本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及梨遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及梨果皮全紅芽變性狀位點(diǎn)的分子標(biāo)記及其引物和應(yīng)用。

技術(shù)背景

梨是國際性的大宗水果，也是我國的主要水果之一，其果實(shí)營養(yǎng)豐富，味美多汁，香甜可口，深受人民的喜愛。果皮顏色是最能吸引人們注意的果實(shí)性狀之一，是果實(shí)品質(zhì)和商品性的重要組成部分。近年來，健康消費(fèi)的觀念日益深入人心，紅色梨被認(rèn)為具有更高的健康價(jià)值而受到市場的青睞，紅色梨品種的選育也日益受到各國梨育種研究機(jī)構(gòu)的重視。在我國，紅皮梨種植面積較小，現(xiàn)有紅皮梨資源多為幼果期不著色、在果實(shí)發(fā)育中后期著色，著色狀況受環(huán)境條件影響較大的陽面紅暈類型；而西洋梨品種‘巴梨’的全紅型芽變品種‘紅巴梨’以及我國‘早酥’梨的全紅型芽變品種‘紅早酥’的果實(shí)在幼果期即全面著紅色，且能一直保持，受環(huán)境條件影響較小，利用這些全紅型芽變品種做親本，可望選育出在我國北方和南方均能著色良好的紅皮梨新品種。

目前，在梨育種工作中主要采用的是傳統(tǒng)的雜交育種手段，雜交種子培育成苗，并度過數(shù)年的童齡期結(jié)果之后，再對(duì)所有雜種單株生長結(jié)果性狀進(jìn)行后期評(píng)價(jià)，根據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果決定留下和淘汰的雜種單株。該方法的育種周期長、占地面積大、耗時(shí)耗力，育種效率低。近年來，分子生物學(xué)迅速發(fā)展并與作物遺傳育種相結(jié)合，產(chǎn)生了分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)，使得對(duì)傳統(tǒng)雜交育種獲得的雜交單株進(jìn)行提早選擇和高效選擇成為可能。梨全紅型芽變品種的紅皮性狀分子標(biāo)記用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，則可以大大提高以該類型品種為親本的紅皮梨育種選擇效率，節(jié)約雜交單株種植養(yǎng)護(hù)和調(diào)查考種的成本，促進(jìn)我國梨育種由常規(guī)育種向分子育種手段轉(zhuǎn)變。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種梨果皮全紅芽變性狀位點(diǎn)及與該位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，設(shè)計(jì)了其引物，并在以該類型品種為親本的紅皮梨育種選擇中進(jìn)行了應(yīng)用，為紅皮梨的鑒定提供了新方法，提高了紅皮梨育種的準(zhǔn)確性和選擇效率。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)的

一種梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)的indel分子標(biāo)記，該indel分子標(biāo)記為in1579-1，所述的分子標(biāo)記in1579-1的indel位點(diǎn)位于梨基因組登錄號(hào)為nw_008988579.1的組裝scaffold上的23081bp處，插入缺失序列為attattttttta或attatttttttattttttta(插入缺失的兩個(gè)序列可能只出現(xiàn)一個(gè)也可能兩個(gè)同時(shí)出現(xiàn))。

上述梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)的indel分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記in1579-1的擴(kuò)增產(chǎn)物序列為：catgttacaggtccaaccttctttccttttattatttttttaaatgtttttggattctggatttcagattgcaatagg(78)以及catgttacaggtccaaccttctttccttttattatttttttatttttttaaatgtttttggattctggatttcagattgcaatagg(86)中的一個(gè)或兩個(gè)。雜種后代在in1579-1標(biāo)記位點(diǎn)的標(biāo)記基因型為78/86(擴(kuò)增出78bp和86bp兩條帶)即為紅皮后代，標(biāo)記基因型為78/78(只擴(kuò)增出一條78bp的條帶)即為綠皮后代。

一種上述梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)的indel分子標(biāo)記的引物，所述indel分子標(biāo)記in1579-1的引物序列為：

上游引物序列為(seqidno.11)：5'-catgttacaggtccaacctt-3'，

下游引物序列為(seqidno12)：5'-cctattgcaatctgaaatcc-3'。

一種梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)的indel分子標(biāo)記，該indel分子標(biāo)記為in1400-1，所述的分子標(biāo)記in1400-1的indel位點(diǎn)位于梨基因組登錄號(hào)為nw_008988400.1的scaffold上的161533bp處，插入缺失序列為g或gtta(插入缺失的兩個(gè)序列可能只出現(xiàn)一個(gè)也可能兩個(gè)同時(shí)出現(xiàn))。

