專利名稱：包含具重組轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的嵌合啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
A)引言基因轉(zhuǎn)錄由激活序列(啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)控制。這些激活序列代表轉(zhuǎn)錄因子可與之結(jié)合從而安排相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。
現(xiàn)在已知大量的激活序列，作為啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列。
根據(jù)其功能或來(lái)源，它們可被分為通用的激活序列，即在任何細(xì)胞中都有效的激活序列，病毒來(lái)源的激活序列，和具有限制性作用的激活序列。
這種限制可能是，例如，細(xì)胞特異的、代謝(例如在低含氧量條件下)或細(xì)胞周期特異的。
例如在用于基因治療的結(jié)構(gòu)基因直接表達(dá)方面研究了關(guān)于激活序列功能的這些限制。因此，將結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)置于細(xì)胞特異性啟動(dòng)子控制下是一種常用的技術(shù)(Sikora，生物技術(shù)趨勢(shì)(Trends Biotech.)11,197(1993))。
然而在許多情況中，不足以用細(xì)胞特異性啟動(dòng)子限制效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，這一部分是由于細(xì)胞特異性啟動(dòng)子激活的細(xì)胞特異性不夠，部分由于效應(yīng)基因的表達(dá)只在處于特定功能狀態(tài)的所選細(xì)胞型的細(xì)胞中是希望的。例如，這種功能狀態(tài)可能是細(xì)胞的細(xì)胞周期階段。
因此，為了更廣泛地調(diào)節(jié)效應(yīng)基因的表達(dá)，希望使用具有不同特異性的多種啟動(dòng)子控制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
發(fā)展了嵌合啟動(dòng)子技術(shù)(例如，專利申請(qǐng)PCT/GB95/02000,EP-A0790313)，用于將任一特異性的啟動(dòng)子與細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子相結(jié)合。該技術(shù)包括將任一特異性的上游啟動(dòng)子與下游CDE-CHR元件或E2FBS-CHR元件連接。
細(xì)胞分裂分為G0或G1、S、G2和M期的連續(xù)階段。S期是DNA合成期，隨后是G2過(guò)渡期(G2期)，隨后是有絲分裂期(M期)，在此母細(xì)胞分裂為兩個(gè)子細(xì)胞。在M期和S期之間是G0靜止期(G0期)或G1過(guò)渡期(G1期)。
細(xì)胞分裂由一組蛋白激酶-細(xì)胞周期蛋白/cdk復(fù)合體驅(qū)動(dòng)。其由催化亞基[細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶(cdk，例如cdk-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7或-8)和調(diào)節(jié)亞基、細(xì)胞周期蛋白(例如細(xì)胞周期蛋白A、-B1-B3、-D1-D3、-E、-H或-C)]組成。
不同cdk復(fù)合體在每個(gè)不同細(xì)胞周期階段中特別有活性，如G1中期cdk4/細(xì)胞周期蛋白D1-3和cdk6/細(xì)胞周期蛋白D1-3G1晚期cdk2/細(xì)胞周期蛋白ES期 cdk2/細(xì)胞周期蛋白AG2/M過(guò)渡期cdk1/細(xì)胞周期蛋白B1-3和cdk1/細(xì)胞周期蛋白A細(xì)胞周期蛋白/cdk復(fù)合體的活性在于在控制DNA合成和有絲分裂中起直接或間接作用的蛋白質(zhì)的磷酸化及激活或滅活。
對(duì)應(yīng)于其在細(xì)胞周期中的功能，某些細(xì)胞周期蛋白和cdk的基因周期性地轉(zhuǎn)錄和/或周期性地被激活或抑制，例如這是由于細(xì)胞周期蛋白受控降解，由于抑制劑(例如p161NK4A、p151INK4B、p21Cip1、p27Kip1、p181NK4C、p191NK4D、p57)的細(xì)胞周期階段特異的結(jié)合，或由于激活酶(例如，cdc25磷酸酶，如cdc25A、cdc25B和cdc25C或cdk7/細(xì)胞周期蛋白H)或抑制酶(例如wee1激酶)的修飾(見(jiàn)Zwicker和Muller，細(xì)胞周期研究進(jìn)展(Progr.Cell Cycle Res.)91(1995)；La Thangue,現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)觀點(diǎn)(Curr Opin.Cell Biol.)433(1994)；MacLachlan等人，真核生物基因表達(dá)評(píng)述(Crit.Rev.Eukaryotic Gene Expr.)127(1995)的綜述)。
cdc25C在細(xì)胞周期G2期的周期性表達(dá)基本上由cdc25C基因的啟動(dòng)子區(qū)中的元件(CDE-CHR)控制。該CDE-CHR元件在G0/G1期為阻抑蛋白所擁有，在G2期游離。該啟動(dòng)子元件的核苷酸序列已經(jīng)鑒定，并且同樣也在細(xì)胞周期蛋白A和cdk-1基因的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)，而在B-myb啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的核苷酸序列在(E2FBS-CHR)部分不同。對(duì)這些啟動(dòng)子元件細(xì)胞周期依賴的功能的研究證明，其在G0/G1期的阻斷之后是所述基因轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)，對(duì)于B-myb基因的情況中這發(fā)生得特別早(在G1中期)，對(duì)于細(xì)胞周期蛋白A，這發(fā)生于G1/S過(guò)渡期，對(duì)于cdk-1基因發(fā)生于S期，對(duì)于cdc25C基因只發(fā)生于S晚期(Zwicker和Muller，細(xì)胞周期研究進(jìn)展91(1995)；Lucibello等人，EMBO J.132(1995)；Liu等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)2905(1995)；Zwicker等人，核酸研究3822(1995)；EMBOJ.4514(1995))。
已驚訝地發(fā)現(xiàn)，(細(xì)胞周期蛋白25C、細(xì)胞周期蛋白A和cdk-1基因的啟動(dòng)子的)CDE-CHR元件和(B-myb基因的啟動(dòng)子的)E2FBS-CHR元件不僅能抑制同源基因在G0/G1期的激活和轉(zhuǎn)錄，而且能抑制其他基因的激活和轉(zhuǎn)錄。該發(fā)明導(dǎo)致了專利申請(qǐng)PCT/GB95/02000、EP-A0777739、EP-A0777740、EP-A0804601、EP-A0807183、EP-A0790313和EP-A0860445。
這些專利申請(qǐng)公開(kāi)了細(xì)胞周期依賴性啟動(dòng)子與非特異性、細(xì)胞特異性、病毒特異性或可代謝激活的啟動(dòng)子的組合，用于調(diào)節(jié)激活編碼可預(yù)防和/或治療疾病的蛋白質(zhì)的效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這些疾病的實(shí)例可以是，腫瘤疾病、白血病、自身免疫病、不同類型的關(guān)節(jié)炎、變態(tài)反應(yīng)、炎癥、移植器官排斥、血液循環(huán)系統(tǒng)疾病、血凝系統(tǒng)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染或損傷。
研究了所謂的嵌合啟動(dòng)子，用于將不同啟動(dòng)子與細(xì)胞周期特異性元件組合起來(lái)。在嵌合啟動(dòng)子中，位于直接下游的啟動(dòng)子元件CDE-CHR或E2FBS-CHR對(duì)非特異性、細(xì)胞特異性、病毒特異性或可代謝激活的激活序列(或啟動(dòng)子序列)的活性主要局限于細(xì)胞周期S期和G2期。
尤其對(duì)啟動(dòng)子元件CDE-CHR功能的深入研究表明，由于CDE-CHR元件而使細(xì)胞周期依賴性的上游激活序列的調(diào)節(jié)主要依賴于富含谷氨酰胺激活結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子激活序列的激活(Zwicker等人，核酸研究3822(1995))。
這些轉(zhuǎn)錄因子包括，例如，Oct-2、Sp1和NF-Y。
因此，這限制了啟動(dòng)子元件CDE-CHR用于嵌合啟動(dòng)子的用途。對(duì)于B-myb基因的啟動(dòng)子元件E2F-BS-CHB也可以有相同的假設(shè)(Zwicker等人，核酸研究23,3822(1995))因此迫切需要一種表達(dá)系統(tǒng)，其中任一啟動(dòng)子能與細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子組合。
B)發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種核酸構(gòu)建體，其中任一啟動(dòng)子能與CDE-CHR元件或E2FBS-CHR元件連接，產(chǎn)生一種功能性嵌合啟動(dòng)子，并且它含有下列組分組分a)至少一種啟動(dòng)子組分b)編碼至少一種重組反式激活蛋白的DNA，其表達(dá)由組分a)激活，且含有b1)編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNAb2)編碼富含谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸的反式激活結(jié)構(gòu)域的DNA。
組分c)至少一種可結(jié)合組分b)的表達(dá)產(chǎn)物的DNA序列組分d)至少一種最小啟動(dòng)子，其含有CDE-CHR元件或E2FBS-CHR元件，其5’端與組分c)的3’端結(jié)合。
組分e)至少一種效應(yīng)基因，其轉(zhuǎn)錄由與組分c)結(jié)合的組分b)的表達(dá)產(chǎn)物激活。
通過(guò)實(shí)施例在

圖1中顯示了各組分的排列。
組分d)的最小啟動(dòng)子含有至少一種轉(zhuǎn)錄激活元件。
根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的功能，使得細(xì)胞特異性、代謝可激活的、病毒特異性、細(xì)胞周期特異性或可普遍激活的啟動(dòng)子[組分a)]的激活導(dǎo)致重組轉(zhuǎn)錄激活物的基因[組分b)]的轉(zhuǎn)錄，其隨后與其DNA結(jié)合序列[組分c)]結(jié)合，從而激活含有最小CDE-CHR的啟動(dòng)子[組分d)]，由此安排效應(yīng)基因[組分e)]的轉(zhuǎn)錄。
在細(xì)胞周期的G0/G1期，組分d)的CDE-CHR元件由于結(jié)合所謂的CDF蛋白而被阻斷，從而抑制組分e)轉(zhuǎn)錄的激活。
根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體能以多種方式延伸-能將幾種相同或不同的效應(yīng)基因[組分e、e’、e”]引入核酸構(gòu)建體，這些效應(yīng)基因或者通過(guò)IRES序列彼此連接，或者含有添加到每種效應(yīng)基因上游的組分c)和d)。
-可將組分c)以這樣的方式添加到組分a)上游，使得組分b)表達(dá)的重組反式激活蛋白在自體增強(qiáng)(self-enhencing)啟動(dòng)子的意義上也使組分a)的激活增強(qiáng)。
例如，這些表達(dá)系統(tǒng)顯示于圖2/Ⅰ中。
在專利申請(qǐng)EP-A0848061中已經(jīng)詳述了這些自體增強(qiáng)啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，自體增強(qiáng)的啟動(dòng)子系統(tǒng)也可以被添加到如圖2/Ⅱ所示的根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中。
-組分b)的延伸方法包括，引入表達(dá)可與偶聯(lián)物[組分f]]結(jié)合的蛋白A的組分b3)，且引入表達(dá)也可與偶聯(lián)物f)結(jié)合的蛋白B的組分b4)，產(chǎn)生一種能被偶聯(lián)物f)控制(即藥理學(xué)控制)的重組反式激活蛋白[組分b’)]。
例如，圖3顯示了這種延伸。
這種反式激活蛋白的引入使根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)可被藥理學(xué)控制。在專利申請(qǐng)EP-A0848061中已經(jīng)詳述了這類表達(dá)系統(tǒng)。
-另一種孕酮誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)來(lái)源于組分b)和/或組分f)與孕酮受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的組合(Wang等人，基因治療(Gene Therapy)4,432(1997))。
-通過(guò)向組分b1)和b2)之間或之中引入細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合蛋白[組分b5]]的核酸序列[組分b”包括組分b1]、b2]和b5]]，能另外控制該表達(dá)系統(tǒng)。這種另外的控制的起因是調(diào)節(jié)蛋白附著于正常細(xì)胞中的結(jié)合蛋白，從而阻斷組分b”)表達(dá)的重組反式激活蛋白的功能，也就是說(shuō)，該反式激活蛋白與組分c)的結(jié)合。在如下細(xì)胞中，即細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白被突變，因此不能附著于結(jié)合蛋白，或者調(diào)節(jié)蛋白減少、缺乏或與組分b5)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞、病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)結(jié)合蛋白的細(xì)胞中，重組反式激活蛋白[組分b”)]具功能性并且能與組分c)結(jié)合。
通過(guò)實(shí)施例在圖4中顯示了組分b”)。
-向組分b)、b’)或b”)中引入核定位信號(hào)，使根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的可操作性提高。
-通過(guò)組合兩種或多種上述延伸。
效應(yīng)基因[組分d)]編碼一種藥理學(xué)活性成分，其選自細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、抗體或抗體片段、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的受體、具有抗增殖、凋亡或細(xì)胞抑制作用的蛋白質(zhì)、血管生成抑制劑、凝固抑制劑、血栓誘導(dǎo)物和凝固抑制劑、纖維蛋白溶解活性物質(zhì)、血漿蛋白、補(bǔ)體激活蛋白、肽激素、病毒外殼蛋白、細(xì)菌抗原和寄生蟲(chóng)抗原、以及可影響血液循環(huán)的蛋白質(zhì)和核酶。
優(yōu)選地，效應(yīng)基因編碼一種核酶，該酶可滅活編碼一種蛋白質(zhì)的mRNA，該蛋白質(zhì)選自細(xì)胞周期控制蛋白，特別是細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E、E2F1-5、cdc2、cdc25C或DP1、或病毒蛋白、或細(xì)胞因子、或生長(zhǎng)因子或這些蛋白的受體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)基因編碼一種可將前體藥物切割為藥劑的酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)基因可編碼一種配體效應(yīng)物融合蛋白，配體可以是抗體、抗體片段、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、粘附分子或肽激素，效應(yīng)物可以是如上所述的藥理活性成分或酶。例如，結(jié)構(gòu)基因可編碼一種配體酶融合蛋白，其中酶可將前體藥物切割為藥物，配體可結(jié)合于細(xì)胞表面，優(yōu)選地內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的表面。
