制備方法，該鼠李糖乳桿菌工程菌株攜帶有串聯(lián)的過氧化氫酶基因和超氧化物歧化酶基因的表達載體。該工程菌株的制備方法包括如下步驟1)通過PCR的方法分別從清酒乳桿菌和嗜熱鏈球菌的基因組中擴增過氧化氫酶基因和超氧化物歧化酶基因片段；2)設計特定的限制性酶切位點，串聯(lián)構建到大腸桿菌-乳桿菌穿梭質粒載體pSIP502上；3)通過電穿孔法將重組質粒轉化到鼠李糖乳桿菌中。通過本發(fā)明制備的重組鼠李糖乳桿菌工程菌株能顯著提高抗氧化能力，能應用于發(fā)酵食品工業(yè)中。
文檔編號A23L1/00GK101948856SQ20101025423
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月16日 優(yōu)先權日2010年8月16日
發(fā)明者安浩然, 羅云波, 郝彥玲 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學