上述梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)的indel分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記in1400-1的擴(kuò)增產(chǎn)物序列為：caaggaccaaagtcacgtattagttattatctaaacggtaagactttttctttttacattttgatccatcaagatttcaaattcctccaaatagtactcttttcctaaagtcgaaga(117)以及caaggaccaaagtcacgtattagttattatctaaacggtaagactttttctttttacattttgatccatcaagatttcaaattcctccaaatagttatactcttttcctaaagtcgaaga(120)中的一個(gè)或兩個(gè)。雜種后代在in1400-1標(biāo)記位點(diǎn)的標(biāo)記基因型為117/117(只擴(kuò)增出一條117bp的條帶)即為紅皮后代，標(biāo)記基因型為117/120(擴(kuò)增出117bp和120bp兩條帶)即為綠皮后代。

一種上述梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)的indel分子標(biāo)記的引物，所述indel分子標(biāo)記in1400-1的引物序列為：

上游引物序列為(seqidno.21)：5'-caaggaccaaagtcacgtat-3'，

下游引物序列為(seqidno.22)：5'-tcttcgactttaggaaaagagt-3'。

上述的梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)的indel分子標(biāo)記，所述梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)命名為red，位于梨的第四號(hào)染色體上，具體位于登錄號(hào)為nw_008988579.1的組裝scaffold和登錄號(hào)為nw_008988400.1的組裝scaffold上面及其之間的基因組范圍內(nèi)。

上述梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)的indel分子標(biāo)記的篩選方法，包括以下步驟：

(1)選擇以果皮全紅型芽變品種‘t109’為母本、‘紅早酥’為父本雜交得到的144棵f1單株及2份親本材料作為分子標(biāo)記篩選的研究群體；

(2)利用常規(guī)的ctab法提取步驟(1)所述雜交得到的8份f1紅皮單株幼嫩葉片的dna和8份f1綠皮單株幼嫩葉片的dna；

(3)采用indel標(biāo)記引物對(duì)步驟(2)得到的8份f1紅皮單株幼嫩葉片的dna和8份f1綠皮單株幼嫩葉片的dna進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr擴(kuò)增反應(yīng))；并將擴(kuò)增產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰氨凝膠上進(jìn)行電泳分離分析，然后篩選出在紅皮樣品和綠皮樣品間有多態(tài)的引物；如圖1所示；

該步驟所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增體系為20μl的反應(yīng)體系：extaq0.1μl；10×buffer2μl；dntps(2.5mmeach)1.6μl；forwardprimer(10μm)0.6μl；rewardprimer(10μm)0.6μl；dna(10ng/μl)1μl，加入雙蒸餾水補(bǔ)足至20μl；

該步驟所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性20s，30個(gè)循環(huán)的98℃10s，55℃30s，72℃45s，72℃10min，擴(kuò)增完成后在10℃條件下保存；

(4)采用常規(guī)的ctab法提取步驟(1)所述144棵f1單株及2份親本材料的幼嫩葉片的dna，并以步驟(3)所述篩選出的在紅皮樣品和綠皮樣品間有多態(tài)的引物對(duì)該步驟提取的144棵f1單株及2份親本材料的幼嫩葉片dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)及電泳分離分析，方法同步驟(2)、(3)；

(5)按照joinmap4.0軟件中的“cp”群體作圖模式(lm×ll、nn×np、hk×hk、ef×eg、ab×cd等5種分離類型)進(jìn)行電泳條帶統(tǒng)計(jì)，無擴(kuò)增或擴(kuò)增不清晰的標(biāo)記記為“--”；

(6)在joinmap4.0軟件中設(shè)置lod最小值為4.0，利用kosambi作圖函數(shù)計(jì)算梨全紅型芽變性狀位點(diǎn)與indel標(biāo)記間的遺傳距離，再利用mapchart繪制梨全紅型芽變性狀位點(diǎn)與indel標(biāo)記間的連鎖圖；