該核酸構(gòu)建體優(yōu)選地包含DNA。術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體可認(rèn)為是指能在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的人工核酸結(jié)構(gòu)。它們優(yōu)選地插入一種載體中，質(zhì)粒載體或病毒載體是特別優(yōu)選的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將這些載體對(duì)患者外部或內(nèi)部、局部地施用入體腔、器官、血液循環(huán)、呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道，或肌內(nèi)或皮下施用。
根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可使效應(yīng)基因[組分e]]細(xì)胞特異地、病毒特異地、在一定代謝條件下和/或細(xì)胞周期特異地表達(dá)，該效應(yīng)基因優(yōu)選地是一種編碼藥理學(xué)活性成分或可將無(wú)活性前體藥物切割為活性藥物的酶的基因?？蛇x擇效應(yīng)基因，使得藥理學(xué)活性成分或酶表達(dá)為一種與配體在一起的融合蛋白，該配體可結(jié)合于細(xì)胞(如增殖的內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)的表面。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是含有根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，將核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞系中，其在轉(zhuǎn)染后能用于表達(dá)該轉(zhuǎn)基因。這些細(xì)胞因此能用于為患者提供藥物。根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的優(yōu)選用途在于治療疾病，由此提供藥物包括向靶細(xì)胞中引入核酸構(gòu)建體及其病毒或靶細(xì)胞特異的或代謝特異的或非特異的和細(xì)胞周期特異的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及含有根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的施用，用于制備治療疾病的藥物。例如，可用根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在體外轉(zhuǎn)染從血液中獲得的內(nèi)皮細(xì)胞，并且例如靜脈注射患者。
也可將這些體外轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的載體一起施用于患者。這種組合在于，在每種情況下，細(xì)胞和載體同時(shí)或在不同時(shí)間施用或注射于相同或不同的部位。
根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體不以這種形式天然存在，即，活性成分或酶或配體效應(yīng)物融合蛋白的效應(yīng)基因不與根據(jù)本發(fā)明的最小啟動(dòng)子自然結(jié)合，該啟動(dòng)子含有CDE-CHR元件或E2FBS-CHR元件，且具有對(duì)重組反式激活蛋白的DNA結(jié)合序列。
選擇根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的啟動(dòng)子和活性成分(或酶)的效應(yīng)基因，以適合目的用途。C)根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體組分詳述
Ⅰ)啟動(dòng)子[組分a)]用于本發(fā)明目的之啟動(dòng)子序列是在結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子后激活3’端相鄰的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。欲與含CDE-CHR或含E2FBS-CHR啟動(dòng)子序列[組分d)]結(jié)合的啟動(dòng)子序列的選擇取決于欲治療的疾病和欲轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞。因此，另一啟動(dòng)子序列可被普遍地、靶細(xì)胞特異地、在特定代謝條件下、細(xì)胞周期特異地或病毒特異地激活。將選擇的啟動(dòng)子序列包括，例如a)可普遍激活的啟動(dòng)子和激活序列，例如，-RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子-RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子-CMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子-SV40啟動(dòng)子和增強(qiáng)子b)病毒啟動(dòng)子和激活序列，例如，-HBV-HCV-HSV-HPV-EBV-HTLV-HIV當(dāng)使用HIV啟動(dòng)子時(shí)，所有LTR序列包括TAR序列[位點(diǎn)<-453->-80,Rosen等人，細(xì)胞(Cdll)41,813(1985)]被用作病毒特異性啟動(dòng)子。
c)可代謝激活的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，如低氧誘導(dǎo)型增強(qiáng)子(Semenza等人，PNAS 88,5680(1991)；McBurney等人，核酸研究19,5755(1991))或輻射誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如egr-1啟動(dòng)子電離輻射誘導(dǎo)元件(Hallahan等人，自然雜志醫(yī)藥分冊(cè)(Nature Med.)1,786(1995))。
d)細(xì)胞周期特異激活的啟動(dòng)子。例如，cdc25C基因、細(xì)胞周期蛋白A基因、cdc2(cdk-1)基因、Bmyb基因、DHFR基因或E2F-1基因的啟動(dòng)子，或在細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)生或被激活的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列。這些結(jié)合序列包括核苷酸序列[5’-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3’；SEQ ID NO:1；Blackwood和Eisenmann，科學(xué)(Science)251,1211(1991)]的單體或多聚體，該序列也被稱為Myc E盒。
e)四環(huán)素激活的啟動(dòng)子，如與適當(dāng)阻抑蛋白結(jié)合的四環(huán)素操縱子。
f)細(xì)胞特異激活的啟動(dòng)子優(yōu)選地包括這樣的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的激活序列，其來(lái)自編碼在所選細(xì)胞中優(yōu)先形成的蛋白質(zhì)的基因。
例如，對(duì)于本發(fā)明，在下列細(xì)胞中優(yōu)選地使用下列蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子f1)在內(nèi)皮細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子和激活序列-腦特異的內(nèi)皮葡萄糖-1-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-endoglin-VEGF受體-1(flt-1)-VEGF受體-2(flt-1,KDR)-VEGF受體-3(flt-4)-tie-1或tie-2-B61受體(Eck受體)-B61-內(nèi)皮縮血管肽，特別是內(nèi)皮縮血管肽B或內(nèi)皮縮血管肽-1-內(nèi)皮縮血管肽受體，特別是內(nèi)皮縮血管肽B受體-甘露糖-6磷酸受體-von Willebrand因子-PECAM-1-ICAM-3-IL-1α,IL-1β-IL-1受體-血管細(xì)胞粘附分子(VCAM-1)-合成的激活序列包含轉(zhuǎn)錄因子寡聚結(jié)合位點(diǎn)的合成激活序列，其在內(nèi)皮細(xì)胞中有優(yōu)先或選擇性的活性，也可用作備擇的或天然的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。一個(gè)實(shí)例是轉(zhuǎn)錄因子GATA-2，其結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)皮縮血管肽-1基因5’-TTATCT-3’中[Lee等人，生物化學(xué)(Bio.Chem.)266,16188(1991),Dormann等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)267,1279(1992)和Wilson等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell Biol.)10,4854(1990)]。
f2)在與激活的內(nèi)皮細(xì)胞鄰近的細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子或激活序列-VEGFVEGF基因的基因調(diào)節(jié)序列是5’制翼區(qū)、3’-側(cè)翼區(qū)、c-Src基因或v-Src基因-類固醇激素受體及其啟動(dòng)子元件(Truss和Beato，內(nèi)分泌綜述(Endocr.Rev.)14,459(1993))，特別是小鼠乳腺癌病毒啟動(dòng)子f3)在肌細(xì)胞尤其是平滑肌細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子或激活序列-原肌球蛋白-α-肌動(dòng)蛋白-α-肌球蛋白-PDGF受體-FGF受體-MRF-4-果糖磷酸激酶A-磷酸甘油酸變位酶-肌鈣蛋白C-肌漿蛋白-內(nèi)皮縮血管肽A受體-橋粒蛋白-VEGF在“與激活的內(nèi)皮細(xì)胞鄰近的細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子”部分中已經(jīng)描述了VEGF基因的基因調(diào)節(jié)序列(見(jiàn)上)-“人工”啟動(dòng)子螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)家族的因子(MyoD、Myf-5、肌漿蛋白、MRF4)被描述為肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子。肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子還包括鋅指蛋白GATA-4。
無(wú)論使用肌肉特異的基因還是在異源環(huán)境中，HLH蛋白和GATA-4都顯示肌肉特異的轉(zhuǎn)錄，因此用人工啟動(dòng)子也是如此。這些人工啟動(dòng)子包括，例如，多拷貝的肌肉特異性HLH蛋白(DNA)結(jié)合位點(diǎn)，如E盒(Myo D)(例如4×AGCAGGTGTTGGGAGGC,SEQ ID NO:2)；或多拷貝的α-肌球蛋白重鏈基因GATA-4 DNA結(jié)合位點(diǎn)(例如5’-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3’,SEQIDNO:3)f4)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子和激活序列尤其包括，例如，編碼下列蛋白質(zhì)的基因的基因調(diào)節(jié)序列或元件-神經(jīng)膜細(xì)胞特異的蛋白質(zhì)periaxin-谷氨酰胺合成酶-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異的蛋白質(zhì)(膠質(zhì)原纖維酸性蛋白=GFAP)-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞蛋白S100b-IL-6(CNTF)-5-HT受體-TNFα-IL-10-胰島素樣生長(zhǎng)因子受體Ⅰ和Ⅱ-VEGF上面已描述了VEGF基因的基因調(diào)節(jié)序列。
f5)在造血細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子和激活序列。
這些基因調(diào)節(jié)序列包括在造血細(xì)胞或相鄰細(xì)胞如基質(zhì)中表達(dá)的細(xì)胞因子或其受體的基因的啟動(dòng)子序列。
例如，包括下列細(xì)胞因子及其受體的啟動(dòng)子序列-干細(xì)胞因子受體-干細(xì)胞因子
-IL-1α-IL-1受體-IL-3-IL-3受體(α亞基)-IL-3受體(β亞基)-IL-6-IL-6受體-GM-CSF-GM-CSF受體(α鏈)-干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)IRF-1的啟動(dòng)子可被IL-6和IFNγ或IFNβ同樣激活-促紅細(xì)胞生成素-促紅細(xì)胞生成素受體。
f6)在淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子和激活序列其包括，例如，細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體和粘附分子和抗體Fc片段受體的基因的啟動(dòng)子和激活序列。
它們包括，例如，-IL-1受體-IL-1α-IL-1β-IL-2-IL-2受體-IL-3-IL-3受體(α亞基)-IL-3受體(β亞基)-IL-4-IL-4受體-IL-5-IL-6
-IL-6受體-干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)(IRF-1的啟動(dòng)子可被IL-6和IFNγ或IFNβ同樣激活)。
-IFNγ反應(yīng)啟動(dòng)子-IL-7-IL-8-IL-10-IL-11-IFNγ-GM-CSF-GM-CSF受體(α鏈)-IL-13-LIF-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)受體-Ⅰ型和Ⅱ型巨噬細(xì)胞清除劑受體-MAC-1(白細(xì)胞功能抗原)-LFA-1α(白細(xì)胞功能抗原)-p150，95(白細(xì)胞功能抗原)f7)在滑膜細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子和激活序列包括例如下列的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的啟動(dòng)子序列-MMP-1(間質(zhì)膠原酶)-MMP-3(溶基質(zhì)素/transin)還包括金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的啟動(dòng)子序列，例如-TIMP-1-TIMP-2-TIMP-3f8)在白血病細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子和激活序列包括例如下列的啟動(dòng)子-c-myc
