本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種中山杉品種406（taxodiumhybrids‘zhongshansha406’）葉肉原生質(zhì)體分離、純化及高效轉(zhuǎn)化的方法。

背景技術(shù)：

植物原生質(zhì)體即指“通過質(zhì)壁分離，能夠和細(xì)胞壁分開的那部分細(xì)胞物質(zhì)”，換言之原生質(zhì)體就是除去全部細(xì)胞壁的“細(xì)胞”，仍具有細(xì)胞全能性。近年來，隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，植物原生質(zhì)體的瞬時表達(dá)已被科學(xué)家們廣泛利用進(jìn)行基因功能高通量分析，由于原生質(zhì)體的代謝過程、對植物激素的應(yīng)答、以及對環(huán)境因素的反應(yīng)都與完整的植物細(xì)胞或組織細(xì)胞完全相同，因此原生質(zhì)體為我們提供了一個分析植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方便而有力的工具。這項(xiàng)技術(shù)己經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于啟動子活性分析，基因亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)間的相互作用等。而目前植物原生質(zhì)體的研究主要集中于草本模式植物擬南芥、煙草，木本模式植物楊樹等一些雙子葉植物中。

中山杉是江蘇省中國科學(xué)院植物研究所從落羽杉×墨杉雜交組合中選育出來的優(yōu)良無性系，具有速生，耐水淹，耐鹽堿，抗病蟲害，干形優(yōu)美等特點(diǎn)。目前中山杉的生理學(xué)，形態(tài)學(xué)研究已經(jīng)獲得一定成果，但是同大多數(shù)針葉樹種一樣，由于其遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟，造成中山杉分子生物學(xué)相關(guān)功能研究受到限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)在技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種中山杉品種406葉肉原生質(zhì)體分離、純化方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種中山杉品種406葉肉原生質(zhì)體質(zhì)粒高效轉(zhuǎn)化的方法。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種中山杉品種406葉肉原生質(zhì)體分離、純化及高效轉(zhuǎn)化的方法，包括以下步驟：

1）以中山杉生長30天長勢良好的組培苗幼嫩葉片為材料，對材料進(jìn)行30h的黑暗預(yù)處理；

2）對葉肉原生質(zhì)體進(jìn)行分離和純化；

3）從15~20ml過夜培養(yǎng)菌液抽提50~80μg質(zhì)粒，質(zhì)粒為載體p2fgw7.0；

4）peg介導(dǎo)進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。

步驟2）中，具體操作：

1）用刀片將中山杉片從葉柄上迅速分離下來，輕輕將葉片切成0.5-1mm寬的葉條；

2）配制酶液：500μl200mmmes溶液，3.75ml0.8m甘露醇，500μl0.2mkcl，25μlddh2o混合后，70℃水浴10min后，立即加入150μl纖維素酶cellulase，75μl果膠酶pectinase，55℃水浴15min，0.20mm的膜過濾滅菌，酶液應(yīng)新鮮制備，且呈淺棕色；

3）將葉片切好后舒展地放入酶液中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗陪5小時酶解，當(dāng)酶解液體變綠時，輕輕搖晃培養(yǎng)容器促使原生質(zhì)體釋放出來；

4）沿培養(yǎng)容器邊沿輕輕加入預(yù)冷的10mlw5溶液，稀釋含有原生質(zhì)體的酶液；

5）輕輕混勻后，使用200目的篩子過濾除去未酶解的葉子以及雜質(zhì)；

6）將濾液加入50ml的圓底離心管，4℃，900rpm離心5min，沉淀原生質(zhì)體；

7）小心除去上清后，用5mlw5溶液重懸沉淀在圓底管底部的原生質(zhì)體；

8）普通光學(xué)顯微鏡下使用血球計(jì)數(shù)器觀察計(jì)數(shù)；

9）冰上靜止30min，再次去除上清，然后用適量的mmg溶液重懸原生質(zhì)體，使其終濃度達(dá)到6×10⁵/ml，用于后期的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。

步驟3）中，具體操作：

1）向吸附柱cp4中加入500μl的平衡液bl，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

2）取5~15ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，12000rpm離心1min，盡量吸除上清；

3）向留有菌體沉淀的離心管中加入500μl溶液p1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀；

4）向離心管中加入500μl溶液p2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~8次使菌體充分裂解；

5）向離心管中加入700μl溶液p3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~8離心管底部形成沉淀；

6）將上一步收集的上清液分次加入過濾柱cs，12000rpm離心2min，小心地將離心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱cp4中；

7）12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中；

8）向吸附柱cp4中加入500μl去蛋白液pd，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中；

9）向吸附柱cp4中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中；

10）向吸附柱cp4中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液；

11）將吸附柱cp4重新放回收集管中置于12000rpm離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除；

12）將吸附柱置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100~300μlddh2o洗脫，室溫放置2min，12000rpm離心lmin將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

