本發(fā)明涉及抑制腫瘤細(xì)胞藥物領(lǐng)域的研究，具體涉及一種苯并硼唑7位脂肪酸的衍生物及其制備與藥物用途。

背景技術(shù)：

近十年來(lái)，苯并硼唑類化合物在藥物化學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用得到了飛速的發(fā)展，有望成為一類新型抗感染藥物。目前已有抗真菌藥物5-氟苯并硼唑(tavaborole)于2014年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(fda)批準(zhǔn)上市，用于治療甲癬；另外，磷酸二酯酶-4抑制劑crisaborole于2016年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(fda)批準(zhǔn)上市，用于治療過(guò)敏性皮炎(http://www.fda.gov/)。

盡管苯并硼唑類化合物被廣泛應(yīng)用于抗真菌，抗細(xì)菌，抗寄生蟲，抗病毒和抗炎等領(lǐng)域(chem.rev.2015,115,5224-5247.；sci.chinachem.2013,56,1372-1381.)，但目前具有較好抗腫瘤(納摩爾級(jí))活性的苯并硼唑類化合物尚未有報(bào)道，相關(guān)研究也較少，曾有報(bào)道苯并硼唑-查爾酮雜合物具有抗腫瘤活性，但其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度(ic50)為微摩爾級(jí)(bioorg.med.chem.2016,26,5797-5801.)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、且對(duì)正常細(xì)胞系的毒性較低的苯并硼唑7位脂肪酸衍生物及其制備與藥物用途。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種苯并硼唑7位脂肪酸的衍生物，該衍生物的結(jié)構(gòu)通式如下所示：

通式中所述x選自n、s或o中的一種，所述n為2～6中的整數(shù)，所述r選自c1～c10、芐基、苯乙基、芳香雜環(huán)基、苯基、取代苯基、萘基、聯(lián)苯基或取代聯(lián)苯基中的一種。

優(yōu)選的，所述c1～c10為直鏈烷基、支鏈烷基或環(huán)狀烷基，所述芳香雜環(huán)基包括噻唑或呋喃，所述取代苯基中的取代基選自氫、鹵素、c1～c10烷基、烷氧基、炔基、乙氧羰基、硝基、氨基或氨甲基中的一種，所述取代聯(lián)苯基中的取代基選自氫、鹵素、甲氧基、甲巰基、三氟甲氧基、三氟甲基、氰基或乙酰基中的一種。

最優(yōu)選的，通式中所述x為n，所述n為2，所述r為取代(1,1’-聯(lián)苯)-3-基，其中，聯(lián)苯上取代基優(yōu)選為甲氧基和乙?；?/p>

上述衍生物還包括了它們的同位素化合物，外消旋體、旋光活性異構(gòu)體、多晶型或其混合物以及藥學(xué)上可接受的鹽，如其與鈉，鉀，鋰，鈣等金屬元素所形成的鹽，也可為與有機(jī)胺，吡啶，生物堿等有機(jī)堿所形成的鹽；還可為與鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硝酸、硫酸、磷酸等無(wú)機(jī)酸或者甲酸、乙酸、磺酸、酒石酸等有機(jī)酸所形成的鹽。

一種如上所述苯并硼唑7位脂肪酸的衍生物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下幾個(gè)步驟：

(1)將7-甲?；讲⑴疬蚺cph3p＝ch(ch2)mcooch2ch3溶于甲苯中，攪拌反應(yīng)，真空下旋蒸除去甲苯，純化得到

(2)將步驟(1)所得和pd/c催化劑溶于甲醇或乙醇中，在h2氛圍中攪拌并過(guò)濾，濾液在真空下旋蒸除去溶劑，純化得到

(3)步驟(2)所得溶于甲醇或乙醇中，加入過(guò)量naoh溶液，攪拌，然后用鹽酸調(diào)節(jié)ph至酸性，過(guò)濾得到固體

(4)步驟(3)所得與r-xh及edci溶于二氯甲烷或dmf中，攪拌，并在真空下旋蒸除去溶劑，純化即得

上述步驟中，m為0～4中的整數(shù)，x選自n、s或o中的一種，n為2～6中的整數(shù)，r選自c1～c10、芐基、苯乙基、芳香雜環(huán)基、苯基、取代苯基、萘基、聯(lián)苯基或取代聯(lián)苯基中的一種。