-HSP-70-bcl-1/細(xì)胞周期蛋白D-1-bcl-2-IL-6-IL-10-TNFα,TNFβ-HOX-11-BCR-Abl-E2A-PBX-1-PML-RARA(早幼粒細(xì)胞白血病-視黃酸受體)-c-myc-c-myc蛋白，其可結(jié)合并激活核苷酸序列(5’-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3’,SEQ ID NO:1)的多聚體，該序列也被稱為Myc E盒f9)在腫瘤細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子或激活序列構(gòu)思了與在腫瘤細(xì)胞中形成或有活性的轉(zhuǎn)錄因子相互作用的基因調(diào)節(jié)核苷酸序列，作為啟動(dòng)子或激活序列。
用于本發(fā)明的優(yōu)選啟動(dòng)子或激活序列包括編碼尤其在癌細(xì)胞或肉瘤細(xì)胞中形成的蛋白質(zhì)之基因的基因調(diào)節(jié)序列或元件。因此，N-CAM蛋白的啟動(dòng)子優(yōu)選地用于小細(xì)胞支氣管癌，肝炎生長(zhǎng)因子受體或L-絲束蛋白的啟動(dòng)子用于卵巢癌，L-絲束蛋白或多態(tài)性上皮粘蛋白(PEM)的啟動(dòng)子優(yōu)選地用于胰腺癌。
Ⅱ)重組反式激活蛋白[組分b)]在最簡(jiǎn)單地情況下，重組反式激活蛋白包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[組分b1]]和富含谷氨酰胺、絲氨酸和/或蘇氨酸的反式激活結(jié)構(gòu)域[組分b2]]。
對(duì)于藥理學(xué)可控制的重組反式激活蛋白[組分b’)]，為偶聯(lián)物-結(jié)合蛋白引入組分b3)和b4)，對(duì)于癌基因或病毒控制的重組反式激活蛋白[組分b”]]，為調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合蛋白引入組分b5)。
通過(guò)引入核定位信號(hào)(NLS)能提高組分b)、b’)或b”)的操作性。SV40的NLS(Dingwall等人，TIBS 16,478(1991))是可使用的NLS的一個(gè)實(shí)例。
1)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[組分b1)]DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域代表至少下列一種序列-Gal4蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的cDNA序列(氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，分子細(xì)胞生物學(xué)10，2916(1990))或-LexA蛋白(氨基酸1-81；Kim等人，科學(xué)255,203(1992))或完整LexA蛋白(氨基酸1-202；Brent等人，細(xì)胞43,729(1985))的序列，或-lac阻抑(lacⅠ)蛋白的序列(Brown等人，細(xì)胞49,603(1987)；Fuerst等人，PNAS USA 86,2549(1989))或-四環(huán)素阻抑(tet-R)蛋白的序列(Gossen等人，PNAS USA 89,5547(1992)；Dingermann等人，EMBOJ.11,1487(1992))或-ZFHD1蛋白的序列(Pomerantz等人，科學(xué)267,93(1995))。
2)反式激活結(jié)構(gòu)域[組分b2)]用于本發(fā)明的DNA是富含谷氨酰胺、絲氨酸和/或蘇氨酸的反式激活結(jié)構(gòu)域的DNA。
對(duì)于本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)富含是指反式激活結(jié)構(gòu)域含有總共至少20×谷氨酰胺(=至少20個(gè)谷氨酰胺殘基)至少10×絲氨酸和/或至少10×蘇氨酸對(duì)于本發(fā)明，這些反式激活結(jié)構(gòu)域包括，例如-Oct-2的激活結(jié)構(gòu)域(氨基酸438-479；Tanaka等人，分子細(xì)胞生物學(xué)14,6064(1994)或氨基酸3-154；Das等人，自然374,657(1995))或-SP1的激活結(jié)構(gòu)域(氨基酸340-485；Courey和Tijan，細(xì)胞55,887(1988))或-NFY-1A的激活結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-132或1-233；Li等人，生物化學(xué)雜志267,8984(1992)；van Hujisduijnen等人，EMBO J.9,3119(1990)；Sinha等人，生物化學(xué)雜志92,1624(1995)；Coustry等人，生物化學(xué)雜志270,468(1995))或3)偶聯(lián)物[組分f)]結(jié)合蛋白A[組分b3)]和B[組分b4)]在專利申請(qǐng)EP-A0848061中已經(jīng)詳述了偶聯(lián)物和相應(yīng)蛋白A和蛋白B的實(shí)例，在此引用作為參考。
這些蛋白A和蛋白B包括，例如-對(duì)于偶聯(lián)物納巴霉素或納巴霉素類似物●FK506結(jié)合蛋白(FKBP)●可與納巴霉素FKBP復(fù)合體結(jié)合的FKBP-納巴霉素相關(guān)蛋白，或其可與納巴霉素-FKBP復(fù)合體(FRAP)結(jié)合的亞序列●能使用可與納巴霉素結(jié)合和/或可抑制FKBP或FRAP與納巴霉素結(jié)合的rec.Fv的基因，代替使用FKBP和FRAP的基因-對(duì)于偶聯(lián)物FK506的二聚體(FK1012)●FK506結(jié)合蛋白(FKBP)●可與FK506復(fù)合體結(jié)合的鈣調(diào)磷酸酶或其亞序列●能插入可抑制FK506與鈣調(diào)磷酸酶結(jié)合的rec.Fv的基因，代替鈣調(diào)磷酸酶的基因-對(duì)于偶聯(lián)物環(huán)孢素A的二聚體●親環(huán)蛋白●可與環(huán)孢素A/親環(huán)蛋白復(fù)合體結(jié)合的鈣調(diào)磷酸酶或其亞序列●能引入可抑制環(huán)孢素A與親環(huán)蛋白結(jié)合的rec.Fv的基因，代替親環(huán)蛋白的基因-對(duì)于偶聯(lián)物環(huán)孢素A與下列結(jié)合蛋白的單體●親環(huán)蛋白●可與親環(huán)蛋白/環(huán)孢素A復(fù)合體中的環(huán)孢素A結(jié)合的rec.Fv的基因●能使用可與環(huán)孢素A不同表位結(jié)合的不同rec.Fv的基因，作為親環(huán)蛋白的備擇-對(duì)于偶聯(lián)物氨甲蝶呤
●抗氨甲蝶呤的抗體或抗體片段(rec.Fv)●抗蝶啶基的抗體或抗體片段(rec.Fv)●抗苯基的抗體或抗體片段(rec.Fv)●二氫葉酸還原酶-對(duì)于偶聯(lián)物慶大霉素●抗慶大霉素的抗體或抗體片段(rec.Fv)-對(duì)于偶聯(lián)物●抗體或抗體片段(rec.Fv)-對(duì)于偶聯(lián)物頭孢力新抗頭孢烯C7位的酰基側(cè)鏈的抗體或抗體片段(rec.Fv)-對(duì)于偶聯(lián)物葉酸●葉酸結(jié)合蛋白●抗葉酸的抗體或抗體片段(rec.Fv)-對(duì)于偶聯(lián)物視黃酸●細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白的視黃酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域●抗視黃酸的抗體或抗體片段(rec.Fv)-對(duì)于偶聯(lián)物●抗阿莫西林的抗體或抗體片段(rec.Fv)●抗芐基青霉素基的抗體或抗體片段(rec.Fv)●抗青霉素的抗體或抗體片段(rec.Fv)●青霉素結(jié)合蛋白-對(duì)于偶聯(lián)物4-羥基-三苯氧胺或三苯氧胺●雌激素受體蛋白的雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域●抗雌激素受體雌激素或4-羥基-三苯氧胺復(fù)合體的抗體或抗體片段(rec.Fv)-對(duì)于偶聯(lián)物四環(huán)素●四環(huán)素阻抑蛋白●抗四環(huán)素的抗體或抗體片段-對(duì)于偶聯(lián)物四環(huán)素與異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的結(jié)合物
●四環(huán)素阻抑蛋白●lac阻抑(lacⅠ)蛋白4)調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合蛋白[組分b5]]已經(jīng)描述了調(diào)節(jié)蛋白的大量細(xì)胞結(jié)合蛋白[Zwicker和Muller，細(xì)胞周期研究進(jìn)展1:91(1995)；Boulikas等人，國(guó)際腫瘤學(xué)雜志(Int J.Oncol.)6:271(1995)；Pawson，自然373:573(1995)；Cotter，白血病與淋巴瘤(Leuk.Lymph)18:231(1995)；Hesketh，《癌基因》FactsBook Acad.Press,ISBN 0-12-344550-7(1995)；Miller和Sarver，自然雜志醫(yī)藥分冊(cè)(Nature Med.)3:389(1997)]。
適用于本發(fā)明的特別是那些只在疾病細(xì)胞中弱表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合蛋白或其結(jié)合序列，其與結(jié)合序列的結(jié)合被抑制，由于結(jié)合序列的過(guò)量而不以游離形式存在，或者只少量存在，或者其功能受不利影響或改變(例如被突變)。
這些調(diào)節(jié)蛋白包括，例如，腫瘤抑制基因表達(dá)的蛋白質(zhì)。
在下面的實(shí)施例中描述了這些調(diào)節(jié)蛋白及其相應(yīng)結(jié)合蛋白及其結(jié)合序列的選擇，但并不構(gòu)成本發(fā)明的限制調(diào)節(jié)蛋白 組分b5)(具有與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合序列的細(xì)胞結(jié)合蛋白)p53 MDM-2PRb ●轉(zhuǎn)錄因子E2F、-1、-2、-3●細(xì)胞周期蛋白-D1、-D2、-D3或-C●細(xì)胞周期蛋白-A、-E●轉(zhuǎn)錄因子PU.1●轉(zhuǎn)錄因子E1f-1p130●轉(zhuǎn)錄因子E2F-5●細(xì)胞周期蛋白A、-EMax ●MycMAD ●MycVHL ●延伸蛋白C、-Bcdk4p14、p15、p16、p18、p27、p57、p21MTS-1(p16) ●cdk4WT-1●p53SMAD2(MADR2)●DPC4DPC-4 ●SMAD2β-連環(huán)蛋白 ●LEF-1LEF-1 ●β-連環(huán)蛋白在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，組分b5)是一種調(diào)節(jié)蛋白的細(xì)胞外源結(jié)合蛋白的結(jié)合序列。例如，這種細(xì)胞外源結(jié)合序列可能是病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)來(lái)源的。
這種細(xì)胞外源結(jié)合序列的應(yīng)用使得組分b)的功能在正常細(xì)胞中受到抑制，因?yàn)橄鄳?yīng)的調(diào)節(jié)蛋白與組分b5)結(jié)合。然而在感染的細(xì)胞中，由于特定病原體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生含有結(jié)合序列的結(jié)合蛋白，相應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白大部分被結(jié)合。因此，在這些細(xì)胞中組分b)是游離的且起作用的。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，組分b5)是一種具有調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合序列(VH和VL)的抗體或抗體部分。
在下面的實(shí)施例中列出了細(xì)胞外源結(jié)合序列的選擇，其不限制本發(fā)明調(diào)節(jié)蛋白組分b2)(具有調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合序列的病毒結(jié)合蛋白)p53 ●CMV的IE 84●AV的E1B(55Kd)●EBV的EBNA-5●EBV的BHFR1●HPV(如HPV-16或-18)的E6●HBV的HBX蛋白
●SV40的T抗原PRb●AV的E1A●EBV的EBNA-2●EBV的EBNA-1或-5●HPV的E7●SV40的T抗原p130 ●AV的E1ACBF-1(RBP-JK) ●EBV的EBNA-2NF-Kappa B ●HIV的TaxLyn-酪氨酸激酶 ●EBV的LMP-1●EBV的LMP-2A或LMP-2BBak●AV的E1B(16Kd)Bax●AV的E1B(19kD)調(diào)節(jié)蛋白 具有調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合序列(VH、VL)的抗體或抗體片段p53對(duì)未突變的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異的單克隆抗體pRb●對(duì)活性(未磷酸化的)pRb特異的單克隆抗體myc●對(duì)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異的單克隆抗體當(dāng)選擇一種抗體時(shí)，優(yōu)選地使用抗體FVL和FVH的表位結(jié)合部分作為組分b5)，如果抗體是鼠源的，則其應(yīng)為人源形式。以Winter等人(自然349，293(1991))和Hoogenbooms等人，Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36,19(1993))所述的方法實(shí)現(xiàn)人源化。按照現(xiàn)有技術(shù)制備抗體片段，如用Winter等人，自然349,293(1991)、Hoogenbooms等人，Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36,19(1993)、Girol.Mol.Immunol.28,1379(1991)或Huston等人，國(guó)際免疫學(xué)綜述(Int.Rev.Immunol.)10,195(1993)所述的方法。
重組抗體片段直接從現(xiàn)有的雜交瘤制備，或借助于噬菌體展示技術(shù)(Smith，科學(xué)228,1315(1985))從鼠或人抗體片段文庫(kù)中分離(Winter等人，免疫學(xué)年述(Annu.Rev.Immunol.)12,433(1994))。然后這些抗體片段直接在基因水平用于偶聯(lián)組分b1)和b2)。
為了從雜交瘤制備重組抗體片段，通過(guò)分離mRNA、將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后利用聚合酶鏈反應(yīng)(Saiki等人，科學(xué)230,1350(1985))并使用分別互補(bǔ)于可變片段5’和3’端的寡核苷酸(Orlandi等人，1989)擴(kuò)增，獲得編碼抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(VH,VL)的遺傳信息。然后，例如以Fv片段(Skerra和Pluckthun，科學(xué)240,1038(1988))、單鏈Fv片段(scFv)(Bird等人，科學(xué)242,423(1988)；Huston等人，PNASUSA 85,5879(1988))的形式或作為Fab片段(Better等人，科學(xué)240,1041(1988))，將VH和VL片段克隆到細(xì)菌表達(dá)載體中。
也可利用噬菌體展示技術(shù)，直接從鼠源或人源的抗體文庫(kù)(免疫文庫(kù)，天然文庫(kù))中分離新的抗體片段(McCafferty等人，自然348,552(1990)；Reitling等人，基因104,147(1991)；MeCafferty等人，自然348,552(1990)；Hoogenbooms等人，核酸研究19,4133(1991)；Barbas等人,PNAS USA 88,7978(1991)；Marks等人，分子生物學(xué)雜志222,581(1991)；Hawkins等人，分子生物學(xué)雜志226,889(1992)；Marks等人，生物技術(shù)(Bio/Technol.)11,1145(1993))。
