專利名稱：一種集蜂曲霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種甲醛降解菌，具體涉及一種集蜂曲霉 (Aspergillus nomius) H5及其在降解甲醛方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
因應(yīng)用領(lǐng)域的廣泛及重要性，關(guān)于甲醛降解菌的甲醛降解能力的研究早有報(bào) 道。早期人們著手于低濃度降解甲醛的研究，近年來(lái)高濃度降解甲醛時(shí)有報(bào)道。 Adroer 等(1990)分離的 Pseudomonas putida A2 能降解甲醛 250mg · L-1 ； Azachil 等 (1995)分離的 Halomonas sp.MAC 僅能耐受甲醛 75 IOOmg · I/1 ； Doronina 等(1997) 分離的 Pseudomonas.alcaligenes 能降解甲醛 200mg · I/1，菌株 Pseudomonas putida J3 能降 解甲醛 450mg · L-1，Methylobacteriumextorquens 能降解甲醛 500 IOOOmg · I/1 ； 一株 Pseudomonas alcaligenes 培養(yǎng) 3 天后能降解甲醛 2000mg · I/1。Mirdamadi 等(2005)報(bào) 道 Methylobacterium extorquens (ESS 禾口 PSS)禾口 四株 Pseudomonas pseudoalcaligenes (LSW, SSW, NSW, OSS)能降解甲醛 I85Omg · I/1，其中菌株 Pseudomonas pseudoalcaligenes OSS 培養(yǎng) 24h 消耗 3700mg · I71 甲醛 100%，培養(yǎng) 72h 消耗 5920mg · I71 甲醛 70%， Methylobacterium extorquens ESS 禾口 Methylobacterium extorquens PSS 還能完全降角軍甲酸 2960mg · I71。Bonastre等(1986)報(bào)道在C 為2300mg · dm 3的活性污泥做基質(zhì)的 實(shí)驗(yàn)里能部分的降解甲醛，甲醛能在好氧條件下被好氧菌降解；當(dāng)以甲醛為碳源時(shí)降解 甲醛400mg · dm3，在活性污泥廠的廢水處理中完全降解甲醛2300mg · dm3和苯酚 2400mg · dm3(Zagomayaetal，1990)。Yamazaki 等(2001)從海水里分離了一株甲醛耐 受細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)它在3%的氯化鈉里能降解甲醛400mg · dm3，在Eiroa等(2004)設(shè)計(jì)的 模型里，指出硝化作用可以降解甲醛，當(dāng)以甲醛為碳源、甲醇為伴生碳源時(shí)，硝化細(xì)菌 可以降解甲醛的濃度是30 3890mg · dm3，而反硝化細(xì)菌在有甲醛和甲醇存在時(shí)可以 降解 1360mg · dm3 甲醛(Eiroaetal，2006)?，F(xiàn)有的研究，無(wú)論是低濃度降解甲醛還是高濃度降解甲醛，大部分都是關(guān)于是 降解甲醛細(xì)菌和降解甲醛酵母菌的研究，而關(guān)于降解甲醛霉菌的研究報(bào)道很少。Kondo 等(2002)從土壤中分離 了一株甲醛耐受真菌 Aspergillus nomiusIRI013, 它能生長(zhǎng)在最高= 0.45%里并把它完全消耗掉。國(guó)內(nèi)這方面的研究近兩年來(lái)也 漸多，黃賽花等人有一系列技術(shù)報(bào)道，從家具廠未處理出水口處分離到甲醛降解真菌 (2007)，研究出 3 株甲醛轉(zhuǎn)化霉菌 Trichoderma viride Hl，Penicillium javanicum H2， Aspergillus flavus H4,均能生長(zhǎng)在以甲醛為唯一碳源的培養(yǎng)基上，可將甲醛濃度分別由 1047mg/L、1059mg/L 和 1241mg/L 轉(zhuǎn)化至 7.6mg/L、317mg/L 和 4.0mg/L，轉(zhuǎn)化率分別 為99.3%、70.1%和99.7% (2008)，都能利用4種復(fù)合碳源(0.1 %甲醛+10%蔗糖，0.1% 甲醛+10%麥芽糖，0.1%甲醛+10%淀粉，0.1%甲醛+10%葡萄糖)并轉(zhuǎn)化甲醛，其轉(zhuǎn)化 率分別在 99.6%、74.9%和 99.3% 以上(2009)。