(7)分子標(biāo)記in1400-1與‘紅早酥’梨果皮全紅芽變性狀位點(diǎn)red的重組率為0.0210，lod值為36.79，連鎖距離為2.1cm；分子標(biāo)記in1579-1與‘紅早酥’梨果皮全紅芽變性狀位點(diǎn)red的重組率為0.0139，lod值為38.77，連鎖距離為1.4cm。分子標(biāo)記in1400-1和in1579-1與‘紅早酥’梨果皮全紅芽變性狀位點(diǎn)red均存在緊密連鎖關(guān)系，可以作為該性狀位點(diǎn)的分子標(biāo)記。

上述梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)red的indel分子標(biāo)記in1579-1或梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)red的indel分子標(biāo)記in1400-1在紅皮梨輔助選擇育種中的應(yīng)用。

上述indel分子標(biāo)記的篩選方法在紅皮梨輔助選擇育種中的應(yīng)用。

上述梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)的indel分子標(biāo)記in1579-1或in1400-1在紅皮梨輔助選擇育種中的應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)以果皮全紅型芽變品種‘t109’為母本、‘紅早酥’為父本進(jìn)行雜交得到f1單株；

(2)采用常規(guī)的ctab法提取步驟(1)雜交組合群體f1單株幼嫩葉片的dna；

(3)以分子標(biāo)記in1579-1或in1400-1的引物對(duì)為引物對(duì)步驟(2)得到的f1單株幼嫩葉片的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

所述的pcr擴(kuò)增體系為20μl的反應(yīng)體系：extaq0.1μl；10×buffer2μl；dntps(2.5mmeach)1.6μl；forwardprimer(10μm)0.6μl；rewardprimer(10μm)0.6μl；dna(10ng/μl)1μl，加入雙蒸餾水補(bǔ)足至20μl；

所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性20s；30個(gè)循環(huán)的98℃10s，55℃30s，72℃45s；72℃10min，之后在10℃條件下保溫；

(4)將步驟(3)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰氨凝膠上進(jìn)行電泳分離分析；

(5)根據(jù)步驟(4)得到的電泳條帶的標(biāo)記基因型(如圖1)判斷單株的紅皮表型和綠皮表型，并根據(jù)育種目標(biāo)選擇雜種后代。雜種后代在in1400-1標(biāo)記位點(diǎn)的標(biāo)記基因型為117/117(只擴(kuò)增出一條117bp的條帶)即為紅皮后代，標(biāo)記基因型為117/120(擴(kuò)增出117bp和120bp兩條帶)即為綠皮后代。雜種后代在in1579-1標(biāo)記位點(diǎn)的標(biāo)記基因型為78/86(擴(kuò)增出78bp和86bp兩條帶)即為紅皮后代，標(biāo)記基因型為78/78(只擴(kuò)增出一條78bp的條帶)即為綠皮后代。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下積極有益效果

(1)本發(fā)明采用分子標(biāo)記的方法對(duì)紅皮梨進(jìn)行輔助選擇育種，在苗期即可進(jìn)行提前選擇，而不必等到結(jié)果以后再進(jìn)行人工選擇，大大提高了紅皮梨育種的選擇效率，節(jié)約了雜種樹養(yǎng)護(hù)管理、科研投入和地租等成本投入，具有較好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益；

(2)‘紅早酥’和‘紅巴梨’分別是東方梨品種‘早酥’和西洋梨品種‘巴梨’的全紅型芽變品種，其果皮紅色不易受到環(huán)境條件的影響，表現(xiàn)穩(wěn)定。本發(fā)明對(duì)‘t109’ב紅早酥’雜交組合群體用in1579-1和in1400-1分子標(biāo)記進(jìn)行分析，這些標(biāo)記能夠?qū)┰嚾后w中的紅皮梨單株進(jìn)行選擇，選擇效率均達(dá)到97.2％以上。

附圖說明

圖1為in1579-1和in1400-1分子標(biāo)記的引物對(duì)為引物，對(duì)‘t109’為母本、‘紅早酥’為父本的f1代8個(gè)紅皮單株和8個(gè)綠皮單株幼嫩葉片dna進(jìn)行擴(kuò)增所得擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶圖；

圖2為梨全紅型芽變性狀位點(diǎn)與indel分子標(biāo)記間的連鎖圖；

圖3為以分子標(biāo)記1579-1的引物對(duì)為引物，對(duì)‘t109’為母本、‘紅早酥’為父本雜交得到的f1代144個(gè)單株的幼嫩葉片dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增所得擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶圖；

圖4為以分子標(biāo)記in1400-1的引物對(duì)為引物，對(duì)‘t109’為母本、‘紅早酥’為父本雜交得到的f1代144個(gè)單株的幼嫩葉片dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增所得擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶圖。