通過(guò)從免疫過(guò)的動(dòng)物(Sastry等人，PNAS USA 86,5728(1989)；Ward等人，自然341,544(1989)；Clackson等人，自然352,624(1991))或患者(Mullinax等人，PNAS USA 87,8095(1990)；Barbas等人，PNAS USA 88,7978(1991))的B淋巴細(xì)胞中PCR擴(kuò)增可變抗體片段制備免疫文庫(kù)。
利用噬菌體展示技術(shù)可進(jìn)一步提高抗體片段的親和力，現(xiàn)有抗體片段的新型文庫(kù)的制備方法包括，隨機(jī)(Hawkins等人，分子生物學(xué)雜志226,889(1992)；Gram等人，PNAS USA 89,3576(1992))、基于密碼子(Glaser等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)149,3903(1992))或直接誘變(Balint和Larrick，基因137,109(1993))，用天然全部組分的片段(Marks等人，生物技術(shù)10,779(1992))，或借助于細(xì)菌突變株(Low等人，分子生物學(xué)雜志260,359(1996))，和通過(guò)在嚴(yán)格條件下重新篩選分離的性質(zhì)改進(jìn)的抗體片段(Hawkins等人，分子生物學(xué)雜志226,889(1992))。
Ⅲ)組分b)的DNA結(jié)合序列[組分c)]DNA結(jié)合序列的選擇取決于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的選擇。例如，對(duì)于Ⅱ.1)中列出的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的實(shí)例，存在下列可能性-至少一種Gal4蛋白結(jié)合序列[核苷酸序列5’-CGGACAACTGTTGACCG-3’,SEQ ID NO:4]；Chasman和Komberg,分子細(xì)胞生物學(xué)10,2916(1990)或[核苷酸序列5’-CGGAGGACTGTCCTCCG-3’,SEQ ID NO:5]；或[核苷酸序列5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’,SEQ ID NO:6]；Giniger等人，PNASUSA 85,382(1988)-至少一種結(jié)合序列[核苷酸序列5’-TACTGTATGTACATACAGTA-3’,SEQ ID NO:7]；對(duì)于LexA蛋白[LexA操縱子；Brent等人，自然612,312(1984)]一至少一種Lac操縱子結(jié)合序列[核苷酸序列5’-GAATTGTGAGGCTCACAATTC-3’,SEQ ID NO:8]；對(duì)于lacⅠ阻抑蛋白(Fuerst等人，PNAS USA 86,2549(1989)；Simons等人，PNAS USA 81,1624(1984))-至少一種四環(huán)素操縱子(tet O)結(jié)合序列(核苷酸序列5’-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3’,SEQ ID NO:9)；對(duì)于四環(huán)素阻抑(tet R)蛋白-至少一種結(jié)合序列(核苷酸序列5’-TAATGATGGGCG-3’,SEQID NO:10)；對(duì)于ZFHD-1蛋白(Pomeranth等人，科學(xué)267,93(1995))Ⅳ)含有CDE-CHR或E2FBS-CHR的最小啟動(dòng)子[組分d)]能用的片段的實(shí)例包括-cdc25C基因的片段(核酸-20到+121或核酸-20到+50)-cdc2(cdk-1)基因的片段(核酸-26到+121；Liu等人，核酸研究24,2905(1996))
-細(xì)胞周期蛋白A基因的片段(核酸-40到+94；Liu等人，核酸研究24,2905(1996))-B-myb基因的片段(核酸-50到+50；Liu等人，核酸研究24,2905(1996))Ⅴ)效應(yīng)基因[組分e)]對(duì)于本發(fā)明，效應(yīng)基因編碼一種用于預(yù)防和/或治療疾病的活性化合物。根據(jù)疾病治療的性質(zhì)并考慮欲轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞選擇效應(yīng)基因和啟動(dòng)子序列。
例如，對(duì)于下列疾病選擇啟動(dòng)子序列(實(shí)施例見(jiàn)部分CI)和效應(yīng)基因的下列組合(專利申請(qǐng)EP-A0777739、EP-A0777740、EP-A0804601、EP-A0807183、EP-A0790313、EP-A0805209和EP-A0848063中已有詳述，在此引用作為參考)。
a)腫瘤治療a.1)靶細(xì)胞-增殖的內(nèi)皮細(xì)胞或-與內(nèi)皮細(xì)胞相鄰的肌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，或-腫瘤細(xì)胞或白血病細(xì)胞a.2)啟動(dòng)子-內(nèi)皮細(xì)胞特異的和細(xì)胞周期特異的，或-細(xì)胞非特異的或肌細(xì)胞特異的和細(xì)胞周期特異的，或-腫瘤細(xì)胞特異的(實(shí)體瘤，白血病)和細(xì)胞周期特異的a.3)細(xì)胞增殖抑制劑的效應(yīng)基因，例如-成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(pRb=p110)或相關(guān)p107和p130蛋白成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(pRb/p110)或相關(guān)p107和p130蛋白經(jīng)磷酸化滅活。優(yōu)選使用的這些細(xì)胞周期抑制劑的基因是在所表達(dá)的蛋白質(zhì)的滅活位點(diǎn)顯示突變而沒(méi)有后者的功能從而被不利地影響的基因。已對(duì)p110描述了這些突變的實(shí)例。類似地突變了對(duì)于p107蛋白或p130蛋白的DNA序列。
-p53蛋白蛋白質(zhì)p53由于與特異蛋白質(zhì)如MDM2結(jié)合或p53通過(guò)去磷酸化的C末端絲氨酸寡聚化而在細(xì)胞中失活。因此，對(duì)于p53蛋白，優(yōu)選的DNA序列是C末端截短了絲氨酸392的序列。
-p21(WAF-1)-p16蛋白-其他cdk抑制劑-GADD45蛋白-bak蛋白a.4)凝固誘導(dǎo)因子和血管生成抑制劑的效應(yīng)基因，例如-纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)-PAI-2-PAI-3-制管張素和/或內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制素-干擾素(IFNα、IFNβ或IFNγ)-血小板因子4-IL-12-TIMP-1-TIMP-2-TIMP-3-白血病抑制因子(LIF)-組織因子(TF)及其凝固活性片段a.5)細(xì)胞抑制和細(xì)胞毒性蛋白的效應(yīng)基因，例如-穿孔素-粒酶-IL-2-IL-4-IL-12-干擾素如IFNα、IFNβ或IFNγ-TNF，如TNFα或TNFβ
-制癌蛋白M-鞘磷脂酶-爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物a.6)細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性抗體和在抗原結(jié)合抗體片段與細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒性或炎性蛋白或酶之間形成的融合蛋白的效應(yīng)基因。
-細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性抗體，包括如Burrows等人(藥物治療(Pharmac.Ther.)64,155(1994))、Hughes等人(癌癥研究(CancerRes.)49,6214(1989))和Maruyama等人(PNAS USA 87,5744(1990))所述的針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體。尤其包括針對(duì)VEGF受體的抗體。體。例如，Sedlacek等人，腫瘤學(xué)稿件(Contrib.to Onocol.)32,KargerVerlag，慕尼黑(1988)和腫瘤學(xué)稿件43,KargerVerlag，慕尼黑(1992)綜述了這些抗體。其他實(shí)例是如下抗體抗唾液酸Lewis；抗T淋巴細(xì)胞可識(shí)別的腫瘤上的肽；抗癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)；抗神經(jīng)節(jié)苷脂如GD3、GD2、GM2、9-0-乙?；鵊D3、巖藻糖基GM1；抗血型抗原及其前體；抗多態(tài)性上皮粘蛋白抗原；抗熱休克蛋白抗原-它們還包括針對(duì)白血病細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體。已經(jīng)描述了用于診斷和治療方法的大量這種單克隆抗體(見(jiàn)Kristensen，丹麥醫(yī)學(xué)報(bào)告(DanishMedical Bulletin)41,52(1994)；Schranz,Therapia Hungarica 38,3(1990)；Drexler等人，白血病研究(Leuk.Res.)10,279(1986)；Naeim，疾病標(biāo)志(Dis.Markers)7,1(1989)；Stichney等人，現(xiàn)代腫瘤學(xué)觀點(diǎn)(Curr.Opin.Oncol.)4,847(1992)；Drexler等人，Blut 57,327(1988)；Freedman等人，癌癥研究9,69(1991))。根據(jù)白血病的類型，合適的配體是，例如，針對(duì)下列膜抗原的單克隆抗體或其抗原結(jié)合抗體片段細(xì)胞 膜抗原AML CD13CD15
CD33CAMAL唾液酸(sialosyl)-LeB-CLL CD5CD1cCD23膜免疫球蛋白的獨(dú)特型和同種型T-CLL CD33M38IL-2受體T細(xì)胞受體ALLCALLACD19非何杰金淋巴瘤-按照技術(shù)人員公知的技術(shù)(Winter等人，自然349,293(1991)；Hoogenbooms等人，Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36,19(1993)；Girol.Mol.Immunol.28,1379(1991)或Huston等人，國(guó)際免疫學(xué)綜述10,195(1993))進(jìn)行鼠單克隆抗體的人源化，F(xiàn)ab和rec.Fv片段的基因的制備和優(yōu)化。rec.Fv片段與細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒性或炎性蛋白或酶的融合也按照技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。
a.7)在靶細(xì)胞結(jié)合配體及細(xì)胞抑制和細(xì)胞毒性蛋白之間形成的融合蛋白的效應(yīng)基因。這些配體包括可與內(nèi)皮細(xì)胞上膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的所有物質(zhì)。它們的實(shí)例包括-細(xì)胞因子，如IL-1或生長(zhǎng)因子或其片段或亞序列，其可與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合，如PDGF、bFGF、VEGF、TGF。
-它們還包括可與激活的和/或增殖的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的粘附分子。它們包括，例如，SLex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1、VLA-4或玻連蛋白。
-它們還包括可與腫瘤或白血病細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的物質(zhì)。它們包括，例如，生長(zhǎng)因子或其片段或亞序列，其可與白血病細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合。
已經(jīng)描述了這些生長(zhǎng)因子(見(jiàn)Cross等人，細(xì)胞64,271(1991),Aulitzky等人，藥物(Drugs)48,667(1994),Moore，臨床癌癥研究(Clin.Cancer Res.)1,3(1995),van Kooten等人，白血病與淋巴瘤12,27(1993))。
-根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)水平，用技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行這些可與靶細(xì)胞結(jié)合的配體與細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒性或炎性蛋白或酶的基因融合。
a.8)炎性誘導(dǎo)物的效應(yīng)基因，例如-IL-1-IL-2-RANTES(MCP-2)-單核細(xì)胞趨化與活化因子(MCAF)-IL-8-巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1(MIP-1α,-β)-中性粒細(xì)胞激活蛋白-2(NAP-2)-IL-3-IL-5-人白血病抑制因子(LIF)-IL-7-IL-11-IL-13-GM-CSF-G-CSF-M-CSF-眼鏡蛇毒因子(CVF)或CVF的亞序列，它們?cè)诠π舷喈?dāng)于人補(bǔ)體因子C3b，即能結(jié)合補(bǔ)體因子B，并在被因子D切割后組成C3轉(zhuǎn)化酶
-人補(bǔ)體因子C3或其亞序列C3b-人補(bǔ)體因子C3的裂解產(chǎn)物，其在功效上和結(jié)構(gòu)上類似于CVF-可激活補(bǔ)體或引發(fā)炎癥的細(xì)菌蛋白質(zhì)，如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的孔蛋白、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的聚集因子、特別是革蘭氏陰性菌的modulin、軍團(tuán)菌(Legionillas)或B型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)或克雷伯菌(Klebsiella)的主要外膜蛋白、或G組鏈球菌(Streptococcus)的M分子。
a.9)可激活細(xì)胞抑制劑前體的酶的效應(yīng)基因，如可將無(wú)活性前體(前體藥物)切割為活性細(xì)胞抑制劑(藥物)的酶的效應(yīng)基因。
Deonarain等人(英國(guó)癌癥雜志(Br.J.Cancer)70,786(1994))、Mullen，藥物治療63,199(1994)和Harris等人(基因治療1,170(1994))已經(jīng)綜述了這些物質(zhì)和相應(yīng)的前體藥物和藥物。例如，使用下列酶之一的DNA序列-單純皰疹病毒胸苷激酶-水痘-帶狀皰疹病毒胸苷激酶-細(xì)菌硝基還原酶-細(xì)菌β-葡糖醛酸糖苷酶-來(lái)源于黑麥(Secale cereale)的植物β-葡糖醛酸糖苷酶-人β-葡糖醛酸糖苷酶-人羧肽酶(CB)，例如肥大細(xì)胞CB-A、胰腺CB-B或細(xì)菌羧肽酶-細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶-細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶-人過(guò)氧化氫酶或過(guò)氧化物酶-磷酸酶，特別是人堿性磷酸酶、人酸性前列腺磷酸酶或5型酸性磷酸酶-氧化酶，特別是人賴氨酰氧化酶或人酸性D-氨基氧化酶-過(guò)氧化物酶，特別是人谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、人嗜酸性過(guò)氧化物酶或人甲狀腺過(guò)氧化物酶-半乳糖苷酶b)自身免疫病和炎癥的治療(專利申請(qǐng)EP-A0807183中已有詳述，在此引用作為參考)b.1)靶細(xì)胞-增殖的內(nèi)皮細(xì)胞或-巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞或-滑膜細(xì)胞b.2)啟動(dòng)子-內(nèi)皮細(xì)胞特異的和細(xì)胞周期特異的，或-巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞特異的和/或細(xì)胞周期特異的，或-滑膜細(xì)胞特異的和/或細(xì)胞周期特異的b.3)用于治療變態(tài)反應(yīng)的效應(yīng)基因，例如-IFNβ-IFNγ-IL-10-抗IL-4的抗體或抗體片段-可溶性IL-4受體-IL-12-TGFβb.4)用于防止移植器官排斥反應(yīng)的效應(yīng)基因，例如-IL-10-TGFβ-可溶性IL-1受體-可溶性IL-2受體-IL-1受體拮抗劑-可溶性IL-6受體-免疫抑制抗體或其含VH和含VL片段，或其可通過(guò)接頭鍵合的VH和VL片段。