優(yōu)選的，步驟(1)所述7-甲?；讲⑴疬蚺cph3p＝ch(ch2)mcooch2ch3的摩爾比為1：(1～3)，攪拌反應(yīng)的溫度為20～30℃，時(shí)間為2～24h，純化采用硅膠柱層析。

優(yōu)選的，步驟(2)所述和pd/c催化劑的摩爾量之比為1：(0.01～1)，攪拌的溫度為20～30℃，時(shí)間為2～24h，純化采用硅膠柱層析。

優(yōu)選的，步驟(3)所述攪拌的溫度為20～30℃，時(shí)間為2～24h。

優(yōu)選的，步驟(4)所述與r-xh及edci的摩爾量之比為1：(0.5～3)：(1～3)，所述攪拌的溫度為20～30℃，時(shí)間為1～24h，純化采用硅膠柱層析。

一種如上所述苯并硼唑7位脂肪酸的衍生物的應(yīng)用，所述衍生物用于制備預(yù)防和治療腫瘤的藥物，由于該衍生物能在納摩爾級(jí)別抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且對(duì)人正常細(xì)胞系具有相對(duì)低的毒性，且該類化合物在裸鼠荷瘤模型中也具有明顯的抑制腫瘤增殖的活性，所以可以預(yù)防和治療腫瘤，尤其是針對(duì)卵巢癌skov3，乳腺癌mda-mb231，結(jié)腸癌hct116等腫瘤細(xì)胞系，但不限于上述腫瘤細(xì)胞系；正常細(xì)胞系包括但不限于mcf-10a和wi-38等人正常細(xì)胞系。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在以下幾方面：

(1)該類化合物具有較好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，可以有效地抑制卵巢癌，乳腺癌，結(jié)腸癌等常見腫瘤細(xì)胞的增殖，并且該類化合物對(duì)人正常細(xì)胞系的毒性較低；

(2)合成簡(jiǎn)單，沒有涉及非常繁瑣的步驟，合成成本低。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1和空白試驗(yàn)組小鼠平均瘤塊體積的變化示意圖；

圖2為實(shí)施例1和空白試驗(yàn)組小鼠體重的變化示意圖；

圖3為實(shí)施例1和空白試驗(yàn)組小鼠處死后體內(nèi)瘤塊重量。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

n-苯基-3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酰胺的制備流程如下所示：

具體來(lái)說(shuō)，包括以下步驟：

(1)、2,6-二甲基溴苯(30.0g,162.2mmol)溶于叔丁醇(200ml)和水(200ml)混合溶劑中，然后分批加入高錳酸鉀(128.0g,810.0mmol)。70℃回流過(guò)夜后，反應(yīng)液趁熱通過(guò)硅藻土過(guò)濾，濾餅用水洗(50ml×3)。合并濾液，真空濃縮至300ml，并用濃鹽酸調(diào)ph至3，生成沉淀，過(guò)濾得到白色固體化合物2-溴-1,3-苯二酸(2)(28.0g,70.5％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ13.57(br,2h),7.70(d,j＝7.6hz,2h),7.52(t,j＝7.6hz,1h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ167.8,136.7,130.7,127.8,116.2ppm。

(2)、2-溴-1,3-苯二酸(2)(17.9g,73.1mmol)溶于二氯亞砜(100ml)中并加熱回流6h后在真空下旋干。再在0℃下逐滴向殘?jiān)屑尤爰状?80ml)和三乙胺(40ml)混合溶液，滴加0.5h。室溫?cái)嚢?h后，真空下濃縮。殘?jiān)苡谝宜嵋阴ブ校?.5m鹽酸水溶液和飽和碳酸氫鈉各洗一次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，真空下旋干得到黃色油狀化合物2-溴-1,3-苯二酸二甲酯(3)(19.9g,99.7％)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ7.80(d,j＝7.6hz,2h),7.59(t,j＝7.6hz,1h),3.88(s,6h)ppm；¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ166.8,135.3,132.2,127.1,119.0,52.7ppm。