具體實(shí)施例

下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的說明，但是此處所描述的實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下實(shí)施例中所涉及到的原料，如無特別說明均為市售。

實(shí)施例1

材料來源：供試材料為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所雜種圃定植的‘t109’ב紅早酥’雜交組合群體共144個(gè)單株及2份親本材料。

梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)red的indel分子標(biāo)記in1579-1及indel分子標(biāo)記in1400-1的篩選方法，包括以下步驟：

(1)利用常規(guī)的ctab法提取雜交組合群體144個(gè)f1單株及2份親本材料幼嫩葉片的dna；

(2)以indel標(biāo)記引物對(duì)步驟(1)所述提取的雜交組合群體f1單株中的8個(gè)紅皮單株及8個(gè)綠皮單株幼嫩葉片的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；該pcr擴(kuò)增反應(yīng)采用20μl的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系的組成及反應(yīng)程序如下所示：

所述的pcr擴(kuò)增體系為20μl的反應(yīng)體系：extaq0.1μl；10×buffer2μl；dntps(2.5mmeach)1.6μl；forwardprimer(10μm)0.6μl；rewardprimer(10μm)0.6μl；dna(10ng/μl)1μl，加入雙蒸餾水補(bǔ)足至20μl；

所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性20s；30個(gè)循環(huán)的98℃10s，55℃30s，72℃45s，72℃10min，之后在10℃條件下進(jìn)行保溫；

(3)對(duì)步驟(2)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8％非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳、顯影、染色和帶型判讀，然后篩選出在紅皮樣品和綠皮樣品間有多態(tài)的引物，如圖1所示；

(4)采用步驟(3)所述篩選出的在紅皮樣品和綠皮樣品間有多態(tài)的引物對(duì)步驟(1)提取的雜交組合群體144個(gè)f1單株及2份親本材料幼嫩葉片的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)及電泳分離分析，方法同步驟(2)、(3)；

(5)按照joinmap4.0軟件中的“cp”群體作圖模式(lm×ll、nn×np、hk×hk、ef×eg、ab×cd等5種分離類型)進(jìn)行電泳條帶統(tǒng)計(jì)，無擴(kuò)增或擴(kuò)增不清晰的標(biāo)記記為“--”；

(6)在joinmap4.0軟件中設(shè)置lod最小值為4.0，利用kosambi作圖函數(shù)計(jì)算梨全紅型芽變性狀位點(diǎn)與indel標(biāo)記間的遺傳距離，再利用mapchart繪制梨全紅型芽變性狀位點(diǎn)與indel標(biāo)記間的連鎖圖；

(7)分子標(biāo)記in1400-1與‘紅早酥’梨果皮全紅芽變性狀位點(diǎn)red的重組率為0.0210，lod值為36.79，連鎖距離為2.1cm；分子標(biāo)記in1579-1與‘紅早酥’梨果皮全紅芽變性狀位點(diǎn)red的重組率為0.0139，lod值為38.77，連鎖距離為1.4cm。分子標(biāo)記in1400-1和in1579-1與‘紅早酥’梨果皮全紅芽變性狀位點(diǎn)red均存在緊密連鎖關(guān)系，可以作為該性狀位點(diǎn)的分子標(biāo)記。因此這2個(gè)標(biāo)記均可作為與梨果皮全紅芽變性狀位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。

實(shí)施例2

材料來源：供試材料為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所雜種圃定植的‘t109’ב紅早酥’雜交組合得到f1單株群體共144個(gè)單株。

梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)red的indel分子標(biāo)記in1579-1在紅皮梨輔助選擇育種中的應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)利用常規(guī)的ctab法提取雜交組合群體f1單株幼嫩葉片的dna；

(2)以in1579-1分子標(biāo)記的引物對(duì)為引物對(duì)步驟(1)得到的雜交單株的dna進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下所示：

所述的pcr擴(kuò)增體系為20μl的反應(yīng)體系：extaq0.1μl；10×buffer2μl；dntps(2.5mmeach)1.6μl；forwardprimer(10μm)0.6μl；rewardprimer(10μm)0.6μl；dna(10ng/μl)1μl，加入雙蒸餾水補(bǔ)足至20μl；

所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性20s；30個(gè)循環(huán)的98℃10s，55℃30s，72℃45s；72℃10min，之后在10℃條件下進(jìn)行保溫；