但是隨著甲醛污染的生物處理工程技術(shù)日新月異的需求，上述降解甲醛菌數(shù)據(jù) 庫(kù)顯得非常不足，迫切需要更多關(guān)于降解甲醛菌的技術(shù)研究成果為甲醛污染的生物處理 工程提供強(qiáng)有力的幫助。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有甲醛降解菌技術(shù)的不足，提供一種新的甲醛降解 菌，所述甲醛降解菌易培養(yǎng)，甲醛轉(zhuǎn)化效率高。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述甲醛降解菌的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案通過以下技術(shù)予以實(shí)現(xiàn)提供一種新的甲醛降解菌，為集蜂曲霉(Aspergillusnomius)菌株，于2010年4
月9日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中
心保藏，保藏號(hào)是CGMCCNo.3721，命名為集蜂曲霉(Aspergillus nomius)H5。 所述集蜂曲霉(Aspergillus nomius) H5的平板觀察特征和顯微觀察特征如下H5在察氏培養(yǎng)基上7天直徑3 4cm，12 14天達(dá)5 6cm，質(zhì)地主要為致 密絲絨狀，中央部出現(xiàn)不規(guī)則的溝紋，菌落初期黃色，而后變綠，反面無(wú)色至淡黃色； 在麥芽汁瓊脂上菌落生長(zhǎng)快，培養(yǎng)7天長(zhǎng)滿全皿，質(zhì)地絮狀，較厚，初期白色，后變綠 色；在查氏酵母膏瓊脂上，菌落生長(zhǎng)液快，培養(yǎng)7天長(zhǎng)滿全皿，質(zhì)地絲絨狀或絮狀，較 厚，分生孢子結(jié)構(gòu)多，綠色，有不規(guī)則的溝紋，菌落反面淡黃褐色；顯微鏡下可以觀察 到分生孢子頭初為球形，后呈輻射形；頂囊近球形至燒瓶形，直徑10 25 μ m，產(chǎn)孢結(jié) 構(gòu)雙層，分生孢子多為球形或近球形，直徑3.0 5.0 μ m，壁稍粗糙。所述集蜂曲霉(Aspergillusnomius) H5 的 18Sr DNA 比對(duì)序列見 SEQ ID NO 1 所 示。其18Sr DNA序列與集蜂曲霉(Aspergillusnomius)同源率達(dá)100%。本發(fā)明同時(shí)提供了所述集蜂曲霉(Aspergillus nomius)H5的甲醛降解特性實(shí)驗(yàn)， 通過大量實(shí)驗(yàn)證明了 H5的甲醛轉(zhuǎn)化效率很高，可以作為優(yōu)良的甲醛降解菌應(yīng)用于甲醛污 染的生物處理方面。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種新的集蜂曲霉(Aspergillus nomius)H5，所述菌株具有優(yōu)良
的降解甲醛的能力，極大地補(bǔ)充了降解甲醛菌的資料庫(kù)；所述集蜂曲霉(Aspergillus nomius)H5在自然界中分布范圍廣，繁殖迅速，生長(zhǎng)能力強(qiáng)。本發(fā)明提供了集蜂曲霉(Aspergillus nomius)H5在甲醛降解方面的應(yīng)用，為甲醛 污染的生物處理工程，提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。


圖1H5在察氏培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)情況圖2H5在麥芽汁瓊脂上菌絲生長(zhǎng)情況圖3H5在查氏酵母膏瓊脂上菌絲生長(zhǎng)情況
圖4H5顯微鏡下孢子結(jié)構(gòu)圖5不同甲醛濃度培養(yǎng)基中的H5降解曲線圖6不同甲醛濃度培養(yǎng)基的空白曲線
圖7不同甲醛濃度培養(yǎng)基中的H5生長(zhǎng)曲線