免疫抑制抗體是，例如，對(duì)T細(xì)胞受體或其CD3復(fù)合體特異的抗體，或針對(duì)CD4或CD8的抗體，還有針對(duì)IL-2受體、IL-1受體或IL-4受體的抗體，或針對(duì)粘附分子CD2、LFA-1、CD28或CD40的抗體b.5)用于治療抗體介導(dǎo)的自身免疫病的效應(yīng)基因，例如-TGFβ-IFNα-IFNβ-IFNγ-IL-12-可溶性IL-4受體-可溶性IL-6受體-免疫抑制抗體或其含VH和含VL片段b.6)用于治療細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的效應(yīng)基因，例如-IL-6-IL-9-IL-10-IL-13-TNFα或TNFβ-IL-13-免疫抑制抗體或其含VH和含VL片段b.7)細(xì)胞增殖抑制劑、細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性蛋白和用于激活細(xì)胞抑制劑前體的酶的效應(yīng)基因在“用于治療腫瘤的效應(yīng)基因”部分中已經(jīng)提到了編碼這些蛋白質(zhì)的基因的實(shí)例。
以上述相同的方式，對(duì)于本發(fā)明能使用編碼融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因，該融合蛋白由抗體或這些抗體的Fab或rec.Fv片段，或?qū)Π屑?xì)胞特異的其他配體，和上述細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、受體、細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性蛋白和酶形成。
b.8)用于治療關(guān)節(jié)炎的效應(yīng)基因?qū)τ诒景l(fā)明，選擇其表達(dá)的蛋白質(zhì)可直接或間接抑制如關(guān)節(jié)炎癥和/或促進(jìn)關(guān)節(jié)胞外基質(zhì)(軟骨、結(jié)締組織)重建的結(jié)構(gòu)基因。
它們包括，例如，-IL-1受體拮抗劑(IL-1-RA)；IL-1-RA可抑制IL-1α、β的形成-可溶性IL-1受體可溶性IL-1受體可結(jié)合并滅活I(lǐng)L-1-IL-6IL-6可增強(qiáng)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的TIMP和超氧化物分泌，并降低IL-1和TNFα分泌-可溶性TNF受體可溶性TNF受體可結(jié)合并滅活TNF。
-IL-4IL-4抑制IL-1、TNFα和MMP的形成和分泌-IL-10IL-10抑制IL-1、TNFα和MMP的形成和分泌，提高TIMP的分泌-胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)IGF-1刺激胞外基質(zhì)的合成。
-TGFβ，特別是TGFβ1和TGFβ2TGFβ刺激胞外基質(zhì)的合成。
-超氧化物歧化酶-TIMP，特別是TIMP-1、TIMP-2或TIMP-3c)血細(xì)胞形成缺陷的治療(專利申請(qǐng)EP-A0807183中已有詳述，在此引用作為參考)c.1)靶細(xì)胞-增殖的、未成熟的造血系統(tǒng)細(xì)胞，或-與造血細(xì)胞相鄰的基質(zhì)細(xì)胞c.2)啟動(dòng)子
-對(duì)造血細(xì)胞特異的和/或細(xì)胞周期特異的-細(xì)胞非特異的和細(xì)胞周期特異的c.3)用于治療貧血的效應(yīng)基因，例如-促紅細(xì)胞生成素c.4)用于治療白細(xì)胞減少癥的效應(yīng)基因，例如-G-CSF-GM-CSF-M-CSFc.5)用于治療血小板減少癥的效應(yīng)基因，例如-IL-3-白血病抑制因子(LIF)-IL-11-血小板生成素d)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療(專利申請(qǐng)EP-A0777740中已有詳述，在此引用作為參考)d.1)靶細(xì)胞-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或-增殖的內(nèi)皮細(xì)胞d.2)啟動(dòng)子-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異的和細(xì)胞周期特異的，或-內(nèi)皮細(xì)胞特異的和細(xì)胞周期特異的，或-非特異的和細(xì)胞周期特異的d.3)神經(jīng)元生長(zhǎng)因子的效應(yīng)基因，例如-FGF-神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)-神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT-3)-神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4(NT-4)-睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)
d.4)酶的效應(yīng)基因，例如-酪氨酸羥化酶-多巴羧化酶d.5)能抑制或中和TNFα神經(jīng)毒作用的細(xì)胞因子及其抑制劑的效應(yīng)基因，例如-TGFβ-可溶性TNF受體-可中和TNFα的TNF受體-IL-10IL-10可抑制IFNγ、TNFα、IL-2和IL-4的形成-可溶性IL-1受體-IL-1受體Ⅰ-IL-1受體Ⅱ-可中和IL-1活性的可溶性IL-1受體-IL-1受體拮抗劑-可溶性IL-6受體e)血凝系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)障礙的治療(專利申請(qǐng)EP-A0777739、EP-A0790313、EP-A0805209和EP-A0848063中已有詳述，在此引用作為參考)e.1)靶細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞或-增殖的內(nèi)皮細(xì)胞或-鄰近內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的體細(xì)胞或-巨噬細(xì)胞e.2)啟動(dòng)子-細(xì)胞非特異的和細(xì)胞周期特異的或-內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或巨噬細(xì)胞特異的和細(xì)胞周期特異的e.3)用于抑制凝固或促進(jìn)纖維蛋白溶解的效應(yīng)基因，例如-組織纖溶酶原激活物(tPA)
-尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)-tPA和uPA的雜合體-蛋白C-蛭素-絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpine)，如C-1S抑制劑、α1-抗胰蛋白酶或抗凝血酶Ⅲ-組織因子途徑抑制劑(TFPI)e.4)用于促進(jìn)凝固的效應(yīng)基因，例如-FⅧ-FⅨ-von Willebrand因子-FⅩⅢ-PAI-1-PAI-2-組織因子及其片段e.5)血管生成因子的效應(yīng)基因，例如-VEGF-FGFe.6)用于降低血壓的效應(yīng)基因，例如-激肽釋放酶-內(nèi)皮細(xì)胞氧化氮合酶e.7)用于抑制內(nèi)皮層損傷后平滑肌細(xì)胞增殖的效應(yīng)基因，例如-一種抗增殖的、細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性蛋白或-一種如上所述(腫瘤部分)可將細(xì)胞抑制劑前體切割為細(xì)胞抑制劑的酶或-這些活性化合物之一與配體如肌細(xì)胞特異的抗體或抗體片段的融合蛋白e.8)其他血漿蛋白的效應(yīng)基因，例如-白蛋白
-C1滅活劑-血清膽堿酯酶-轉(zhuǎn)鐵蛋白-1-抗胰蛋白酶f)接種(專利申請(qǐng)EP-A0807183、EP-A0790313、EP-A0860445中已有詳述，在此引用作為參考)f.1)靶細(xì)胞-肌細(xì)胞或-巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞f.2)啟動(dòng)子-非特異的和細(xì)胞周期特異的或-靶細(xì)胞特異的和細(xì)胞周期特異的f.3)用于預(yù)防傳染病的效應(yīng)基因。利用常規(guī)方法制備有效疫苗的可能性受限制。
因此，發(fā)展了DNA疫苗技術(shù)。但是，這些DNA疫苗引起了關(guān)于其效能的問(wèn)題(Fynan等人，國(guó)際免疫藥理學(xué)雜志(Iht J.Immunopharm.)17，79(1995)；Donnelly等人，免疫學(xué)2,20(1994))。
根據(jù)本發(fā)明預(yù)期能有DNA疫苗的良好效能。
欲選擇的活性物質(zhì)是病原體形成的蛋白質(zhì)的DNA，通過(guò)引發(fā)免疫反應(yīng)，即通過(guò)抗體結(jié)合和成利用細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，其可導(dǎo)致病原體的中和和/或破壞。這些所謂的中和抗原已被用作接種抗原(見(jiàn)Ellis，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物學(xué)進(jìn)展(Adv.Exp.Med.Biol.)327,263(1992))。
對(duì)于本發(fā)明優(yōu)選的是編碼下列病原體的中和抗原的DNA-A型流感病毒-HIV-狂犬病毒-HSV(單純皰疹病毒)-RSV(呼吸道合胞病毒)
-副流感病毒-輪狀病毒-VZV(水痘-帶狀皰疹病毒)-CMV(巨細(xì)胞病毒)-麻疹病毒-HPV(人乳頭瘤病毒)-HBV(乙型肝炎病毒)-HCV(丙型肝炎病毒)-HDV(丁型肝炎病毒)-HEV(戊型肝炎病毒)-HAV(甲型肝炎病毒)-霍亂弧菌(Vibrio cholera)抗原-博氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)-幽門纏繞桿菌(Helicobacter pylori)-瘧疾抗原-然而，對(duì)于本發(fā)明，這些活性物質(zhì)也包括抗獨(dú)特型抗體或其抗原結(jié)合片段的DNA，其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)(互補(bǔ)決定區(qū))構(gòu)成了病原體中和抗原的蛋白質(zhì)或糖結(jié)構(gòu)的拷貝。
這些抗獨(dú)特型抗體尤其能代替細(xì)菌病原體中的糖類抗原。
Hawkins等人(免疫治療雜志(J.Immunother.)14,273(1993))和Westerink和Apicella(Springer Seminars Immunopathol.15,227(1993))綜述了這些抗獨(dú)特型抗體及其裂解產(chǎn)物。
f.4)“腫瘤疫苗”的效應(yīng)基因-它們包括腫瘤細(xì)胞上的抗原。例如，Sedlacek等人，腫瘤學(xué)稿件32,Karger Verlag，慕尼黑(1988)和腫瘤學(xué)稿件43,Karger Verlag,慕尼黑(1992)綜述了這些抗原。
其他實(shí)例是下列抗原或?qū)?yīng)于下列抗原的抗獨(dú)特型抗體的基因-唾液酸Lewis-可被T淋巴細(xì)胞識(shí)別的腫瘤上的肽
-癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)-血型抗原及其前體-多態(tài)性上皮粘蛋白上的抗原-熱休克蛋白上的抗原g)慢性傳染病的治療(專利申請(qǐng)EP-A0807183和EP-A0860445中已有詳述，在此引用作為參考)g.1)靶細(xì)胞-肝細(xì)胞-淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞-上皮細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞g.2)啟動(dòng)子-病毒特異的或細(xì)胞特異的和細(xì)胞周期特異的g.3)例如下列的效應(yīng)基因-顯示細(xì)胞抑制、凋亡或細(xì)胞毒性作用的蛋白質(zhì)-可將抗病毒或細(xì)胞毒性物質(zhì)前體切割為活性物質(zhì)的酶g.4)抗病毒蛋白的效應(yīng)基因-具有抗病毒作用的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。包括例如IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFβ、TNFα、IL-1或TGFβ-如述制備的可滅活所述病毒的特異性抗體，或其含VH和含VL片段，或其可通過(guò)接頭鍵合的VH和VL片段。
抗病毒抗原的抗體的實(shí)例包括抗HBV抗HCV抗HSV抗HPV抗HIV抗EBV
抗HTLV抗柯薩奇病毒抗?jié)h坦病毒-Rev結(jié)合蛋白。這些蛋白質(zhì)可在反轉(zhuǎn)錄病毒基因表達(dá)中與RevRNA結(jié)合并抑制Rev依賴的轉(zhuǎn)錄后階段。Rev結(jié)合蛋白的實(shí)例包括RBP9-27RBP1-8URBP1-8DRBP1-8的假基因-可消化細(xì)胞周期控制蛋白基因的mRNA或病毒mRNA的核酶。例如，Christoffersen等人，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J.Med.Chem.)38,2033(1995)綜述了對(duì)HIV有催化活性的核酶。
g.5)抗細(xì)菌蛋白的效應(yīng)基因抗細(xì)菌蛋白包括，例如，可中和細(xì)菌毒素或調(diào)理細(xì)菌的抗體。這些抗體包括抗下列物質(zhì)的抗體腦膜炎球菌(meningococci)C或B大腸桿菌疏螺旋體(Borrelia)假單胞菌(Pseudomonas)幽門螺桿菌(Helicobacter phlori)金黃色葡萄球菌Ⅵ)相同或不同效應(yīng)基因的組合(專利申請(qǐng)EP-A0777739和EP-A0860445中已有詳述，在此引用作為參考)為了表達(dá)兩種或多種效應(yīng)基因[例如組分e、e’、e”]，在每種情況中將另一種組分c)和組分d)或優(yōu)選地內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的cDNA嵌入所述效應(yīng)基因之間作為調(diào)節(jié)元件。
IRES使得通過(guò)IRES彼此連接的兩種DNA序列表達(dá)。
例如，Montford和Smith(TIG 11,179(1995)；Kaufman等人，核酸研究19,4485(1991)；Morgan等人，核酸研究20,1293(1992)；Dirks等人，基因128,247(1993)；Pelletier和Sonenberg，自然334,320(1988)和Sugitomo等人，生物技術(shù)12,694(1994))已經(jīng)描述了這些IRES。
例如，能使用脊髓灰質(zhì)炎病毒IRES序列的相應(yīng)DNA序列(5’UTR的位點(diǎn)<140->630)。
對(duì)于本發(fā)明，優(yōu)選地通過(guò)另外的組分c)和d)或通過(guò)IRES序列連接具有加成作用的效應(yīng)基因。