(3)對(duì)步驟(2)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8％非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳、顯影、染色和帶型判讀，如圖3所示；

(4)根據(jù)雜交單株對(duì)步驟(3)所得電泳條帶的標(biāo)記基因型來判斷單株的紅皮和綠皮表型，并進(jìn)行育種選擇。雜種后代在in1579-1標(biāo)記位點(diǎn)的標(biāo)記基因型為78/86(擴(kuò)增出78bp和86bp兩條帶)即為紅皮后代，標(biāo)記基因型為78/78(只擴(kuò)增出一條78bp的條帶)即為綠皮后代。

梨果皮全紅型芽變性狀位點(diǎn)red的indel分子標(biāo)記in1400-1在紅皮梨輔助選擇育種中的應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)利用常規(guī)的ctab法提取雜交組合群體f1單株幼嫩葉片的dna；

(2)以in1400-1分子標(biāo)記的引物對(duì)為引物對(duì)步驟(1)得到的雜交單株的dna進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下所示：

所述的pcr擴(kuò)增體系為20μl的反應(yīng)體系：extaq0.1μl；10×buffer2μl；dntps(2.5mmeach)1.6μl；forwardprimer(10μm)0.6μl；rewardprimer(10μm)0.6μl；dna(10ng/μl)1μl，加入雙蒸餾水補(bǔ)足至20μl；

所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性20s；30個(gè)循環(huán)的98℃10s，55℃30s，72℃45s；72℃10min，之后在10℃條件下進(jìn)行保溫；

(3)對(duì)步驟(2)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8％非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳、顯影、染色和帶型判讀，如圖4所示；

(4)根據(jù)雜交單株對(duì)步驟(3)所得電泳條帶的標(biāo)記基因型來判斷單株的紅皮和綠皮表型，并進(jìn)行育種選擇。雜種后代在in1400-1標(biāo)記位點(diǎn)的標(biāo)記基因型為117/117(只擴(kuò)增出一條117bp的條帶)即為紅皮后代，標(biāo)記基因型為117/120(擴(kuò)增出117bp和120bp兩條帶)即為綠皮后代。

統(tǒng)計(jì)2個(gè)分子標(biāo)記在144個(gè)單株中的基因型與單株紅皮綠皮性狀表型匹配的情況，如圖3、圖4所示，2個(gè)分子標(biāo)記均能準(zhǔn)確鑒定出其中至少140個(gè)單株的果皮色澤表型，即準(zhǔn)確率均在97.2％以上。結(jié)果表明：分子標(biāo)記in1579-1或in1400-1均能夠作為梨果皮全紅芽變性狀位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，用于‘紅早酥’梨后代果皮顏色性狀的篩選。

通過上述實(shí)施例可得：通過分子標(biāo)記輔助選育可簡單快速的通過分子標(biāo)記預(yù)測單株表型，成功的將分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)應(yīng)用于梨全紅芽變性狀位點(diǎn)的選擇，顯著降低了育種的工作量和雜種苗養(yǎng)護(hù)成本，極大地提高了育種效率。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所

<120>梨果皮全紅芽變性狀位點(diǎn)的分子標(biāo)記及其引物和應(yīng)用

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<223>分子標(biāo)記in1579-1擴(kuò)增產(chǎn)物序列

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catgttacaggtccaaccttctttccttttattatttttttaaatgtttttggattctgg60

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<223>分子標(biāo)記in1579-1擴(kuò)增產(chǎn)物序列

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catgttacaggtccaaccttctttccttttattatttttttatttttttaaatgtttttg60

gattctggatttcagattgcaatagg86

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<223>分子標(biāo)記in1579-1上游引物序列

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<223>分子標(biāo)記in1579-1下游引物序列

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<223>分子標(biāo)記in1400-1擴(kuò)增產(chǎn)物序列

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caaggaccaaagtcacgtattagttattatctaaacggtaagactttttctttttacatt60

ttgatccatcaagatttcaaattcctccaaatagtactcttttcctaaagtcgaaga117

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<223>分子標(biāo)記in1400-1擴(kuò)增產(chǎn)物序列

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caaggaccaaagtcacgtattagttattatctaaacggtaagactttttctttttacatt60

ttgatccatcaagatttcaaattcctccaaatagttatactcttttcctaaagtcgaaga120

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<223>分子標(biāo)記in1400-1上游引物序列

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<223>分子標(biāo)記in1400-1下游引物序列

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tcttcgactttaggaaaagagt22