本發(fā)明涉及一種用于擴(kuò)增檢測(cè)玉米5512j基因的分子標(biāo)記的特異性引物組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玉米（zeamaysl.）屬于禾本科玉蜀黍?qū)儆衩追N，為一年生草本植物，起源于中美洲地區(qū)，是世界三大糧食作物之一，同時(shí)也是重要的工業(yè)原料和能源作物。隨著世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，作為食品、飼料和燃料的重要來源，玉米的需求量在不斷增加，同時(shí)也是我國今后一個(gè)時(shí)期消費(fèi)需求增長最快的農(nóng)作物。近年來玉米深加工業(yè)產(chǎn)能迅速擴(kuò)展，對(duì)畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展表現(xiàn)出了舉足輕重的作用，這對(duì)玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的改良與創(chuàng)新提出了更高的要求。

為了提高玉米品質(zhì)，國內(nèi)外科研人員利用生物學(xué)的方法對(duì)玉米的品質(zhì)進(jìn)行大量的試驗(yàn)摸索和改造嘗試。其基本原理是，以玉米中一些籽粒的突變體為材料，運(yùn)用分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行相關(guān)基因的克隆和研究，從而借助遺傳學(xué)的手段提高其營養(yǎng)價(jià)值。在玉米中，有一類與蛋白品質(zhì)相關(guān)的突變體，被稱為opaque或floury突變體。在表型上，這類突變體胚乳細(xì)胞內(nèi)的主要儲(chǔ)藏細(xì)胞器淀粉粒和蛋白體包裝不緊密，造成籽粒胚乳結(jié)構(gòu)疏松，比較容易粉碎，所以與野生型的透明籽粒相比容易消化，適口性好，更適合用于優(yōu)質(zhì)飼料的加工。其中最為有名的是opaque2突變體。opaque2突變體具有粉質(zhì)的、不透光的胚乳表型。opaque2基因可以顯著降低醇溶蛋白在胚乳蛋白中的比例、顯著提高玉米籽粒胚乳蛋白中賴氨酸含量，從而提高籽粒品質(zhì)。floury1是另一個(gè)比較有名的籽粒粉質(zhì)突變體。fl1通過改變22kd醇溶蛋白在蛋白體中的定位來影響蛋白體的合成，從而形成粉質(zhì)的胚乳表型。

5512j也是一個(gè)類似的粉質(zhì)胚乳突變體。對(duì)5512j突變體的遺傳學(xué)分析表明：5512j是單基因控制的隱性突變，能夠引起玉米籽粒的不透明表型（圖1）。遺傳學(xué)研究將5512j基因定位在2號(hào)染色體上。5512j基因至今尚未通過雜交育種被很好地利用，主要是因?yàn)?i>5512j由隱性基因突變引起，通過雜交選育需要較長的時(shí)間。借助dna分子標(biāo)記輔助育種，利用網(wǎng)上玉米基因組序列信息結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)軟件的分析進(jìn)行了ssr、indel等分子標(biāo)記的開發(fā)，篩選出多態(tài)性良好的分子標(biāo)記用于對(duì)群體材料的檢測(cè)。最終通過對(duì)大規(guī)模突變體籽粒群體進(jìn)行檢測(cè)，將5512j基因限定在2號(hào)染色體短臂上h2和k6區(qū)間內(nèi)。