對(duì)于本發(fā)明優(yōu)選的是下列效應(yīng)基因的組合，例如a)腫瘤的治療-相同或不同的細(xì)胞抑制、凋亡、細(xì)胞毒性和/或炎性蛋白，或-能切割細(xì)胞抑制劑前體的相同或不同的酶b)自身免疫病的治療-對(duì)于抑制細(xì)胞和/或體液免疫反應(yīng)具有協(xié)同作用的不同細(xì)胞因子或受體，或-不同或相同的TIMPc)血細(xì)胞形成缺陷的治療-不同的有等級(jí)順序的細(xì)胞因子，如IL-1、IL-3、IL-6或GM-CSF和促紅細(xì)胞生成素、G-CSF或血小板生成素d)神經(jīng)細(xì)胞損傷的治療-神經(jīng)元生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子或細(xì)胞因子抑制劑e)血凝系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)障礙的治療-抗凝劑和纖維蛋白溶解劑(如tPA或uPA)或-細(xì)胞抑制、凋亡或細(xì)胞毒性蛋白和抗凝劑或纖維蛋白溶解劑-幾種不同的協(xié)同作用的凝血因子，如FⅧ和vWF或FⅧ和FⅨf)接種-一種抗原和免疫刺激細(xì)胞因子，如IL-1α、IL-1β、IL-2、GM-CSF、IL-3或IL-4受體
-一種病原體或不同病原體的不同抗原或-一種腫瘤類型或不同腫瘤類型的不同抗原g)病毒傳染病的治療-一種抗病毒蛋白和細(xì)胞抑制、凋亡或細(xì)胞毒性蛋白-針對(duì)一種病毒或幾種病毒的不同表面抗原的抗體h)細(xì)菌傳染病的治療-針對(duì)一種微生物的不同表面抗原和/或毒素的抗體Ⅶ)信號(hào)序列和跨膜結(jié)構(gòu)域的引入a)為了增強(qiáng)翻譯，可將核苷酸序列GCCACC或GCCGCC插入啟動(dòng)子序列的3’端或直接插入信號(hào)或跨膜序列的起始信號(hào)(ATG)的5’端(Kozak等人，細(xì)胞生物學(xué)雜志108,299(1989))。
b)為了促進(jìn)效應(yīng)基因的表達(dá)產(chǎn)物的分泌，可將包含于效應(yīng)基因DNA序列中的同源信號(hào)序列替換為能提高胞外分泌的異源信號(hào)序列。
因此，例如，可插入對(duì)于免疫球蛋白的信號(hào)序列(DNA位點(diǎn)<63->107；Riechmann等人，自然332,323(1988))或?qū)τ贑EA的信號(hào)序列(DNA位點(diǎn)<33->134；Schrewe等人，分子細(xì)胞生物學(xué)10,2738(1990)；Berling等人，癌癥研究50,6534(1990))或人呼吸道合胞病毒糖蛋白的信號(hào)序列(氨基酸<38->50或48-65的cDNA；Lichtenstein等人，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)77,109(1996))。
c)為了將活性物質(zhì)錨定于形成該活性物質(zhì)的被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞膜中，除了信號(hào)序列之外，能引入跨膜結(jié)構(gòu)域的序列，或用其代替信號(hào)序列。
因此，例如，可在啟動(dòng)子序列與效應(yīng)基因序列之間插入人巨噬細(xì)胞集落刺激因子的跨膜序列(DNA位點(diǎn)<1485->1554；Cosman等人，BehringInst.Mitt.83,15(1988))或人呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白G的信號(hào)和跨膜區(qū)(氨基酸1-63或其亞序列，氨基酸38-63；Vijaya等人，分子細(xì)胞生物學(xué)8,1709(1988)；Lichtenstein等人，普通病毒學(xué)雜志77,109(1996))或流感病毒神經(jīng)氨酸酶的信號(hào)和跨膜區(qū)的DNA序列(氨基酸7-35或亞序列氨基酸7-27；Brown等人，病毒學(xué)雜志62,3824(1988))。
d)為了將活性物質(zhì)錨定于形成該活性物質(zhì)的被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞膜中，也能插入糖磷脂錨的核苷酸序列。
除插入信號(hào)序列之外，可將糖磷脂錨插入結(jié)構(gòu)基因核苷酸序列的3’端。
例如，已經(jīng)描述了CEA、N-CAM和其他膜蛋白如Thy-1的糖磷脂錨(見(jiàn)Ferguson等人，生物化學(xué)年述57,285(1988))。
e)根據(jù)本發(fā)明將活性物質(zhì)錨定于細(xì)胞膜的另一種可能性是利用配體/活性物質(zhì)融合蛋白的DNA序列。該融合蛋白的配體的特異性針對(duì)于所選靶細(xì)胞的細(xì)胞膜上的膜結(jié)構(gòu)。
e.1)可結(jié)合于細(xì)胞表面的配體包括，例如，針對(duì)下列細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段-內(nèi)皮細(xì)胞。特別包括針對(duì)VEGF受體或針對(duì)激肽受體的抗體-肌細(xì)胞，如針對(duì)肌動(dòng)蛋白的抗體，或針對(duì)血管緊張肽Ⅱ受體的抗體，或針對(duì)生長(zhǎng)因子受體的抗體，如針對(duì)EGF受體或PDGF受體或FGF受體的抗體，或針對(duì)內(nèi)皮縮血管肽A受體的抗體-配體也包括針對(duì)腫瘤細(xì)胞膜上腫瘤特異抗原或腫瘤相關(guān)抗原的抗體或其片段。這些抗體已被描述。
鼠單克隆抗體優(yōu)選地以人源化形式使用。如前所述，用技術(shù)人員公知的技術(shù)制備Fab和rec.Fv片段及其融合產(chǎn)物。
e.2)配體還包括所有活性物質(zhì)，如細(xì)胞因子或粘附分子，生長(zhǎng)因子或其片段或其亞序列，或可與所選細(xì)胞上膜結(jié)構(gòu)或膜受體結(jié)合的介質(zhì)或肽激素。它們包括，例如-內(nèi)皮細(xì)胞的配體，如IL-1、PDGF、bFGF、VEGF、TGGβ(Pusztain等人，病理學(xué)雜志(J.Pathol.)169,191(1993))或激肽及衍生物，或激肽類似物。
-它們還包括粘附分子。已經(jīng)描述了這些對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的粘附分子，如Slex、LFA-1、MAC-1、LeCAM-1、VLA-4或玻連蛋白和玻連蛋白的衍生物或類似物(見(jiàn)Augustin-Voss等人，細(xì)胞生物學(xué)雜志119,483(1992)；Pauli等人，癌癥轉(zhuǎn)移綜述(Cancer Metast.Rev.)9,175(1990)；Honn等人，癌癥轉(zhuǎn)移綜述11,353(1992)；Varner等人，細(xì)胞粘附通訊(Cell Adh.Commun.)3,367(1995))。
將參照下面的實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但不限于這些實(shí)施例。D)說(shuō)明本發(fā)明精神的實(shí)施例實(shí)施例1含有帶重組轉(zhuǎn)錄因子的嵌合啟動(dòng)子系統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)的制備與在內(nèi)皮細(xì)胞中的測(cè)試a)所用質(zhì)粒的克隆根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)由下列構(gòu)建體組成RTA(重組轉(zhuǎn)錄激活物)構(gòu)建體和在連續(xù)下游具有不同核苷酸序列的報(bào)道基因構(gòu)建體1或2。
RTA構(gòu)建體(圖5A)-SV40啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(基因庫(kù)SV40環(huán)狀基因組，NID g965480；核苷酸5172-294)-兔β-珠蛋白內(nèi)含子Ⅱ(基因庫(kù)β-珠蛋白基因，保藏號(hào)V00882；核苷酸700-1305,van Ooyen等人，科學(xué)206,337(1979))-Gal4蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的cDNA[氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，分子細(xì)胞生物學(xué)2916(1990)]-接頭ATA GGC CGG GCC(SEQ ID NO:11)-NF-YA的反式激活結(jié)構(gòu)域的cDNA[氨基酸1-261+終止密碼子(TAG)；Li等人，生物化學(xué)雜志267,8984(1992)；van Hujisduijnen等人，EMBO J.9,3119(1990)；Sinka等人，生物化學(xué)雜志92,1624(1995)]-SV40 poly-A信號(hào)(載體pGL3,Promega)(該轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)添加于以下列出但未具體提及的所有構(gòu)建體的3’端)報(bào)道基因構(gòu)建體1(圖5B)-5×Gal4蛋白結(jié)合序列[核苷酸序列5×5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’,SEQ ID NO:6](Webster等人，細(xì)胞52,169(1988))
-cdc25C的基礎(chǔ)啟動(dòng)子[核苷酸序列-20到+121；Lucibello等人，EMBO J.14,132(1995)]-螢光素酶的cDNA；所有螢光素酶構(gòu)建體都克隆到載體pGL3(Promega)中，該載體含有SV40 poly-A信號(hào)用于轉(zhuǎn)錄終止報(bào)道基因構(gòu)建體2(圖5C)-3×Gal4蛋白結(jié)合序列[核苷酸序列5×5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’,SEQ ID NO:6](Webster等人，細(xì)胞52，169(1988))-細(xì)胞周期蛋白A的基礎(chǔ)啟動(dòng)子(核苷酸序列-40到+94；Henglein等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl Acad.Sci.USA)91,5490-5494(1994)]-螢光素酶的cDNA(pGL3,Promega)下列構(gòu)建體用作對(duì)照?qǐng)?bào)道基因構(gòu)建體3(圖5D)其對(duì)應(yīng)于報(bào)道基因構(gòu)建體1，但cdc25C的基礎(chǔ)啟動(dòng)子[核苷酸序列-20到+121；Lucibello等人，EMBO J.14,132(1995)]中的CDE元件TGGCGGA被突變?yōu)門GGCtGA。
對(duì)照構(gòu)建體1(圖6A)Promega的“pGL3啟動(dòng)子”-SV40啟動(dòng)子-螢光素酶的cDNA對(duì)照構(gòu)建體2(圖6B)具有下列核苷酸序列的表達(dá)系統(tǒng)-細(xì)胞周期蛋白A啟動(dòng)子(-214到+100,Henglein等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)91,5490-5494(1994))-螢光素酶的cDNA對(duì)照構(gòu)建體3(圖6C)具有下列核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物-cdc25C啟動(dòng)子(-290到+121,Lucibello等人，EMBO J.14,132-142(1995))-螢光素酶的cDNA為了克隆所有報(bào)道基因構(gòu)建體和對(duì)照構(gòu)建體，用pGL3(Promega，螢光素酶cDNA報(bào)道基因)作為載體。利用PCR從人類基因組DNA中擴(kuò)增克隆到該載體中的啟動(dòng)子元件。用于此目的之寡核苷酸在每種情況中都含有4個(gè)核苷酸的突出端(5’-GATC-3’)，隨后是含有需要的限制酶切位點(diǎn)的6個(gè)核苷酸(對(duì)于對(duì)照質(zhì)粒1和2及報(bào)道基因質(zhì)粒1和3是5’引物BamHⅠ(GGATCC)/3’引物HindⅢ(AAGCTT)；對(duì)于報(bào)道基因質(zhì)粒2是5’引物BglⅡ(AGATCT)/3’引物HindⅢ)，之后是互補(bǔ)于待擴(kuò)增的啟動(dòng)子的20-25個(gè)核苷酸(開(kāi)始于與轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)有關(guān)的位點(diǎn)，示于括號(hào)中)。括號(hào)中所示的位置是指引用的參考文獻(xiàn)中所列出的序列。
按照使用說(shuō)明書(shū)，用QIAquickTM自旋柱(Qiagen)純化PCR產(chǎn)物，用相關(guān)限制酶消化(這些酶可商品獲得)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，然后再次用QIAquickTM自旋柱純化。
將Gal4結(jié)合位點(diǎn)合成為具有相關(guān)限制酶切位點(diǎn)(5’:BamHⅠ/3’:BglⅡ)所需突出端的寡核苷酸，用SephadexG25(Pharmacia)純化，并雜交。
隨后用T4 DNA連接酶(Promega)將消化的PCR產(chǎn)物和雜交的寡核苷酸連接到以適當(dāng)方法酶切的載體中，并純化。
對(duì)通過(guò)PCR和用寡核苷酸獲得的所有構(gòu)建體測(cè)序，以確保不存在突變。
b)報(bào)道基因測(cè)定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、同步化和螢光素酶測(cè)定利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染測(cè)定a)中所述構(gòu)建體在內(nèi)皮細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性，隨后測(cè)定螢光素酶活性。用DEAE/葡聚糖法[Sompayrac等人，PNAS78,7575(1981)的改良法]瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BAEC(牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞)。如Lucibello等人(EMBO J.14,132(1995))所述進(jìn)行螢光素酶測(cè)定。
每個(gè)3.5em平皿轉(zhuǎn)染8mg質(zhì)粒。在共轉(zhuǎn)染中，轉(zhuǎn)染4+4μg質(zhì)粒，至于對(duì)照，用質(zhì)粒pUC19填滿。為了測(cè)定細(xì)胞周期依賴的啟動(dòng)子活性，將增殖的細(xì)胞(完全培養(yǎng)基)與通過(guò)甲硫氨酸饑餓48小時(shí)而停止于細(xì)胞周期G1期的細(xì)胞相比較。
非細(xì)胞周期調(diào)節(jié)(含有SV40啟動(dòng)子)的對(duì)照構(gòu)建體1用于標(biāo)準(zhǔn)化(其活性確定為1)。
c)結(jié)果獲得下列結(jié)果(括號(hào)中列出的測(cè)定值代表增殖細(xì)胞中的相對(duì)螢光素酶活性(用SV40啟動(dòng)子標(biāo)準(zhǔn)化=對(duì)照構(gòu)建體1)/G1細(xì)胞中的相對(duì)螢光素酶活性)在對(duì)照構(gòu)建體2)和3)轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞中，增殖時(shí)(DNA＞2S)形成的螢光素酶明顯多于停止于細(xì)胞周期G1期時(shí)(DNA=2S)(對(duì)照構(gòu)建體3＞40×；對(duì)照構(gòu)建體2＞150×)。這些構(gòu)建體作為對(duì)照用于用根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。
當(dāng)再次與RTA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染報(bào)道基因構(gòu)建體1)和2)時(shí)，證明在增殖的內(nèi)皮細(xì)胞中比在停止于G1的內(nèi)皮細(xì)胞中有更高的螢光素酶活性(報(bào)道基因構(gòu)建體1:5.5×；報(bào)道基因構(gòu)建體2:8.3×)。與RTA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染對(duì)照構(gòu)建體3)后未觀察到差異(1.0×)。在每種情況中，螢光素酶活性明顯高于單獨(dú)用所述報(bào)道基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后。