(3)、2-溴-1,3-苯二酸二甲酯(3)(16.6g,60.8mmol)溶于干燥的四氫呋喃(150ml)和甲醇(3ml)混合溶劑中，在0℃下分批加入硼氫化鋰(3.3g,151.5mmol)。室溫反應(yīng)過(guò)夜后，用水(150ml)淬滅反應(yīng)。反應(yīng)液用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥后真空下旋干得到白色固體化合物2,6-二羥甲基溴苯(4)(13.2g,100％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ7.44-7.39(m,3h),5.39(t,j＝5.6hz,2h),4.52(d,j＝5.6hz,4h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ140.8,126.9,126.1,120.2,62.7ppm。

(4)、2,6-二羥甲基溴苯(4)(10.7g,49.3mmol)和3,4-二氫吡喃(16.6g,197.2mmol)溶于dmf(120ml)中，并加入對(duì)甲苯磺酸一水合物(469.3mg,2.5mmol)。室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后用飽和碳酸氫鈉淬滅。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，真空下旋干得到無(wú)色半固體狀化合物5(19.0g,100％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.45(d,j＝7.6hz,2h),7.33(t,j＝7.6hz,1h),4.85(d,j＝13.4hz,2h),4.78(t,j＝3.4hz,2h),4.61(d,j＝13.4hz,2h),3.96-3.90(m,2h),3.60-3.54(m,2h),1.94-1.54(m,12h)ppm；¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ138.1,127.8,127.1,98.3,68.8,62.1,30.5,25.4,19.3ppm。

(5)、化合物5(26.8g,69.6mmol)溶于干燥四氫呋喃(300ml)中，-78℃下逐滴加入正丁基鋰(2.5minhexane,33ml)，滴加0.5h。-78℃下攪拌1h后，逐滴加入硼酸三異丙酯(15.7g,83.5mmol)。然后反應(yīng)溫度緩慢升至室溫并攪拌過(guò)夜。反應(yīng)液用6m鹽酸(100ml)和甲醇(100ml)混合溶液淬滅。再在室溫?cái)嚢?h后，反應(yīng)液在真空下旋蒸，除去四氫呋喃和甲醇。剩余反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，真空下旋干得到灰色固體粗品6(11.9g)。粗品直接用于下一步未經(jīng)進(jìn)一步純化。

(6)、粗品6(11.9g,72.5mmol)，pcc(23.5g,109.0mmol)和硅藻土(12.0g)混懸于二氯甲烷(150ml)中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后，通過(guò)硅藻土過(guò)濾。濾液用1m氫氧化鈉水溶液萃取(150ml)。然后水相用濃鹽酸調(diào)ph至3，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取。合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，真空下旋干得到黃色固體化合物7-甲?；讲⑴疬?7)(6.3g,53.8％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.40(s,1h),9.20(s,1h),7.87(d,j＝7.4hz,1h),7.76(d,j＝7.4hz,1h),7.70(t,j＝7.4hz,1h),5.13(s,2h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ193.5,155.0,138.6,131.2,127.3,126.0,70.3ppm。

(7)、7-甲?；讲⑴疬?7)(1.68g,10.4mmol)和(三苯基膦烯)乙酸乙酯(4.34g,12.4mmol)溶于甲苯(150ml)中。室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后，真空下旋蒸除去溶劑。粗品用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)純化得到白色固體化合物8(1.6g,66.7％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.33(s,1h),8.10(d,j＝16.2hz,1h),7.81(d,j＝7.6hz,1h),7.52(t,j＝7.6hz,1h),7.44(d,j＝7.6hz,1h),6.80(d,j＝16.2hz,1h),5.02(s,2h),4.19(q,j＝7.0hz,2h),1.26(t,j＝7.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ166.3,154.5,143.0,137.2,131.1,125.0,123.0,119.1,69.6,59.9,14.1ppm。