dna分子標(biāo)記輔助育種是一種新的育種技術(shù)。該技術(shù)是通過利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的dna分子標(biāo)記對(duì)控制目標(biāo)性狀的基因進(jìn)行間接選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)。該技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移，不僅可以在早代進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且可以克服再度利用隱性基因時(shí)識(shí)別難的問題，從而加速育種過程，提高育種效率。由于其明顯的優(yōu)越性，該技術(shù)已得到了發(fā)達(dá)國家的高度重視和應(yīng)用。dna分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的關(guān)鍵是：（1）獲得的分子標(biāo)記應(yīng)該是能夠區(qū)分育種過程中雜交親本（純合5512j類型和純合野生型類型）以及他們的雜交子代（f1代）的共顯性標(biāo)記；（2）獲得的共顯性分子標(biāo)記位于該基因在染色體物理位置的兩側(cè)；（3）兩側(cè)的分子標(biāo)記都應(yīng)該與控制目標(biāo)性狀的基因緊密連鎖。但是，以往的研究中沒有獲得與5512j基因緊密連鎖的共顯性dna分子標(biāo)記，故無法對(duì)該基因所控制的目標(biāo)性狀進(jìn)行dna分子標(biāo)記輔助的選擇。所以，對(duì)于該種標(biāo)記的獲得和鑒定是對(duì)玉米品質(zhì)相關(guān)基因5512j進(jìn)行dna分子標(biāo)記輔助育種的基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于擴(kuò)增檢測(cè)玉米5512j基因的特異性分子標(biāo)記的特異性引物組。

本發(fā)明的目的之二在于提供該特異性引物組在檢測(cè)和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本5512j中的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種用于擴(kuò)增檢測(cè)玉米5512j基因的特異性分子標(biāo)記的特異性引物組，其特征在于：

擴(kuò)增該玉米5512j基因左側(cè)dna片段的第一對(duì)特異性引物的堿基序列為：

正向引物從5′端至3′端為：gcagagttggagacaagttcgg；

反向引物從5′端至3′端為：cacaagtaatgtttggggtaggc；

擴(kuò)增該玉米5512j基因右側(cè)dna片段的第二對(duì)特異性引物的堿基序列為：

正向引物從5′端至3′端為：gcaacgagtgagcgagatgag；

反向引物從5′端至3′端為：gccatgtcgctctggtatacg。

一種根據(jù)上述的用于檢測(cè)玉米5512j基因的分子標(biāo)記在檢測(cè)和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的兩對(duì)位于5512j基因染色體物理位置兩側(cè)的與其緊密連鎖的共顯性dna分子標(biāo)記，以及利用這兩對(duì)分子標(biāo)記能對(duì)玉米5512j基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇的方法。利用這兩個(gè)分子標(biāo)記能對(duì)玉米任何時(shí)期和任何組織的dna進(jìn)行基因型鑒定，檢測(cè)雜交育種子代各單株中5512j基因的存在與否以及雜合或純合狀態(tài)。這種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性高，操作簡單，為利用5512j基因的dna分子標(biāo)記輔助育種提供重要的技術(shù)手段。

附圖說明

圖1、玉米5512j純合突變體和野生型籽粒外形及透光觀察。wt為野生型籽粒；5512j為突變體純合籽粒。

圖2、用于進(jìn)行5512j基因定位的f2群體構(gòu)建路線。

圖3、標(biāo)記h2在w22背景的f2群體中的分離情況；其中5512j/5512j為純合突變體；+／5512j為雜合體；+/+為純合野生型。

圖4、標(biāo)記k6在w22背景的f2群體中的分離情況；其中5512j/5512j為純合突變體；+／5512j為雜合體；+/+為純合野生型。

圖5、本發(fā)明中分子標(biāo)記在玉米2號(hào)染色體短臂上的示意位置，其中cen2代表2號(hào)染色體著絲粒，tel代表端粒。

圖6、是標(biāo)記h2在不同自交系間的多態(tài)情況。

圖7、是標(biāo)記k6在不同自交系間的多態(tài)情況。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施事例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克?。╩olecularcloning:alaboratorymanual,3rded.）或植物分子生物學(xué)－實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（plantmolecularbiology－alaboratorymanual,melodys.clark編，springer-verlagberlinheidelberg,1997）中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例一：兩個(gè)共顯性分子標(biāo)記的獲得

