本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其是一種鑒定基因啟動子區(qū)相關轉(zhuǎn)錄因子基因的方法。

背景技術：

dna的轉(zhuǎn)錄除了需要rna聚合酶的作用外，還需要多種輔助因子。這些輔助因子稱為轉(zhuǎn)錄因子，能夠識別并結(jié)合dna的順式作用位點，從而調(diào)控目的基因在特定的時間與空間以特定的強度表達。因此，研究轉(zhuǎn)錄因子與啟動子之間的相互作用，對于了解啟動子的功能具有重要意義。目前鑒定啟動子和轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合的方法有酵母單雜交、染色質(zhì)免疫共沉淀法、電泳遷移率變動分析等方法；但以上方法相對操作比較復雜，需要較多的人力耗費和試劑、耗材花費。尋找一種簡單便捷、易于操作的鑒定啟動子和轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合的方法能很大程度的解決實驗問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供了一種鑒定基因啟動子區(qū)相關轉(zhuǎn)錄因子基因的方法，它能快速、準確的鑒定出轉(zhuǎn)錄因子基因是否為基因啟動子能啟動的轉(zhuǎn)錄因子。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：鑒定基因啟動子區(qū)相關轉(zhuǎn)錄因子基因的方法，以載體片段，待鑒定的基因啟動子的核心片段以及相關轉(zhuǎn)錄因子基因的cds區(qū)序列片段共同構(gòu)建啟動子-轉(zhuǎn)錄因子真核表達載體；將構(gòu)建的啟動子-轉(zhuǎn)錄因子真核表達載體通過轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞，觀察轉(zhuǎn)染的小鼠成纖維細胞中是否有綠色熒光信號，從而鑒定出該轉(zhuǎn)錄因子基因是否為基因啟動子能啟動的轉(zhuǎn)錄因子。

所述的啟動子-轉(zhuǎn)錄因子真核表達載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：

1)通過pcr擴增獲得載體-基因啟動子片段；

2)通過pcr擴增獲得轉(zhuǎn)錄因子基因cds區(qū)序列片段；

3)將載體-基因啟動子片段與轉(zhuǎn)錄因子基因cds區(qū)片段進行平末端連接；

4)將步驟3)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，篩選出陽性克隆子，測序驗證獲得重組載體。

步驟1)和步驟2)中pcr所用的擴增酶為高保真的dna聚合酶。

與現(xiàn)有的技術相比，本發(fā)明將擴增的轉(zhuǎn)錄因子基因片段與用高保真dna聚合酶擴增出的載體-啟動子片段進行平末端連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。這種方法能簡便精確獲得重組載體，具有不受任何酶切位點限制的優(yōu)勢，能準確的連接需要研究和驗證的相關轉(zhuǎn)錄因子基因片段，使實驗結(jié)果的準確性和便捷性增強，實驗結(jié)果更加可信。

附圖說明

圖1為關嶺牛血液dna提取；

圖2為關嶺牛組織rna提?。?/p>

圖3為myf5、myog基因擴增；

圖4為pegfp-n3-myod1-myf5重組載體單酶切及pegfp-n3-myod1-myog重組載體單酶切；

圖5為pegfp-n3-myod1-myf5、pegfp-n3-myod1-myog重組載體測序結(jié)果；

圖6為c2c12細胞培養(yǎng)圖；

圖7為pegfp-n3-myod1-myf5轉(zhuǎn)染細胞及pegfp-n3-myod1-myog轉(zhuǎn)染細胞；

圖8為本實施例的操作流程圖。

具體實施方式

本發(fā)明的實施例1：鑒定基因啟動子區(qū)相關轉(zhuǎn)錄因子基因的方法，具體如下：

一、菌株以及試劑的準備

菌株：大腸桿菌感受態(tài)細胞dh5α購自大連takara公司；

試劑來源：高保真的dna聚合酶、脂質(zhì)體2000購自美國invitrogen公司，dntpmix購自大連takara公司，t4dnaligase購自大連takara公司，dnamarker購自大連takara公司；胎牛血清、dmem高糖培養(yǎng)基、opti-mem、胰酶購gibco公司，c2c12細胞購自中科院上海細胞庫。

rna提取試劑盒購自omega公司，柱式質(zhì)粒dna小量抽提試劑盒，柱式dna膠回收試劑盒購自(axygen)，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(qiagen)。