(8)、化合物8(1.3g,5.6mmol)和10％pd/c(592mg)溶于乙醇(120ml)中。反應(yīng)液在氫氣氛圍下室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后過(guò)濾。濾液在真空下旋蒸除去溶劑。粗品用硅膠柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)得到白色固體化合物9(1.2g,93.2％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.98(s,1h),7.36(t,j＝7.5hz,1h),7.21(d,j＝7.5hz,1h),7.13(d,j＝7.5hz,1h),4.96(s,2h),4.02(q,j＝7.0hz,2h),3.30(t,j＝7.8hz,2h),2.26(t,j＝7.8hz,2h),1.14(t,j＝7.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ172.2,154.1,144.6,130.8,126.7,119.1,69.7,59.6,35.4,29.2,14.0ppm。

(9)、化合物9(1.51g,6.45mmol)溶于甲醇(66ml)中，再加入1mnaoh(33ml)水溶液。室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后，反應(yīng)液用濃鹽酸調(diào)ph至3。過(guò)濾得到白色固體化合物3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酸(10)(1.23g,92.9％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ12.04(s,1h),8.96(s,1h),7.36(t,j＝7.5hz,1h),7.20(d,j＝7.5hz,1h),7.14(d,j＝7.5hz,1h),4.96(s,2h),2.99(t,j＝7.8hz,2h),2.54(t,j＝7.8hz,2h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ173.8,154.1,145.0,130.8,126.6,119.0,69.7,35.5,29.2ppm；hrms(esi):[m+h]⁺c10h12bo4calcd207.0829,found207.0827；mp:159-162℃；hplc:purity99.1％,retentiontime3.5min。

(10)、3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酸(10)(60mg,0.29mmol)，苯胺(28mg,0.30mmol)和edci(111.1mg,1.94mmol)溶于干燥二氯甲烷(20ml)中。室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后，反應(yīng)液在真空下旋蒸除去溶劑。粗品用硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇＝150/1)純化得到白色固體化合物11(192.3mg,70.5％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.82(s,1h),8.99(s,1h),7.56(d,j＝8.0hz,2h),7.36(t,j＝7.4hz,1h),7.27(dd,j＝8.0,7.4hz,2h),7.21(d,j＝7.4hz,1h),7.16(d,j＝7.4hz,1h),7.01(t,j＝7.4hz,1h),4.97(s,2h),3.10(t,j＝7.6hz,2h),2.64(t,j＝7.6hz,2h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ170.5,154.1,145.4,139.2,130.7,128.5,126.6,122.8,118.9,118.8,69.6,38.1,29.4ppm；hrms(esi):[m+h]⁺c16h17bno3calcd282.1301,found282.1299；mp:197-199℃；hplc:purity95.6％,retentiontime11.3min。

實(shí)施例2

3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酸苯酯(12)

采用與實(shí)施例1類似的合成方法，步驟(1)～(6)相同，不同之處在于：

(a)步驟(7)中7-甲酰基苯并硼唑與ph3p＝ch(ch2)mcooch2ch3的摩爾比為1：1，攪拌反應(yīng)的溫度為20℃，時(shí)間為24h，純化采用硅膠柱層析。

(b)步驟(8)所述和pd/c催化劑的摩爾量之比為1：0.01，攪拌的溫度為20℃，時(shí)間為24h，純化采用硅膠柱層析。

(c)步驟(9)所述攪拌的溫度為20℃，時(shí)間為24h。

(d)步驟(10)所述與r-xh及edci的摩爾量之比為1：3:3，所述攪拌的溫度為20℃，時(shí)間為24h，純化采用硅膠柱層析。

最終檢測(cè)結(jié)果如下：¹hnmr(400mhz,cd3od):δ7.40(t,j＝7.5hz,1h),7.36(t,j＝8.2hz,2h),7.25-7.19(m,3h),6.97(d,j＝8.2hz,2h),5.06(s,2h),3.19(t,j＝7.6hz,2h),2.91(t,j＝7.6hz,2h)ppm；¹³cnmr(100mhz,cd3od):δ173.4,155.9,152.3,145.9,132.3,130.4,128.4,126.8,122.7,120.4,72.2,37.1,31.0ppm；hrms(esi):[m+h]⁺c16h16bo4calcd283.1142,found283.1141；mp:120-123℃；hplc:purity99.3％,retentiontime13.6min，說(shuō)明該化合物為：