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例1本發(fā)明甲醛降解菌-集蜂曲霉(Aspergillus nomius)H5的分離與鑒定1、培養(yǎng)基配方基本培養(yǎng)基1.0%(w · ν—1)葡萄糖，0.2% (w · NaNO3, 0.1% (w · ν-1) K2HPO4, 0.05 % (w · ν-1) MgSO4 · 7H20, 0.05 % (w · v_1)KCl, 0.001 % (w · FeSO4 · 7H20, 0.01% (w · 酵母膏，0.1% (w · 甲醛(甲醛用市售甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶 液)，培養(yǎng)基最終pH為6.0。(如沒有特別說明，以下基本培養(yǎng)基均為此配方培養(yǎng)基)察氏培養(yǎng)基配方3.0%(w .ν—1)蔗糖，0.3% (w · NaNO3, 0.1% (w · ν-1) K2HPO4, 0.05 % (w · ν-1) MgSO4 · 7Η20, 0.05 % (w · v_1)KCl, 0.001 % (w · FeSO4 · 7H20, 1.5 ~ 2.0% (w · 瓊脂。麥芽汁培養(yǎng)基配方2.0% (w · V1)麥芽浸膏，0.1% (w · V1)蛋白胨，2.0% (w · ν—1)葡萄糖，1.5-2.0% (W · V-1)瓊脂。查氏酵母膏瓊脂配方K2HPO4CU % (w · v—1)，酵母膏0.05% (w · ν—1)，蔗糖 3.0% (w ·丨1)，查氏濃儲(chǔ)液 ml(w ·丨1)，1.5 2.0% (w · ν-1)瓊脂。pH 自然。 其中查氏濃儲(chǔ)液配方NaN0330g，KC15g，F(xiàn)eSO4 · 7H200.1g, MgSO4 · 7H205g,水 IOOmLo2、分離純化隨機(jī)取菜園土 1kg，晾至7 8成干，0.1 % (w · ν—1)的甲醛溶液200mL，用 滴管均勻加入菜園土樣中，4 5天后再重復(fù)加入一次0.1% (w · ν—1)的甲醛200mL，
3 4天后混勻取樣IOOg左右，在超凈工作臺(tái)上，取IOg經(jīng)0.1%甲醛馴化過的土樣置 于90mL無(wú)菌水中，振蕩15min，放置20秒，取ImL上清液接種于基本培養(yǎng)基中，在 搖床上160r · miiTiCTC培養(yǎng)5d，生長(zhǎng)起來(lái)的真菌再多次用PDA培養(yǎng)基平板畫線，經(jīng)多 次純化，分離到一株霉菌，編號(hào)H5。然后將菌株H5分別接種于察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培 養(yǎng)基、查氏酵母膏瓊脂上，25°C培養(yǎng)8d，觀察其菌落特征。同時(shí)，顯微鏡下觀察顯微結(jié) 構(gòu)，并記錄好結(jié)構(gòu)特征。H5在察氏培養(yǎng)基上7天直徑3 4cm，12 14天達(dá)5 6cm，質(zhì)地主要為致密 絲絨狀，中央部出現(xiàn)不規(guī)則的溝紋，菌落初期黃色，而后變綠，反面無(wú)色至淡黃色；見 附圖1所示；在麥芽汁瓊脂上菌落生長(zhǎng)快，培養(yǎng)7天長(zhǎng)滿全皿，質(zhì)地絮狀，較厚，初期白 色，后變綠色；見附圖2所示；在查氏酵母膏瓊脂上，菌落生長(zhǎng)液快，培養(yǎng)7天長(zhǎng)滿全皿，質(zhì)地絲絨狀或絮 狀，較厚，分生孢子結(jié)構(gòu)多，綠色，有不規(guī)則的溝紋，菌落反面淡黃褐色；見附圖3所
示ο顯微鏡下可以觀察到分生孢子頭初為球形，后呈輻射形；頂囊近球形至燒 瓶形，直徑10 25μιη，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，分生孢子多為球形或近球形，直徑3.0 5.0 μ m，壁稍粗糙。見附圖4所示。
提取DNA，檢測(cè)DNA濃度和純度，PCR 18S rDNA擴(kuò)增等一系列的分子鑒定， 所述集蜂曲霉(Aspergillus nomius)H5的18& DNA比對(duì)序列見SEQ ID NO 1所示，本 發(fā)明分離純化得到的降解甲醛菌的18SrDNA序列與集蜂曲霉(Aspergillusnomius)同源率 達(dá)100%，其培養(yǎng)特征及顯微特征也與集蜂曲霉(Aspergillusnomius)最相似。由此可見，本發(fā)明篩選到的降解甲醛菌是集蜂曲霉(Aspergillusnomius)。實(shí)施例2本發(fā)明集蜂曲霉(Aspergillus nomius) H5對(duì)甲醛的降解實(shí)驗(yàn)1、一級(jí)種子的制取選取產(chǎn)孢良好的集蜂曲霉(Aspergillus nomius)H5，接種在基本培養(yǎng)基中，搖床 160r · mm1, 30°C培養(yǎng)2 3d，當(dāng)霉菌進(jìn)入快速生長(zhǎng)期時(shí)，定時(shí)測(cè)定OD475值，當(dāng)OD475 值快速上升時(shí)，此菌液即可作為一級(jí)種子。