因此證明了根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)在內(nèi)皮細(xì)胞中的明顯細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。實(shí)施例2含有帶重組轉(zhuǎn)錄因子的嵌合啟動(dòng)子系統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)的制備與在黑素瘤細(xì)胞中的測(cè)試a)所用質(zhì)粒的克隆根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)由具有不同下游連續(xù)核苷酸序列的下列構(gòu)建體組成RTA構(gòu)建體(圖5A)RTA(重組轉(zhuǎn)錄激活物)質(zhì)粒編碼一種融合蛋白，該融合蛋白由Gal4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄因子NF-YA的富含絲氨酸、蘇氨酸和谷氨酰胺的反式激活結(jié)構(gòu)域組成。
-CMV-GN Gal4(As 1-147)，接頭ATA GGC CGG GCC(SEQID NO:11)，在CMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(pcDNA3的nts 232-863,Invitrogen)控制下的mNF-YA(As 1-261+終止密碼子(TAG)),SV40-PolyA(圖7A)(Li等人，生物化學(xué)雜志267,8984-8990(1992))-Tyr-GN Gal4(As 1-147)，接頭ATA GGC CGG GCC(SEQID NO:11)，在酪氨酸酶啟動(dòng)子(見(jiàn)構(gòu)建體Tyr)控制下的mNF-YA(As1-261+終止密碼子(TAG)),SV40-PolyA(圖7B)(Li等人，生物化學(xué)雜志267,8984-8990(1992))-Tyr-GN在酪氨酸酶啟動(dòng)子控制下的Gal4-終止子(As 1-147+終止密碼子(TAG)),SV40-PolyA(圖7C)報(bào)道基因構(gòu)建體-5G25C 與Ⅰ)中的報(bào)道基因構(gòu)建體1)相同-5G25CRT7與Ⅰ)中的報(bào)道基因構(gòu)建體2)相同-8GCycA 8×Gal4 DNA結(jié)合位點(diǎn)+細(xì)胞周期蛋白A啟動(dòng)子(-40/+94；Henglein等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)91,5490-5494(1994))(圖8A)-8GCycART7 類似于8GCycA，含有突變的CDE(TCGCGGG→TCGCtGG,Zwicker等人，EMBO J.14:4514,1995)(圖8B)Gal4 DNA結(jié)合位點(diǎn)5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’,SEQ IDNO:6對(duì)照構(gòu)建體-基礎(chǔ)=“pGL3基礎(chǔ)”(Promega，不含啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)(圖9A)-SV40p=“pGL3啟動(dòng)子”(Promega，含猿猴病毒40基礎(chǔ)啟動(dòng)子)，與Ⅰ中的對(duì)照構(gòu)建體1相同(圖6A)-Tyr 酪氨酸酶啟動(dòng)子2×遠(yuǎn)端因子(TDE,-2014/-1811)和1×近端因子(TPE,-209/+51)(Shibata等人，生物化學(xué)雜志267,20584(1992))，螢光素酶cDNA(pGL3,Promega)(圖9B)
-cdc25C cdc25C啟動(dòng)子(-290/+121)(Lucibello等人，EMBO J.14,132-142(1995))，螢光素酶cDNA(pGL3,Promega)；與Ⅰ中的對(duì)照構(gòu)建體3相同(圖6C)-cycA 細(xì)胞周期蛋白A啟動(dòng)子(-214/+100)(Henglein等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)91,5490-5494(1994))，螢光素酶cDNA(pGL3,Promega)；與Ⅰ中的對(duì)照構(gòu)建體2相同(圖6B)在全部報(bào)道基因構(gòu)建體和對(duì)照構(gòu)建體中pGL3(Promega，螢光素酶cDNA報(bào)道基因)都用作載體。利用PCR從人類基因組DNA中擴(kuò)增已克隆到該載體中的啟動(dòng)子元件。用于此目的的寡核苷酸在每種情況中都含有4個(gè)核苷酸的突出端(GATC)，隨后是含有需要的限制酶切位點(diǎn)的6個(gè)核苷酸(對(duì)于對(duì)照質(zhì)粒cdc25C和cycA和報(bào)道基因質(zhì)粒5G25C和5G25CRT7是BamHⅠ(GGATTC)/HindⅢ(AAGCTT)；對(duì)于TDE是KpnⅠ(GGTACC)/NheⅠ(GCTAGC)和NheⅠ/XhoⅠ(CTCGAG)，對(duì)于TPE是XhoⅠ/BglⅡ(AGATCT)，對(duì)于報(bào)道基因質(zhì)粒8GCycA和8GCycART7是BglⅡ/HindⅢ)，之后是互補(bǔ)于待擴(kuò)增的啟動(dòng)子的20-25個(gè)核苷酸(開(kāi)始于括號(hào)中所示的與轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)有關(guān)的位點(diǎn))。括號(hào)中所表示的位置是指引用的參考文獻(xiàn)中提及的序列。
按照使用說(shuō)明書(shū)，用QIAquickTM自旋柱(Qiagen)純化PCR產(chǎn)物，用相關(guān)限制酶消化(這些酶可商品獲得)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，然后再次用QIAquickTM自旋柱純化。
將Gal4結(jié)合位點(diǎn)合成為具有相關(guān)限制酶切位點(diǎn)所需突出端的寡核苷酸(KpnⅠ(頂5’；底3’)/XhoⅠ(頂5’；底3’)或BamHⅠ(頂5’；底3’)/BglⅡ(頂5’；底3’))，用SephadexG25(Pharmacia)純化，并雜交。
隨后用T4 DNA連接酶(Promega)將消化的PCR產(chǎn)物和雜交的寡核苷酸連接到以適當(dāng)方法酶切的載體中，并純化。
對(duì)通過(guò)PCR和利用寡核苷酸獲得的所有構(gòu)建體測(cè)序，以確保不存在突變。
b)報(bào)道基因測(cè)定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、同步化和螢光素酶測(cè)定利用瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染測(cè)定a)中所述構(gòu)建體在黑素細(xì)胞(MeWo，人)、成纖維細(xì)胞(3T3，鼠)和前列腺癌細(xì)胞(PC-3，人)中的啟動(dòng)子活性，隨后測(cè)定螢光素酶活性。按照使用說(shuō)明書(shū)用DOTAP(Boehringer,Mannheim)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。
如Lucibello等人(EMBO J.14,132(1995))所述進(jìn)行螢光素酶測(cè)定。每個(gè)3.5cm平皿，用6ml DOTAP轉(zhuǎn)染1mg報(bào)道基因+2mg RTA質(zhì)粒，在對(duì)照中，用pUC19質(zhì)粒代替RTA質(zhì)粒。
為了測(cè)定細(xì)胞周期依賴的啟動(dòng)子活性，將增殖的細(xì)胞(完全培養(yǎng)基)與停止于細(xì)胞周期G1期的細(xì)胞相比較。非細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的構(gòu)建體SV40p用于標(biāo)準(zhǔn)化(其活性確定為1)。通過(guò)使其甲硫氨酸饑餓60小時(shí)而使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后同步化于G1期。
為了測(cè)定細(xì)胞周期特異的啟動(dòng)子活性，標(biāo)準(zhǔn)化不同細(xì)胞型的螢光素酶活性，然后將其與普遍存在的SV40啟動(dòng)子的值相比較(SV40p=1)。
c)結(jié)果表1顯示該系統(tǒng)的明顯的細(xì)胞周期特異性(1)8GCycA構(gòu)建體只顯示低活性，其處于基礎(chǔ)載體“basic”的活性范圍內(nèi)，(2)CMV-GN構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致所有3種細(xì)胞系的明顯激活，(3)Tyr-GN構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)染通過(guò)選擇性表達(dá)Gal-NF-Y融合蛋白只導(dǎo)致靶細(xì)胞即黑素瘤細(xì)胞中的特異激活，(4)Tyr-G構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)染只引起極弱的激活，即，(3)中的激活可能歸因于NF-YA反式激活結(jié)構(gòu)域。
8GCycA+Tyr-GN系統(tǒng)的特異性是58(對(duì)比MeWo:PC-3)或73(對(duì)比MeWo:3T3)，非靶細(xì)胞中只有極弱的活性。
表2中的值證實(shí)該系統(tǒng)的活性是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的-細(xì)胞周期蛋白A啟動(dòng)子證明細(xì)胞周期調(diào)節(jié)增強(qiáng)26倍(增殖的MeWo的活性G1中的MeWo活性，陽(yáng)性對(duì)照)-8GCvcA+Tyr-GN系統(tǒng)證明細(xì)胞周期調(diào)節(jié)增強(qiáng)22.5倍(因此調(diào)節(jié)幾乎等于細(xì)胞周期蛋白A野生型啟動(dòng)子，增殖細(xì)胞中的活性幾乎相同)，并且-CDE元件的突變(RT7)導(dǎo)致G1細(xì)胞中活性顯著提高，從而細(xì)胞周期調(diào)節(jié)降低5倍。因此細(xì)胞周期調(diào)節(jié)可能主要?dú)w因于G1中CDE/CHR介導(dǎo)的抑制(由CDE/CHR結(jié)合阻抑物引起，其在G1細(xì)胞中抑制NF-YA引起的反式激活)。其余的RT7突變體的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)可能歸因于酪氨酸酶啟動(dòng)子本身的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，它也是很低的(4.2倍)。
表3和表4證明，當(dāng)使用cdc25C-CDE/CHR元件時(shí)，該系統(tǒng)不僅顯示明顯的細(xì)胞型特異性(3.9倍)，而且顯示明顯的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)(8.4倍)。
因此通過(guò)舉例的方式能證明Gal-NF-Y融合蛋白的組織特異性表達(dá)，其通過(guò)CDE/CHR元件上游Gal4 DNA結(jié)合位點(diǎn)控制基因以組織特異地和以增殖依賴方式表達(dá)。當(dāng)使用黑素細(xì)胞特異的酪氨酸酶啟動(dòng)子和細(xì)胞周期蛋白A-CDE/CHR元件時(shí)，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)提高20倍以上，而細(xì)胞型特異性提高50倍以上。該系統(tǒng)在增殖的靶細(xì)胞中的活性類似于野生型細(xì)胞周期蛋白A啟動(dòng)子的活性，在未增殖的靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞中高于基礎(chǔ)載體pGL3basic。
為了在TNF-α生物測(cè)定中獲得可能的最高轉(zhuǎn)染率，按照使用說(shuō)明書(shū)將MeWo細(xì)胞與lipofectin(Life Technologies)一起使用。1μg Gal CycATNF和1μg pUC19或Tyr-GN與10μl lipofectin在OptiMEM中混合，用其溫育細(xì)胞6小時(shí)。
在三個(gè)平行批次中用Gal Cyc ATNF/pUC19或Gal Cyc ATNF/Tyr-GN共轉(zhuǎn)染MeWo細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，替換培養(yǎng)基，再過(guò)24小時(shí)后，收集。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)上清液對(duì)被轉(zhuǎn)化的小鼠成纖維細(xì)胞系L929的細(xì)胞毒性，測(cè)定其TNFα生物活性。將這些L929細(xì)胞以4×104細(xì)胞/孔的密度接種于微量滴定板中。待16小時(shí)后，在未轉(zhuǎn)染的MeWo細(xì)胞條件培養(yǎng)液和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液中連續(xù)稀釋小鼠TNFα，并在每種情況中加入放線菌素D至1μg/ml的終濃度。待24小時(shí)后，固定剩余的L929細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色，用ELISA讀板器在λ=450nm的波長(zhǎng)下定量附著的染料。
轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，細(xì)胞溶解大約為60％(對(duì)應(yīng)于上清液中～1.0ng/mlTNFα)。相反，只用Gal Cyc ATNF效應(yīng)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液只顯示可忽略的小比例死細(xì)胞(＜2％)。這些結(jié)果表明，利用根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄率適于達(dá)到明顯的生物效應(yīng)。表1構(gòu)建體螢光素酶活性(RLU,SV40p=1)MeWo 3T3 PC-3Basic 0.01 0.01 0.07SV40p 1.00 1.00 1.00Tyr57.6 0.03 0.058GcycA 0.04 0.02 0.068GcycA+CMV-GN 3.39 0.42 1.358GcycA+Tyr-GN 2.92 0.04 0.058GcycA+Tyr-G 0.18 0.02 0.02表2構(gòu)建體螢光素酶活性(RLU,SV40p=1)增殖的MeWoG1期的MeWoBasic0.01 0.05SV40p1.00 1.00Tyr 57.60 13.60CycA 3.38 0.138GcycA 0.01 0.078GcycA+Tyr-GN2.70 0.128GcycART70.04 0.058GcycART7+Tyr-GN 7.25 1.44表3構(gòu)建體螢光素酶活性(RLU,SV40p=1)MeWo 3T3SV40p1.00 1.005G25C0.05 0.145G25C+CMV-GN 6.50 7.135G25C+Tyr-GN 5.46 1.39表4構(gòu)建體螢光素酶活性(RLU,SV40p=1)增殖的MeWo G1期的MeWoSV40p1.001.00cdc25C 1.080.115G25C0.050.225G25C+Tyr-GN 5.460.655G25CRT7 0.000.175G25CRT7+Tyr-GN 3.982.58
附圖要點(diǎn)圖1-4根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體圖5Ⅰ的RTA構(gòu)建體和報(bào)道基因構(gòu)建體的示意6Ⅰ的對(duì)照構(gòu)建體的示意圖。細(xì)線pGL3載體，Promega；粗線pGL3的MCS中的啟動(dòng)子圖7Ⅱ的RTA構(gòu)建體的示意圖，載體骨架來(lái)源于pGL3(Promega)圖8Ⅱ的報(bào)道基因構(gòu)建體的示意9Ⅱ的對(duì)照構(gòu)建體的示意圖。細(xì)線pGL3載體，Promega；粗線pGL3的MCS中的啟動(dòng)子序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH(B)街道-(C)城市Frankfurt/M.