其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

試劑配制：

kana(50mg/ml)：稱取ampicillin5g，加100ml超純水溶解，0.22μm過濾除菌后，按1ml/份分裝，-20℃保存。

lb液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，nacl1g，置于100ml三角瓶中，加入95ml超純水溶解，調(diào)ph值至7.0，加超純水至總體積為100ml，121℃高壓滅菌20min，冷卻至室溫，-4℃保存，臨用時加入抗生素，硫酸卡那霉素的工作濃度為50μg/ml。

lb固體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，nacl1g，，瓊脂1.5g置于100ml三角瓶中，加入95ml超純水溶解，調(diào)ph值至7.0，加超純水至總體積為100ml，高壓滅菌后冷卻至45℃左右，加入硫酸卡那霉素(50μg/ml)，搖勻后倒入培養(yǎng)皿。

10％細胞培養(yǎng)基：取50ml胎牛血清加入到450mldmem高糖培養(yǎng)基。

二、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.rna的提取及反轉(zhuǎn)錄實驗

做此實驗必須做好消毒滅菌的工作并戴好口罩和手套，防止rna和cdna被污染。

(1)從關嶺牛背最長肌中提取總rna，具體步驟如下：

a、取黃豆粒大小組織用剪刀剪碎放入研缽，加入液氮研成粉末，將組織粉末轉(zhuǎn)移至1.5ml的無酶ep管中。

b、加入1ml的rna-solv試劑，用移液槍輕輕地吹打混勻至細胞充分裂解。

c、將上述液體轉(zhuǎn)移到一個1.5ml無酶離心管中，室溫孵育3min。

d、加入0.2ml氯仿，在振蕩器上震蕩15s混勻。冰浴10min。

e、4℃、12000rpm/min離心15min。

f、轉(zhuǎn)移70％的上層液體至新的離心管中，添加1/3體積無水乙醇，渦旋震蕩15s。

g、吸取650μl的混合液體至吸附柱中，室溫10000rpm/min離心60s。棄濾液。

h、重復上一步驟繼續(xù)加入混合液，直到加完。

i、將吸附柱置于一個新的2ml的收集管中，加入300μl的rnawashbufferⅰ，室溫10000rpm/min離心60s，棄濾液。

j、再加入400μl的rnawashbufferⅰ，室溫10000rpm/min離心60s，并棄濾液。

k、添加rnawashbufferⅱ500μl，室溫10000rpm/min離心60s，棄濾液。重復此步驟。

l、空離，13000rpm/min空離2min。

m、將柱子放置于新的1.5ml離心管，加入40μldepc水洗脫，室溫放置2min，全速離心1min。

得到總rna。在紫外可見分光光度計下檢測后放置于-20℃冰箱中保存。

(2)cdna的合成，將獲得的rna稀釋至100ng/μl。具體步驟流程如下：

a、溶解所需的試劑。

b、添加試劑至總體積為13μ1。dntpmix(2.5mmeach)4μl；primermix，2μl；rnatemplate，2μl；rnase-freewater，5μl。

c、70℃孵育10min，冰浴2min。

d、之后短暫離心一會，使管壁上的液體全部回到管底。

e、繼續(xù)向以上反應液中加入以下的試劑，終濃度為1x的5xrtbuffer4μl；終濃度為10mm的dtt0.1m2μl。

f、用移液槍吹打混勻，42℃水浴2min。

g、加1μlhifiscript(200.u/pi)，輕輕拍打混勻，于42℃水浴鍋中孵育50min。

h、85℃孵育5min，短暫離心。

經(jīng)紫外可見分光光度計檢測dna濃度后放置于-20℃冰箱中保存待用。

2.反應結(jié)束后，取5μldna、rna產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(凝膠成像結(jié)果如圖1、2所示)

(1)加入1.0g的瓊脂糖至100mltae電泳緩沖液中

(2)微波爐中加熱使瓊脂糖完全溶解，溶液冷卻至60℃，加入goldview染料5.0μl，輕輕搖勻。

(3)倒膠，厚度為0.3～0.5cm，然后放置好梳子

(4)待膠冷卻后，輕輕拔掉梳子，置于電泳槽中，加電泳緩沖液至完全覆蓋膠面

(5)上樣，電泳，穩(wěn)壓100v，30～40min

(6)取出凝膠，在紫外燈下檢查凝膠，并用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

3.pcr擴增關嶺牛myf5、myog基因cds區(qū)序列引物

表1pcr擴增的引物信息

以獲得的關嶺牛組織cdna為模板進行pcr擴增。總反應體系為20μl，其中模板1μl，上、下游引物各1μl，5×pcrbuffer4μl，dntp1.6μl，高保真的dna聚合酶0.2μl，ddh2o補至20μl。擴增條件：98℃預變性3min；98℃變性10s、退火30s、72℃延伸，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。反應結(jié)束后，用1.0％瓊脂糖凝電泳檢測pcr產(chǎn)物，如圖2所示。