2、實(shí)驗(yàn)方案選取大口 150mL三角瓶，配制基本培養(yǎng)基，按約0.1%、0.15%, 0.2%, 0.25% (w - ν"1)加入(C 以實(shí)際測(cè)量數(shù)據(jù)為準(zhǔn))，瓶口用無(wú)菌封口培養(yǎng)膜封口，培養(yǎng)一 級(jí)種子(OD475值為0.878)，除空白外每瓶接入5mL，置搖床上30°C 160r · miiT1培養(yǎng)，并 在接種的第O、24、48、72、96、120、144h分別取樣，每次取3瓶，其中一瓶為空白， 取樣后先7000 X超低溫離心15min、過濾，濾液用AHMT分光光度法檢測(cè)C甲·，濾紙和 菌一起轉(zhuǎn)入已稱至恒重的燒杯中測(cè)菌絲干重，菌絲干重用重量法測(cè)量，結(jié)果取其平均值 作圖。OD值測(cè)定用北京普析通用儀器有限責(zé)任公司TU-1800型紫外可見分光光度計(jì)，
菌絲干重用重量法測(cè)量，結(jié)果取其平均值作圖。結(jié)果見附圖5 附圖7所示。其中，附圖5為不同甲醛濃度培養(yǎng)基中的H5降解 曲線，附圖6為不同甲醛濃度培養(yǎng)基的空白曲線，附圖7不同甲醛濃度培養(yǎng)基中的H5生 長(zhǎng)曲線。由附圖5 附圖7可知4個(gè)濃度的空白在144h內(nèi)的揮發(fā)很少，基本可以忽略不計(jì)，見附圖6所示。當(dāng)甲醛初始濃度為1235mg/L時(shí)，144h可全部被降解完，降解率為100%，快 速降解從48h后開始，見附圖5所示；菌絲干重也從0.4689g上升到0.5298g，增加了 0.0609g,快速增長(zhǎng)從72h后開始，見附圖7所示；當(dāng)甲醛初始濃度為1682mg/L時(shí)，144h 下降到65mg/L，降解率為96.1%，快速降解從48h后開始，菌絲干重也從0.4759g上升 到0.5236g，增加了 0.0477g，快速增長(zhǎng)從72h后開始；當(dāng)甲醛初始濃度為2377mg/L時(shí)， 144h下降到854mg/L，降解率為64.1%，快速降解從96h后開始，菌絲干重增加緩慢， 沒有明顯的快速增長(zhǎng)；當(dāng)甲醛初始濃度為2849mg/L時(shí)，144h也能降解到1507mg/L，降 解率達(dá)到47.1%，沒有快速降解期，菌絲干重增加緩慢，沒有明顯的快速增長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.一種集蜂曲霉(Aspergillus nomius)菌株H5，于2010年4月9日保藏于中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)，保藏號(hào)是CGMCCNo.3721。
2.權(quán)利要求1所述集蜂曲霉(Aspergillusnomius)菌株H5的序列表。
3.權(quán)利要求1所述集蜂曲霉(Aspergillusnomius)菌株H5的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于降解甲醛。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種集蜂曲霉(Aspergillus nomius)菌株H5及其應(yīng)用。所述集蜂曲霉(Aspergillus nomius)菌株H5于2010年4月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)，保藏號(hào)是CGMCCNo.3721。所述集蜂曲霉(Aspergillus nomius)菌株H5在自然界中分布范圍廣，繁殖迅速，生長(zhǎng)能力強(qiáng)，本發(fā)明提供了集蜂曲霉(Aspergillusnomius)菌株H5在降解甲醛方面的應(yīng)用，為甲醛污染的生物處理工程提供技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102021121SQ201010253820
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者劉婷琳, 盧普相, 張朝陽(yáng), 楊孟娟, 陳能場(chǎng), 黃賽花 申請(qǐng)人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所