步驟4）中，具體操作：

1）加入20μl的已提純的質(zhì)粒（10-20ug）至2ml離心管中；

2）加入200μl的已經(jīng)分離純化的中山杉葉肉原生質(zhì)體，輕柔混合；

3）加入220μl的peg溶液，0.2mmannitol，100mmcacl2），輕柔拍打離心管完全混合；

4）黑暗環(huán)境中，冰浴誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化混合物5-15分鐘；

5）室溫下用800μl的w5溶液稀釋轉(zhuǎn)化混合液，然后輕柔顛倒搖動離心管使之混合完好以終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)；

6）室溫下用臺式離心機(jī)1000rpm，離心6min，然后利用移液槍輕輕去除上清；

7）用200μl的wi溶液（4mmmes，0.5mmannitol，20mmkcl（ph5.7））輕柔重懸原生質(zhì)體于多2ml的離心管中；

8）室溫下黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)原生質(zhì)體表達(dá)轉(zhuǎn)化的載體18小時以上；

9）熒光顯微鏡下觀察gfp標(biāo)簽的表達(dá)。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的中山杉品種406葉肉原生質(zhì)體分離、純化及高效轉(zhuǎn)化的方法，其操作簡單易行，除可以獲得大量、完整、純凈的中山杉葉肉原生質(zhì)體外，還可以達(dá)到高達(dá)80%的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率。從而解決了無法深入研究中山杉基因功能的難題，也為其他針葉樹種原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系建立提供一定的參考及借鑒，將在林木基因工程領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1是組培苗幼嫩葉片材料圖；

圖2是含有的植物瞬時表達(dá)載體的元件圖；

圖3是酶解時間對中山杉葉肉原生質(zhì)體分離的影響圖；

圖4是中山杉原生質(zhì)體酶解體系優(yōu)化前后的對比圖；

圖5是中山杉葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化情況（gfp）圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

以下實(shí)施例中的測定方法如下：

原生質(zhì)體產(chǎn)量測定：原生質(zhì)體產(chǎn)量，即每克鮮重材料所制備的原生質(zhì)體的量，采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。吸取少量原生質(zhì)體懸浮液（20μl）滴加在血球計(jì)數(shù)板上，當(dāng)原生質(zhì)體充滿計(jì)數(shù)室后，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。依次逐個計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)25個中方格內(nèi)的原生質(zhì)體數(shù)，重復(fù)3次，然后按照下式計(jì)算出每毫升中原生質(zhì)體數(shù)量。

原生質(zhì)體密度（個/ml）=大方格內(nèi)（0.lmm³，即0.1μl）的原生質(zhì)體數(shù)×10⁴

原生質(zhì)體產(chǎn)量（個/g）=[原生質(zhì)體密度（個/ml）×原生質(zhì)體懸浮液總體積（ml）]/制備原生質(zhì)體所用材料鮮重（gfw）

實(shí)施例1原生質(zhì)體分離與純化

1、材料的選擇與預(yù)處理

一般而言，要想獲得產(chǎn)量高、活性強(qiáng)、完整的原生質(zhì)體，一般會選擇角質(zhì)化、纖維化低的幼嫩組織，且易獲得的材料。本發(fā)明選擇中山杉生長30天長勢良好的組培苗幼嫩葉片材料（如圖1所示），為了提高原生質(zhì)體分離的效率和活性，需要對材料進(jìn)行30h的黑暗預(yù)處理（將組培苗放置恒溫培養(yǎng)箱中，25℃遮光生長30h）。

2、中山杉葉肉原生質(zhì)體的分離與純化

1）用刀片將中山杉片從葉柄上迅速分離下來，輕輕將葉片切成0.5-1mm寬的葉條。

2）配制酶液：500μl200mmmes溶液，3.75ml0.8m甘露醇，500μl0.2mkcl，25μlddh2o混合后，70℃水浴10min后，立即加入150μl纖維素酶cellulase，75μl果膠酶pectinase，55℃水浴15min，0.20mm的膜過濾滅菌，酶液應(yīng)新鮮制備，且呈淺棕色。

3）將葉片切好后舒展地放入酶液中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗陪5小時酶解，當(dāng)酶解液體變綠時，輕輕搖晃培養(yǎng)容器促使原生質(zhì)體釋放出來。

4）沿培養(yǎng)容器邊沿輕輕加入預(yù)冷的10mlw5（2mmmes，154mmnacl，125mmcacl2，5mmkcl（ph5.7））溶液，稀釋含有原生質(zhì)體的酶液。

5）輕輕混勻后，使用200目的篩子過濾除去未酶解的葉子以及雜質(zhì)。

6）將濾液加入50ml的圓底離心管，4℃，900rpm離心5min，沉淀原生質(zhì)體。

7）小心除去上清后，用5mlw5溶液重懸沉淀在圓底管底部的原生質(zhì)體。

8）普通光學(xué)顯微鏡下使用血球計(jì)數(shù)器觀察計(jì)數(shù)。

9）冰上靜止30min，再次去除上清，然后用適量的mmg（4mmmes，0.4mmannitol，15-100mmmgcl2/cacl2（ph5.7））溶液重懸原生質(zhì)體，使其終濃度達(dá)到6×10⁵/ml，用于后期的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例2