(D)聯(lián)邦州-(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼65926(G)電話069-305-3005(H)傳真069-357175(I)電傳-(ⅱ)發(fā)明名稱包含具重組轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的嵌合啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)(ⅲ)序列數(shù)目11(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ.ID.NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Myc E Box(B)位置1..26
(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.1的序列描述GGAAGCAGAC CACGTGGTCT GCTTCC26(2)SEQ.ID.NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Myc D E Box(B)位置1..17(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.2的序列描述AGCAGGTGTT GGGAGGC17(2)SEQ.ID.NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Myosin重鏈基因(B)位置1..41(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.3的序列描述GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G41(2)SEQ.ID.NO.4的信息
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Gal 4結(jié)合位點(diǎn)(B)位置1..17(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.4的序列描述CGGACAACTG TTGACCG17(2)SEQ.ID.NO.5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Gal 4結(jié)合位點(diǎn)(B)位置1..17(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.5的序列描述CGGAGGACTG.TCCTCCG17(2)SEQ.ID.NO.6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Gal 4結(jié)合位點(diǎn)(B)位置1..17(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.6的序列描述CGGAGTACTG TCCTCCG17(2)SEQ.ID.NO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Lex A結(jié)合位點(diǎn)(B)位置1..20(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.7的序列描述TACTGTATGT ACATACAGTA20(2)SEQ.ID.NO.8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Lac操縱子結(jié)合序列
(B)位置1..21(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.8的序列描述GAATTGTGAG GCTCACAATT C21(2)SEQ.ID.NO.9的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞tet O結(jié)合序列(B)位置1..42(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.9的序列描述TCGAGTTTAC CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA AG42(2)SEQ.ID.NO.10的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞ZFH D-1結(jié)合序列(B)位置1..12(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.10的序列描述TAATGATGGG CG12(2)SEQ.ID.NO.11的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞接頭(B)位置1..12(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.11的序列描述ATAGGCCGGG CC1權(quán)利要求
1．一種核酸構(gòu)建體，其含有下列組分-組分a)至少一種啟動(dòng)子-組分b)編碼至少一種重組反式激活蛋白的DNA，其表達(dá)被組分a)激活，并含有●組分b1)編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA●組分b2)編碼富含谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸的反式激活結(jié)構(gòu)域的DNA-組分c)至少一種結(jié)合組分b)的表達(dá)產(chǎn)物的DNA序列-組分d)至少一種最小啟動(dòng)子，其含有CDE-CHR元件或E2FBS-CHR元件，其5’端與組分c)的3’端結(jié)合-組分e)至少一種效應(yīng)基因，其轉(zhuǎn)錄被與組分c)結(jié)合的組分b)的表達(dá)產(chǎn)物激活。
2．權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中至少一種組分c)與組分a)的5’端連接，并且該表達(dá)系統(tǒng)是自擴(kuò)增的。
3．一種含有組分b’)的根據(jù)權(quán)利要求1或2的核酸構(gòu)建體，其中-組分b1)與編碼結(jié)合偶聯(lián)物f)的蛋白A之組分b3)偶聯(lián)，并且-組分b2)與編碼也結(jié)合偶聯(lián)物f)的蛋白B的組分b4)偶聯(lián)，并且-其中偶聯(lián)物f)與組分b1)、b3)、b4)和b2)的表達(dá)產(chǎn)物連接，產(chǎn)生一種可操縱的重組反式激活蛋白。
4．一種含有組分b”)的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中組分b1)和b2)與編碼至少一種細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合蛋白的組分b5)連接，細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白與相應(yīng)結(jié)合蛋白的結(jié)合抑制組分b”)表達(dá)的反式激活蛋白的功能。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中多種相同或不同的效應(yīng)基因[組分e)、e’)、e”)]通過(guò)IRES序列或通過(guò)由組分c)和d)組成的激活序列彼此連接。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中核定位信號(hào)與組分b)、b’)或b”)連接。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中組分a)中存在的啟動(dòng)子選自-非特異性啟動(dòng)子序列，其選自RNA聚合酶Ⅲ或RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，SV40啟動(dòng)子；-病毒啟動(dòng)子和激活序列，其選自HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、HIV的這些序列；-細(xì)胞周期特異性激活的啟動(dòng)子序列，其選自cdc25C、細(xì)胞周期蛋白A、cdc2(cdk-1)、Bmyb、DHFR、E2F-1基因的這些序列，或以細(xì)胞增殖依賴方式發(fā)生或被激活的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合序列，如Myc E盒的單體或多聚體；-細(xì)胞特異激活的啟動(dòng)子，其選自可在內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、白血病細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞、胃腸粘膜細(xì)胞、腎細(xì)胞、呼吸器官細(xì)胞、性器官細(xì)胞、下泌尿道的細(xì)胞中細(xì)胞特異激活的啟動(dòng)子；-可代謝激活的啟動(dòng)子，其選自低氧誘導(dǎo)的增強(qiáng)子序列。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中組分b1)選自來(lái)源于Gal4蛋白、LexA蛋白、lac阻抑蛋白、四環(huán)素阻抑蛋白或ZFHD1蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
9．根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中組分b2)選自總共含有至少20×谷氨酰胺、10×絲氨酸和10×蘇氨酸的反式激活結(jié)構(gòu)域。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的核酸構(gòu)建體，其中組分b2)選自O(shè)ct-2、SP1和NFY-1的反式激活結(jié)構(gòu)域。
11．根據(jù)權(quán)利要求3-10中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中-在組分b3)或b4)中，至少與偶聯(lián)結(jié)構(gòu)f)結(jié)合的蛋白A和B之一是重組抗體或重組抗體片段。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的核酸構(gòu)建體，其中-至少與偶聯(lián)物f)結(jié)合的蛋白A和B之一是單鏈Fv片段，其含有通過(guò)一短肽序列共價(jià)連接的可變鏈和輕鏈。
13．根據(jù)權(quán)利要求3-12中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中至少與偶聯(lián)物f)結(jié)合的蛋白A和B之一構(gòu)成了所述組分f)的天然存在的結(jié)合蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
14．根據(jù)權(quán)利要求3-13中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中偶聯(lián)物f)是一種藥物。
15．根據(jù)權(quán)利要求3-13中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中偶聯(lián)物f)是一種能通過(guò)細(xì)胞膜穿入細(xì)胞中的物質(zhì)。
16．根據(jù)權(quán)利要求14或15中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中偶聯(lián)物f)選自納巴霉素、FK506、環(huán)孢素A、氨甲蝶呤、葉酸、視黃酸、青霉素、4-羥基-三苯氧胺、三苯氧胺、四環(huán)素或四環(huán)素/異丙基-β-D-硫代半乳糖苷綴合物。
17．根據(jù)權(quán)利要求4-16中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合序列[組分b5]]是一種細(xì)胞結(jié)合蛋白或該結(jié)合蛋白的部分。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的核酸構(gòu)建體，其中細(xì)胞結(jié)合蛋白或該結(jié)合蛋白的部分可與選自p53、pRb、p130、Max、MAD、VHL、cdk-4、MTS-1(p16)、WT-1、SMAD-2、DPC-4的細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合。
19．根據(jù)權(quán)利要求17的核酸構(gòu)建體，其中組分b5)選自如下的細(xì)胞結(jié)合蛋白E2F1、E2F2、E2F3、E2F4、E2F5、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白D2、細(xì)胞周期蛋白D3或細(xì)胞周期蛋白C、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白E、Myc、轉(zhuǎn)錄因子PU.1或Elf-1、elongin B、elongin C、p14、p15、p16、p18、p21、p27、p53、Myc、cdk-4、DPC-4和SMAD-2。
20．根據(jù)權(quán)利要求17的核酸構(gòu)建體，其中細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合序列[組分b5]]是一種病毒結(jié)合蛋白或該結(jié)合蛋白的部分。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的核酸構(gòu)建體，其中該病毒結(jié)合蛋白或該結(jié)合蛋白的部分可與選自p53、pRb(p110)、NFKB、p130、CBF-1、lyn酪氨酸激酶、bak和bax的細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合。
22．根據(jù)權(quán)利要求20的核酸構(gòu)建體，其中組分b5)選自如下的病毒結(jié)合蛋白CMV的IE84、AV的E1B(55kD)、EBV的EBNA-5、EBV的BHFR、HPV16或HPV18的E6、HBV的x蛋白、SV40的T抗原、AV的E1A、EBV的EBNA-2、EBV的EBNA-1、HPV的E7、HIV的Tax、EBV的LMP-1、EBV的LMP-2A或LMP-2B、AV的E1B(16kD)、AV的E1B(10kD)。
23．根據(jù)權(quán)利要求4的核酸構(gòu)建體，其中細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合序列[組分b5]]是一種抗體或該抗體的部分。
24．根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中結(jié)合組分b)、b’)或b”)的DNA序列[組分c)]選自Gal4蛋白結(jié)合序列、LexA蛋白結(jié)合序列、Lac1阻抑蛋白結(jié)合序列、四環(huán)素操縱子結(jié)合序列和ZFHD-1蛋白結(jié)合序列。
25．根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中含有CDE-CHR的最小啟動(dòng)子[組分d)]選自cdc25C基因、cdc2(cdk-1)基因和細(xì)胞周期蛋白A基因。
26．根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中含有E2FBS-CHR的最小啟動(dòng)子[組分d]]選自Bmyb基因。
27．根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中效應(yīng)基因(組分c)是編碼一種活性物質(zhì)的基因，該活性物質(zhì)選自細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子、具有抗增殖或細(xì)胞抑制或凋亡作用的蛋白質(zhì)、炎性或免疫抑制蛋白、抗體、抗體片段、血管生成抑制劑、肽激素、凝固因子、凝固抑制物、纖溶蛋白、對(duì)血液循環(huán)有效的肽或蛋白質(zhì)、血漿蛋白，和病原體或細(xì)胞或腫瘤抗原、引起免疫反應(yīng)的所選的抗原。
28．根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中效應(yīng)基因是一種編碼可將前體藥物切割為藥物的酶的基因。
29．根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中效應(yīng)基因是一種編碼配體/活性物質(zhì)融合蛋白或配體/酶融合蛋白的基因，該配體選自細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、抗體、抗體片段、肽激素、介質(zhì)和細(xì)胞粘附分子。
30．根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中核酸是DNA。
31．根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中核酸構(gòu)建體被插入載體中。
32．根據(jù)權(quán)利要求30的核酸構(gòu)建體，其為一種質(zhì)粒載體。
33．根據(jù)權(quán)利要求30的核酸構(gòu)建體，其為一種病毒載體。
34．根據(jù)權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其被外部、經(jīng)口、血管內(nèi)、經(jīng)鼻、支氣管內(nèi)施用或施用入胃腸道，或被皮下注射到器官、體腔、肌肉系統(tǒng)中，或注射于血液循環(huán)中，用于預(yù)防或治療疾病。
35．一種分離的細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體。
36．根據(jù)權(quán)利要求35的分離的細(xì)胞，該細(xì)胞選自內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、造血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、胃腸道、呼吸系統(tǒng)、下泌尿道、性器官、皮膚的上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞。
37．根據(jù)權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求33的細(xì)胞的應(yīng)用，用于制備可治療下列疾病的藥物，所述疾病選自感染、腫瘤、白血病、自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)、各型關(guān)節(jié)炎、炎癥、器官排斥、移植物抗宿主反應(yīng)、血凝固疾病、循環(huán)疾病、貧血、激素疾病和CNS的損傷。
38．一種制備根據(jù)權(quán)利要求1-37中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體的方法，其中逐步將各個(gè)組分連接在一起。
39．根據(jù)權(quán)利要求35或36中任一項(xiàng)的細(xì)胞的應(yīng)用，用于制備可治療權(quán)利要求32中的疾病的藥物，其中至少一種細(xì)胞被外部、血管內(nèi)、經(jīng)鼻、支氣管內(nèi)、經(jīng)口施用或施用于胃腸道中，或皮下注射到器官、體腔、肌肉系統(tǒng)中，或注射于血液循環(huán)中，用于預(yù)防或治療疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸構(gòu)建體,其特征在于其含有下列組分:組分a):至少一種啟動(dòng)子,組分b):編碼至少一種重組反式激活蛋白的DNA,由此其轉(zhuǎn)錄被a)激活,并含有組分b1):編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA,組分b2):編碼富含谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸的反式激活結(jié)構(gòu)域的DNA。組分c):至少一種可結(jié)合組分b)的表達(dá)產(chǎn)物的DNA序列。組分d):至少一種最小啟動(dòng)子,其含有CDE－CHR元件或E2F－BS－CHR元件,并且其5’端與組分c)的3’端結(jié)合。組分e):至少一種效應(yīng)基因,由此其轉(zhuǎn)錄由于組分b)的表達(dá)產(chǎn)物與組分c)結(jié)合而被激活。本發(fā)明也涉及所述核酸構(gòu)建體、含有該核酸構(gòu)建體的載體、含有該載體的細(xì)胞的產(chǎn)生和用途,并涉及該核酸構(gòu)建體在藥物生產(chǎn)中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1309716SQ99808528
公開(kāi)日2001年8月22日 申請(qǐng)日期1999年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月14日
發(fā)明者R·穆勒, D·奈特爾博科, H－H·塞德拉賽克 申請(qǐng)人:阿文蒂斯藥物德國(guó)有限公司