本發(fā)明屬于植物病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及蘋(píng)果莖溝病毒侵染性克隆的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

蘋(píng)果是全世界種植最廣泛的重要水果之一。中國(guó)無(wú)論在蘋(píng)果種植面積還是產(chǎn)量方面都是世界第一，約占全世界的四分之一。陜西省是中國(guó)的蘋(píng)果種植大省，種植面積約600000公頃，產(chǎn)量約占世界的12％(張雪陽(yáng)等2005；張黨利等2010；徐立等2010)。然而，蘋(píng)果病毒病的發(fā)生卻嚴(yán)重影響著蘋(píng)果的產(chǎn)量和質(zhì)量(李文慧等2006)。在中國(guó)，侵染蘋(píng)果的主要病毒有蘋(píng)果莖溝病毒(applestemgroovingvirus，asgv)、蘋(píng)果莖痘病毒(applestempittingvirus，aspv)和蘋(píng)果褪綠葉斑病毒(applechloroticleafspotvirus，aclsv)等(李文慧等2006)。其中蘋(píng)果莖溝病毒分布于各大蘋(píng)果種植產(chǎn)區(qū)，在全世界范圍內(nèi)發(fā)生(洪建等2001；vanetal.2000)。早在1989年劉福昌等(1989)研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)主栽蘋(píng)果品種上，蘋(píng)果莖溝病毒的帶毒率為33％-100％。1994年王國(guó)平等(1994)報(bào)道，我國(guó)北方15個(gè)主栽梨樹(shù)品種中，蘋(píng)果莖溝病毒的帶毒率為32.8％。蘋(píng)果主要通過(guò)嫁接來(lái)繁殖，在嫁接的過(guò)程中容易造成病毒的傳播。蘋(píng)果樹(shù)一旦感染病毒后會(huì)終生帶毒，持久危害，主要表現(xiàn)為抗性降低生長(zhǎng)削弱、器官畸形等，有的導(dǎo)致樹(shù)體急劇衰退等癥狀，造成樹(shù)體生長(zhǎng)不良，果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量下降等嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(nemeth1986)。病毒病以其面積大、危害損失嚴(yán)重成為蘋(píng)果生產(chǎn)上的嚴(yán)重病害。蘋(píng)果病毒病害的危害嚴(yán)重及防治困難，一直是蘋(píng)果生產(chǎn)和理論上的一個(gè)重要問(wèn)題。國(guó)外自二十世紀(jì)40年代以來(lái)就開(kāi)展蘋(píng)果病毒的研究，提出了有效的病毒脫除、檢測(cè)技術(shù)和鑒定程序(edwardsetal.1985；fuch1980，1982；listeretal.1965)。我國(guó)對(duì)果樹(shù)病毒的研究起步較晚，但是我國(guó)的果樹(shù)病毒病危害卻較普遍。

由于蘋(píng)果是重要栽培果樹(shù)之一，陜西省又是中國(guó)的蘋(píng)果第一大省。目前，包括蘋(píng)果莖溝病毒在內(nèi)的一些重要的蘋(píng)果病毒嚴(yán)重影響著蘋(píng)果的產(chǎn)量和品質(zhì)，給蘋(píng)果的安全生產(chǎn)帶來(lái)了較大的危害(張雪陽(yáng)等2005；張黨利等2010；徐立等2010；李文慧等2006)。但是，目前對(duì)于這些重要蘋(píng)果病毒的研究還較少，病毒的一些特性還不清楚，病毒的有效預(yù)防及控制還比較困難。本研究，針對(duì)蘋(píng)果莖溝病毒開(kāi)展其基因組測(cè)序與侵染性克隆等工作，是國(guó)內(nèi)首次測(cè)定其全基因組序列，也是首次構(gòu)建其侵染性克隆載體。通過(guò)測(cè)定蘋(píng)果莖溝病毒的全基因組序列，并與世界上其它國(guó)家已報(bào)道的全基因組序列進(jìn)行比較，以期了解其中國(guó)分離物的基因組特點(diǎn)。為研究該病毒的進(jìn)化以及進(jìn)一步了解該病毒，奠定重要的基礎(chǔ)。構(gòu)建該病毒的侵染性克隆載體，為進(jìn)一步研究該病毒的基因功能奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種蘋(píng)果莖溝病毒侵染性克隆載體的構(gòu)建方法，通過(guò)基因重組的方式，將蘋(píng)果莖溝病毒chn分離物的基因組克隆到pcass-rz載體雙35s啟動(dòng)子的下游，獲得了具有侵染活性的侵染性克隆pcass-asgv。利用pcass-asgv轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，浸潤(rùn)接種昆諾藜，可以在昆諾藜植株內(nèi)檢測(cè)到蘋(píng)果莖溝病毒外殼蛋白基因的表達(dá)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

(1)從感染蘋(píng)果莖溝病毒的蘋(píng)果植株中提取病毒rna；

(2)以植物總rna為模板，分別設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增蘋(píng)果莖溝病毒的引物，引物序列如下：

涵蓋蘋(píng)果莖溝病毒的基因組全長(zhǎng)；

(3)利用overlap-pcr的方法分別將asgv的8個(gè)片段拼接為2個(gè)大片段；

(4)利用限制性酶切的方法將2個(gè)大片段連接到植物表達(dá)載體pcass-rz的雙35s啟動(dòng)子下游，獲得帶有asgv全長(zhǎng)基因組的重組表達(dá)載體pcass-asgv；

(5)將pcass-asgv轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，并浸潤(rùn)接種寄主植物，觀察寄主癥狀并elisa檢測(cè)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