1、質(zhì)粒提取

本實(shí)施例中用于轉(zhuǎn)化的載體p2fgw7.0為商業(yè)載體，載體圖如圖2所示，該載體含有一個組成型強(qiáng)表達(dá)啟動子p35s，可以在原生質(zhì)體內(nèi)部高效表達(dá)，含有一個egfp標(biāo)簽，可以在紫外燈下照射下觀察到綠色熒光信號。使用天根公司生產(chǎn)的小提中量試劑盒提取包含載體的質(zhì)粒，一般15~20ml過夜培養(yǎng)菌液可以抽提50~80μg左右質(zhì)粒。

1）柱平衡步驟：向吸附柱cp4中加入500μl的平衡液bl，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

2）取5~15ml過夜培養(yǎng)的含有p2fgw7.0為載體的菌液（菌液濃度控制在0.3-1.5od），加入離心管中，12000rpm離心1min，盡量吸除上清。

3）向留有菌體沉淀的離心管中加入500μl溶液p1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。

4）向離心管中加入500μl溶液p2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~8次使菌體充分裂解。

5）向離心管中加入700μl溶液p3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~8離心管底部形成沉淀。

6）將上一步收集的上清液分次加入過濾柱cs，12000rpm離心2min，小心地將離心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱cp4中。

7）12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中。

8）向吸附柱cp4中加入500μl去蛋白液pd，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中。

9）向吸附柱cp4中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中。

10）向吸附柱cp4中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液。

11）將吸附柱cp4重新放回收集管中置于12000rpm離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

12）將吸附柱置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100~300μlddh2o洗脫，室溫放置2min，12000rpm離心lmin將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

2、peg介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

1）加入20μl的已提純的質(zhì)粒（10-20ug）至2ml離心管中。

2）加入200μl的已經(jīng)分離純化的中山杉葉肉原生質(zhì)體，輕柔混合。

3）加入220μl的peg溶液（30~40%（wt/vol）peg4000，0.2mmannitol，100mmcacl2），輕柔拍打離心管完全混合。

4）黑暗環(huán)境中，冰浴誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化混合物5-15分鐘。

5）室溫下用800μl的w5溶液稀釋轉(zhuǎn)化混合液，然后輕柔顛倒搖動離心管使之混合完好以終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

6）室溫下用臺式離心機(jī)1000rpm，離心6min，然后利用移液槍輕輕去除上清。

7）用200μl的wi溶液（4mmmes，0.5mmannitol，20mmkcl（ph5.7））輕柔重懸原生質(zhì)體于多2ml的離心管中。

8）室溫下（20-25℃）黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)原生質(zhì)體表達(dá)轉(zhuǎn)化的載體18小時以上。

9）熒光顯微鏡（olympusbx51，japan）下觀察gfp標(biāo)簽的表達(dá)。

本實(shí)施例以其他植物葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系為基礎(chǔ)，進(jìn)行優(yōu)化，最終建立了穩(wěn)定且高效的中山杉葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系。由圖4可見：中山杉葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化效率一般可達(dá)到80%以上，為后期針葉樹種基因亞細(xì)胞定位，啟動子活性分析，蛋白互作等研究的開展提供了堅(jiān)實(shí)的保障。

實(shí)施例3

本發(fā)明以中山杉406組培苗的葉片為材料，以哈佛大學(xué)shenj實(shí)驗(yàn)室2007年在natureprotocol上發(fā)表的擬南芥葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系為基礎(chǔ)，進(jìn)行中山杉葉肉原生質(zhì)體酶解體系的優(yōu)化，纖維素酶從1%~4%每1%設(shè)置一個梯度，果膠酶從0.5%~2%每0.5%設(shè)置一個梯度，共16組酶液配比，酶解12小時后觀察酶解情況并計(jì)數(shù)，每次計(jì)數(shù)重復(fù)三次，結(jié)果如表1所示，顯示：當(dāng)纖維素酶為3%，果膠酶為1.5%，酶解效果最好。

表1不同酶組合及濃度對中山杉培苗原生質(zhì)體產(chǎn)量（×10⁶/gfw）的影響

酶解時間對中山杉葉肉原生質(zhì)體分離的影響：如果酶解時間太短，不僅浪費(fèi)材料，而且原生質(zhì)體得率也低；酶解時間太長，酶液的毒害作用增強(qiáng)，原生質(zhì)體破碎，活力降低。在不同酶液配比對葉肉原生質(zhì)體分離及活力的影響結(jié)果基礎(chǔ)上，每間隔1小時（共6小時）對原生質(zhì)體產(chǎn)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，每次計(jì)數(shù)重復(fù)三次。結(jié)果如圖3所示，顯示：酶解5小時，效果最好。

中山杉葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化含有瞬時表達(dá)載體p2fgw7.0的質(zhì)粒成功后，暗培養(yǎng)20h，在紫外燈照射下，綠色熒光被激發(fā)，如圖5所示，可以觀察到原生質(zhì)體細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜均均有熒光產(chǎn)生。