4.pegfp-n3-myod1載體質(zhì)粒的提取

質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提后用于后續(xù)實驗。提取方法如下：

(1)在含有硫酸卡那霉素的培養(yǎng)基中接種目標菌種，于37℃搖床充分震蕩培養(yǎng)12～16h。

(2)對于高拷貝的質(zhì)粒，去1.5～5ml菌液，于室溫，8000×g離心2min收集菌體，倒盡或者吸干培養(yǎng)基。

(3)在菌體沉淀中加入250μlbufferp1，吸打或震蕩至徹底懸浮菌體。如果使用visualyse，則在加入250μlp1后再加入1μlvisualyse，震蕩均勻。

(4)加入250μlbufferp2，立即溫和顛倒離心管5～10次混勻，室溫靜置2～4min。

(5)加入350μlbufferp3，立溫和顛倒離心管5～10次充分混勻。

(6)于離心管最大轉(zhuǎn)速(≥12000×g)離心5～10min，將上清全部小心移入吸附柱，9000×g離心30sec。倒掉收集管中液體，將吸附柱放入同一收集管中。

(7)在吸附柱中加入500μl去蛋白液bufferdw1，9000×g離心30sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

(8)向吸附柱中加入500μlwashsolution，9000×g離心30sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

(9)重復步驟8一次。

(10)將空吸附柱和收集管放入離心機，9000×g離心1min。

(11)在吸附膜中央加入50～100μlelutionbuffer，室溫靜置1～2min，9000×g離心1min。將所得到的dna溶液至于-20℃保存或用于后續(xù)實驗。

(12)然后用1.0％瓊脂糖凝電泳檢測pcr產(chǎn)物。

5.pcr擴增含myod1基因啟動子區(qū)的pegfp-n3載體片段

以pegfp-n3-myod1質(zhì)粒為模板進行pcr擴增?？偡磻w系為20μl，其中模板1μl，上、下游引物各1μl，5×pcrbuffer4μl，dntp1.6μl，高保真的dna聚合酶0.2μl，ddh2o補至20μl。擴增條件：98℃預變性3min；98℃變性10s、59℃退火30s、72℃延伸2min，10個循環(huán)；98℃變性10s、60℃退火30s、72℃延伸2min，25個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。反應結(jié)束后，用1.0％瓊脂糖凝電泳檢測pcr產(chǎn)物。

6.dna膠回收試劑盒回收pcr產(chǎn)物

(1)通過瓊脂糖凝膠電泳盡可能將目的dna片段與其它片段分開，用干凈的手術刀片將含目的dna片段的瓊脂糖凝膠塊切下，放入1.5ml離心管中，稱重。

(2)按每100mg瓊脂糖中加入300～600μl的溶膠液bufferb2，充分混勻。

(3)將離心管置于50℃水浴5～10min，間或混勻，直至膠塊完全熔化，將融化好的溶液全部轉(zhuǎn)移至吸附柱中，8000×g室溫離心30sec，倒掉收集管中的液體將吸附柱放入同一個收集管中。

(4)將吸附柱中加入500μlwashsolution，9000×g室溫離心30sec，倒掉收集管中的液體將吸附柱放入同一個收集管中。

(5)重復步驟(4)一次。

(6)將空吸附柱和收集管放入離心機9000×g離心1min，除去殘留的漂洗液，將吸附柱室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液。

(6)取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，向吸附柱中間部分滴加15～40μlddh2o，室溫靜置1～2min。9000×g室溫離心1分鐘洗脫dna，收集管中溶液，將所得到的dna溶液置于-20℃保存或用于后續(xù)試驗。

7.將pegfp-n3-myod1基因啟動子片段分別與myf5、myog基因片段進行平末端連接

酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化，通過t4dnaligase進行連接，連接體系：

混勻反應液，16℃連接過夜。

8.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5α菌株

轉(zhuǎn)化的步驟如下：

(1)取100μl感受態(tài)細胞，置于冰上，3～5min至剛剛?cè)诨?/p>

(2)將上述的連接液全部加入感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，甩下冰上放置30min。