本發(fā)明通過經(jīng)典的遺傳定位獲知5512j基因定位在玉米第2號(hào)染色體的短臂上。通過在5512j位點(diǎn)附近為純合突變體和純合野生型的植株構(gòu)建的f2群體，提取純合突變體、野生型以及f2群體各單株的基因組dna。通過篩選已有的ssr分子標(biāo)記，獲取有多態(tài)性的ssr類型分子標(biāo)記（umc2032與bnlg1175），將5512j基因定位于分子標(biāo)記umc2032與bnlg1175之間。然而這兩個(gè)標(biāo)記和5512j的連鎖性并不十分緊密，在實(shí)際使用上仍有一定的問題。因此根據(jù)umc2032與bnlg1175之間已知的b73基因組序列（http://www.genome.arizona.edu/fpc/maize），設(shè)計(jì)引物。通過測(cè)序以及序列比對(duì)，獲得純合突變體與純合野生型親本間的序列差異，并通過所測(cè)序列開發(fā)標(biāo)記，然后根據(jù)序列差異設(shè)計(jì)獲得能夠區(qū)分育種過程中雜交親本（純合突變體類型和純合野生型類型）以及它們雜交子代（f1代）的特異性標(biāo)記h2和k6。

擴(kuò)增該基因左側(cè)dna片段的第一對(duì)特異性引物h2的堿基序列為：

正向引物從5′端至3′端為：gcagagttggagacaagttcgg；

反向引物從5′端至3′端為：cacaagtaatgtttggggtaggc；

擴(kuò)增該基因右側(cè)dna片段的第二對(duì)特異性引物k6的堿基序列為：

正向引物從5′端至3′端為：gcaacgagtgagcgagatgag；

反向引物從5′端至3′端為：gccatgtcgctctggtatacg。

實(shí)施例二：分子標(biāo)記h2與k6與5512j連鎖關(guān)系的確定

分別抽提5512j/5512j與w22背景雜交后獲得的f2群體中的籽粒dna用于分子標(biāo)記h2與k6與5512j連鎖關(guān)系的分析，野生型表型的基因型為+/+和+/5512j，5512j純合突變體的基因型為5512j/5512j。以這些樣本來分析分子標(biāo)記h2與k6與5512j基因的遺傳連鎖關(guān)系（圖3和4）。分析結(jié)果表明，這兩個(gè)標(biāo)記與5512j基因連鎖，大群體分析表明，在w22背景的分離群體中，標(biāo)記h2的交換率為3.0×10^-3，標(biāo)記k6的交換率為4.0×10^-3。分子標(biāo)記h2與k6與5512j基因在染色體上的物理位置關(guān)系參見圖5。

實(shí)施例三：分子標(biāo)記在不同親本間的多態(tài)性鑒定

提取5512j/5512j和6種育種中廣泛使用的自交系昌7-2、w22、w64a、b73、鄭58、和bsss53的基因組dna，通過pcr反應(yīng)分析在不同品種間的多態(tài)性。結(jié)果表明，使用本發(fā)明中的分子標(biāo)記h2和分子標(biāo)記k6可以區(qū)別5512j/5512j與其余所有自交系（圖6和圖7）。此結(jié)果證明，分子標(biāo)記h2和分子標(biāo)記k6能夠在w22、w64a、b73、昌7-2和bsss53背景群體中準(zhǔn)確檢測(cè)到5512j基因的存在，輔助選擇時(shí)的錯(cuò)選率為2.04×10^-7，可以滿足選擇要求。

<110>上海大學(xué)

<120>用于擴(kuò)增檢測(cè)玉米5512j基因的分子標(biāo)記的特異性引物組及其應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>22

<212>單鏈dna

<213>人工序列

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gcagagttggagacaagttcgg22

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<212>單鏈dna

<213>人工序列

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cacaagtaatgtttggggtaggc23

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<212>單鏈dna

<213>人工序列

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gcaacgagtgagcgagatgag21

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<212>單鏈dna

<213>人工序列

<400>4

gccatgtcgctctggtatacg21