實(shí)施案例3

n-環(huán)己基-3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酰胺(13)

采用與實(shí)施例1類似的合成方法，步驟(1)～(6)相同，不同之處在于：

(a)步驟(7)中7-甲?；讲⑴疬蚺cph3p＝ch(ch2)mcooch2ch3的摩爾比為1：3，攪拌反應(yīng)的溫度為30℃，時(shí)間為2h，純化采用硅膠柱層析。

(b)步驟(8)所述和pd/c催化劑的摩爾量之比為1：1，攪拌的溫度為30℃，時(shí)間為2h，純化采用硅膠柱層析。

(c)步驟(9)所述攪拌的溫度為30℃，時(shí)間為2h。

(d)步驟(10)所述與r-xh及edci的摩爾量之比為1：0.5:1，所述攪拌的溫度為30℃，時(shí)間為1h，純化采用硅膠柱層析。

最終檢測(cè)結(jié)果如下：¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.99(s,1h),7.61(d,j＝7.8hz,1h),7.34(t,j＝7.4hz,1h),7.19(d,j＝7.4hz,1h),7.10(d,j＝7.4hz,1h),4.95(s,2h),3.53-3.46(m,1h),2.98(t,j＝7.6hz,2h),2.35(t,j＝7.6hz,2h),1.68-1.62(m,4h),1.53(d,j＝11.9hz,1h),1.24-1.18(m,2h),1.11-1.02(m,3h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ170.5,154.0,145.7,130.6,126.6,118.8,69.6,47.2,37.3,32.4,29.7,25.2,24.5ppm；hrms(esi):[m+h]⁺c16h23bno3calcd288.1771,found288.1779；mp:221-224℃；hplc:purity97.9％,retentiontime11.0min。說(shuō)明該化合物為：

實(shí)施案例4

n-芐基-3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酰胺(14)

采用與實(shí)施例1類似的合成方法，最終的檢測(cè)結(jié)果如下：¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.95(s,1h),8.25(t,j＝5.9hz,1h),7.35(t,j＝7.5hz,1h),7.28(d,j＝7.5hz,1h),7.26(d,j＝7.5hz,1h),7.21(d,j＝7.2hz,2h),7.15-7.11(m,3h),4.95(s,2h),4.24(d,j＝5.9hz,2h),3.04(t,j＝7.6hz,2h),2.47(t,j＝7.6hz,2h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ171.4,154.0,145.5,139.5,130.7,128.1,127.0,126.7,126.5,118.8,69.6,41.8,37.1,29.6ppm；hrms(esi):[m+h]⁺c17h19bno3calcd296.1458,found296.1462；mp:158-162℃；hplc:purity96.5％,retentiontime10.1min。

實(shí)施例5

n-苯乙基-3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酰胺(15)

采用與實(shí)施例1類似的合成方法，最終的檢測(cè)結(jié)果如下：¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.96(s,1h),7.85(t,j＝5.6hz,1h),7.35(t,j＝7.5hz,1h),7.27(t,j＝7.2hz,2h),7.21-7.18(m,2h),7.15(d,j＝7.2hz,2h),7.10(d,j＝7.5hz,1h),4.96(s,2h),3.26-3.21(m,2h),2.99(t,j＝7.6hz,2h),2.66(t,j＝7.6hz,2h),2.47(t,j＝7.6hz,2h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ171.4,154.0,145.6,139.4,130.7,128.5,128.2,126.5,125.9,118.8,69.6,37.2,35.1,29.6ppm；hrms(esi):[m+h]⁺c18h21bno3calcd310.1614,found310.1611；mp:145-149℃；hplc:purity99.4％,retentiontime11.0min。

實(shí)施案例6

n-(2-噻唑基)-3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酰胺(16)