(3)42℃水浴熱激90sec，迅速冰上放置15～20min。

(4)加入37℃預熱的600μllb培養(yǎng)基，混勻后37℃200～250rpm振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞恢復正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗硫酸卡那霉素抗性基因。

(5)室溫下4000rpm離心5min，用槍頭吸掉450μl上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細胞懸浮。

(6)將細菌涂布在預先用硫酸卡那霉素涂布的lb固體培養(yǎng)基上。

(7)平板在37℃下正向放置1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。

9.重組質(zhì)粒的篩選

挑去平板上的單菌落進行菌落pcr，菌落pcr的體系為總反應體系為20μl，其中菌液1μl，擴增myodi啟動子片段的上、下游引物各1μl，5×pcrbuffer4μl，dntp1.6μl，高保真的dna聚合酶0.2μl，ddh2o補至20μl。擴增條件如前面介紹的擴增myodi啟動子片段的條件。挑取能pcr出正確目的條帶的菌落接種到含有硫酸卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。然后用質(zhì)粒dna抽提試劑盒提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ酶切驗證連接是否正確。

10.將驗證得到的質(zhì)粒送測序公司測序(如圖5所示)

11.將構(gòu)建好的pegfp-n3-myod1-myf5、pegfp-n3-myod1-myog重組質(zhì)粒進行無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取，步驟如下：

(1)取5ml已轉(zhuǎn)化目的載體的菌液于10ml離心管中1000rmp離心1min。

(2)去上清加入250μlsolutioni/rnaasea重懸菌體。

(3)加入250μlsolutionii到菌液中，輕輕地上下顛倒離心管幾次，使液體混勻，室溫孵育2min。

(4)加入125μl預冷的buffern3于混合液中，輕輕地上下顛倒離心管幾次，使液體混勻，12000rmp4℃離心10min。

(5)將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，向其中加入0.1倍體積的etrsolution,輕輕地上下顛倒幾次離心管，混勻后冰浴10min。

(6)冰浴結(jié)束后42℃水浴5min，12000rmp室溫離心3min。

(7)吸取上清，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，并向其中加入0.5倍體積的無水乙醇，上下顛倒幾次混勻液體，室溫孵育2min。

(8)將混勻好的液體轉(zhuǎn)移至放有hibindtmdnaminicolumn的2ml離心管中，1000rmp室溫離心1min。

(9)棄去下層收集管中的液體，向吸附柱中加入500μlbufferhb，1000rmp室溫離心1min。

(10)棄去下層收集管中的液體，向吸附柱中加入700μl含有無水乙醇的washbuffer，1000rmp室溫離心1min。

(11)重復第10步。

(12)棄去管中的液體將吸附柱13000rmp離心3min，此步驟的目的是除凈殘留的乙醇。

(13)將吸附有質(zhì)粒dna的吸附柱置于一個新的無菌1.5ml離心管中，向柱中心加入30-50μlendotoxin-freeelutionbuffer，13000rmp離心1min收集質(zhì)粒dna。

12.pegfp-n3-myod1-myf5、pegfp-n3-myod1-myog無內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染c2c12細胞，步驟如下：、

將c2c12細胞按1×10⁵/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，加dmem高糖培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，100l/ml卡那霉素，100l/ml氨芐霉素)500l，37℃、5％co2培養(yǎng)至細胞融合度為80％左右。將前期成功構(gòu)建的pegfp-n3-myod1-myf5、pegfp-n3-myod1-myog載體分別轉(zhuǎn)染c2c12細胞。各轉(zhuǎn)染組每孔載體用量為1g，脂質(zhì)體用量為1μl，載體和脂質(zhì)體分別用無血清的opti-mem稀釋(24孔板用50μl稀釋)，轉(zhuǎn)染24h后熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過熒光顯微鏡觀察到綠色熒光信號。實驗結(jié)果證明，myf5、myog基因為myod1基因啟動子的相互結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。

本發(fā)明的實施例2：鑒定基因啟動子區(qū)相關轉(zhuǎn)錄因子基因的方法，實驗方法及流程同實施例，驗證myod1基因啟動子與轉(zhuǎn)錄因子sp1基因，構(gòu)建獲得pegfp-n3-myod1-sp1重組表達載體，篩選出陽性克隆子、測序驗證，將正確載體轉(zhuǎn)染c2c12細胞，通過熒光顯微鏡未觀察到綠色熒光信號。實驗結(jié)果證明，sp1基因不是與myod1基因啟動子的相互結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。