(1)該侵染性克隆載體可以穩(wěn)定保存；

(2)該侵染性克隆載體具有雙35s啟動(dòng)子，無(wú)需體外轉(zhuǎn)錄，可用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種；

(3)蘋(píng)果莖溝病毒不侵染人和動(dòng)物，對(duì)環(huán)境安全；

附圖說(shuō)明

圖1：asgv基因組片段擴(kuò)增示意圖；

圖2：pcass-asgv載體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3：pcass-asgv陽(yáng)性克隆載體的篩選檢測(cè)，a：大片段1的pcr擴(kuò)增檢測(cè)，b：大片段2的pcr擴(kuò)增檢測(cè)，c：pcass-asgv質(zhì)粒雙酶切檢測(cè)；

圖4：pcass-asgv在昆諾藜植株的轉(zhuǎn)錄結(jié)果rt-pcr檢測(cè)；

圖5：pcass-asgv在昆諾藜植株的蛋白表達(dá)elisa檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

為了理解本發(fā)明，下面以實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明。

材料與試劑

感染蘋(píng)果莖溝病毒的蘋(píng)果樹(shù)種植與西北農(nóng)林科技大學(xué)楊凌試驗(yàn)站，采集葉片保存于-80℃冰箱中備用。

主要試劑：

rna提取試劑盒購(gòu)自杭州博日公司；

m-mlv反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自promega公司；

taqdna聚合酶購(gòu)自takara公司；

大腸桿菌(escherichia.coli)dh5α，農(nóng)桿菌gv3101，dna標(biāo)準(zhǔn)marker1購(gòu)自voson公司；

膠回收試劑盒購(gòu)自bioteke公司。

實(shí)施步驟：

1.引物設(shè)計(jì)

首先本發(fā)明人從ncbi上下載了蘋(píng)果莖溝病毒的全基因組序列，使用primer5設(shè)計(jì)了多組引物，然后根據(jù)引物所在序列區(qū)域的保守性、引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體gc含量以及tm值等綜合因素選擇了引物。引物組有16條引物。所述引物參見(jiàn)seqidno.1-16。引物的信息見(jiàn)表1。

表1引物序列seqidno.1-16的信息：

2.rna抽提

使用多糖多酚植物總rna快速提取試劑盒(離心柱形)，按照操作說(shuō)明，分別提取病株樣品和健康樣品的總rna，最后溶于30μl洗脫緩沖液中，保存于-80℃冰箱中。

3.rt-pcr擴(kuò)增

逆轉(zhuǎn)錄方法：

(1)取無(wú)酶的pcr管子，加入2μl剛提取出來(lái)的rna，加入1μl的反轉(zhuǎn)錄引物以及1μl的dntps(10mmeach)，然后利用depc水補(bǔ)足體積至5μl，離心充分混勻；

(2)70℃條件下水浴5min，然后立即放置于冰上冷卻3min；

(3)接著瞬時(shí)離心后，加入5×m-mlvbuffer2.5μl，dntps(10mmeach)2.5μl，rna酶抑制劑0.25μl，m-mlv酶0.5μl，depc處理水1.75μl，瞬時(shí)離心混勻；

(4)42℃溫育60min；

(5)70℃15min，終止反應(yīng)，得到cdna。

pcr擴(kuò)增方法：

(1)取pcr反應(yīng)管，加入試劑如下：

(2)pcr反應(yīng)程序：

94℃預(yù)變性3min，接著30個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件如下：94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸90s。

循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸10min，然后設(shè)置pcr儀，保存于10℃。

(3)反應(yīng)結(jié)束后，取4μlpcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

4.overlap-pcr方法

上述方法可得到蘋(píng)果莖溝病毒的8個(gè)基因組片段，將臨近的片段進(jìn)行兩兩組合，分別用第一個(gè)片段的上游引物和第二個(gè)片段的下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到片段a、b、c、d。在a片段的5’端引物加入kpni酶切位點(diǎn)，b片段的3’端引物加入xhoi酶切位點(diǎn)。在c片段的5’端引入xhoi位點(diǎn)，d片段的3’端引入saci酶切位點(diǎn)。并用同樣方法再分別將片段a和b，c和d進(jìn)行拼接，得到片段ab和片段cd。分別將引入酶切位點(diǎn)的片段ab和片段cd連接到pmd19-t載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒備用。

5.限制性酶切

分別利用kpni、xhoi以及xhoi、saci酶切帶有片段ab和cd的質(zhì)粒。將酶切后的片段割膠純化，備用。將pcass-rz載體利用kpni和saci進(jìn)行雙酶切，割膠純化，備用。

6.t4連接、轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取

將兩個(gè)純化后的片段ab和cd與酶切純化后的pcass-rz載體同時(shí)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒。對(duì)質(zhì)粒再次進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

7.轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并接種昆諾藜

將pcass-asgv陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，再次挑取單斑，利用pcr方法進(jìn)行檢測(cè)。保存檢測(cè)為陽(yáng)性的菌株用于下游實(shí)驗(yàn)。同時(shí)利用轉(zhuǎn)化pcass-rz空質(zhì)粒的農(nóng)桿菌作為對(duì)照組，備用。利用含有目標(biāo)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種昆諾藜。同時(shí)以含有空pcass-rz質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種組為對(duì)照。每組接種15株昆諾藜。接種后，將昆諾藜黑暗過(guò)夜處理后，放置于光照溫室培養(yǎng)。接種14天之后，對(duì)所接種的昆諾藜分別進(jìn)行rt-pcr和elisa檢測(cè)。結(jié)果接種組可以檢測(cè)到目標(biāo)病毒rna，而對(duì)照組則沒(méi)有檢測(cè)到。接種組elisa試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)照組則為陰性。