采用與實(shí)施例1類似的合成方法，最終的檢測(cè)結(jié)果如下：¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ12.04(s,1h),8.98(s,1h),7.43(d,j＝3.5hz,1h),7.36(t,j＝7.5hz,1h),7.21(d,j＝7.5hz,1h),7.18(d,j＝3.5hz,1h),7.14(d,j＝7.5hz,1h),4.97(s,2h),3.10(t,j＝7.8hz,2h),2.76(t,j＝7.8hz,2h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ170.4,157.8,154.0,144.8,137.4,126.4,119.0,113.0,69.6,36.6,28.9ppm；hrms(esi):[m+h]⁺c13h14bn2o3scalcd289.0818,found289.0823；mp:204-206℃；hplc:purity98.8％,retentiontime9.0min.

實(shí)施例7

n-(2-甲氧基-苯基)-3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酰胺(17)

采用與實(shí)施例1類似的合成方法，最終的檢測(cè)結(jié)果如下：¹hnmr(400mhz,cd3od):δ7.92(d,j＝7.8hz,1h),7.36(t,j＝7.5hz,1h),7.22-7.17(m,2h),7.08(dd,j＝8.0,7.5hz,1h),6.97(d,j＝8.0hz,1h),6.90(dd,j＝7.8,7.5hz,1h),5.06(s,2h),3.84(s,3h),3.16(t,j＝7.8hz,2h),2.73(t,j＝7.8hz,2h)ppm；¹³cnmr(100mhz,cd3od):δ173.9,155.8,151.4,146.4,132.3,128.2,126.1,123.3,121.5,120.2,111.8,72.2,56.3,40.3,32.0ppm；hrms(esi):[m+h]⁺c17h19bno4calcd312.1407,found312.1412；mp:158-162℃；hplc:purity98.0％,retentiontime12.0min.

實(shí)施案例8

n-(萘-1-基)-3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酰胺(18)

采用與實(shí)施例1類似的合成方法，最終的檢測(cè)結(jié)果如下：¹hnmr(600mhz,dmso-d6):δ9.81(s,1h),9.02(s,1h),7.91(d,j＝7.8hz,1h),7.84(d,j＝8.2hz,1h),7.74(d,j＝8.2hz,1h),7.62(d,j＝7.4hz,1h),7.52-7.46(m,3h),7.39(t,j＝7.4hz,1h),7.25(d,j＝7.6hz,1h),7.22(d,j＝7.4hz,1h),4.99(s,2h),3.17(t,j＝7.5hz,2h),2.82(t,j＝7.5hz,2h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ171.3,154.2,145.4,133.6,133.5,130.8,128.0,127.8,126.8,125.9,125.6,125.5,125.1,122.8,121.8,119.0,69.7,37.8,29.8ppm；hrms(esi):[m+h]⁺c20h19bno3calcd332.1458,found332.1456；mp:172-175℃；hplc:purity96.2％,retentiontime11.8min.

實(shí)施案例9

n-(1,1’-聯(lián)苯-3-基)-3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酰胺(19)

采用與實(shí)施例1類似的合成方法，最終的檢測(cè)結(jié)果如下：¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.94(s,1h),9.01(s,1h),7.90(s,1h),7.60(d,j＝7.5hz,2h),7.55(d,j＝7.5hz,1h),7.47(t,j＝7.5hz,2h),7.37(t,j＝7.5hz,3h),7.30(d,j＝7.5hz,1h),7.21(d,j＝7.5hz,1h),7.18(d,j＝7.5hz,1h),4.97(s,2h),3.12(t,j＝7.6hz,2h),2.68(t,j＝7.6hz,2h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ170.6,154.1,145.4,140.6,140.1,139.7,130.7,129.2,128.9,127.4,126.6,126.5,121.3,118.9,118.0,117.2,69.7,38.2,29.4ppm；hrms(esi):[m+h]⁺c22h21bno3calcd358.1614,found358.1619；mp:146-149℃；hplc:purity98.8％,retentiontime14.7min.

實(shí)施案例10

n-(4’-乙酰基-(1,1’-聯(lián)苯)-3-基)-3-(1-羥基-1,3-二氫-苯并[c][1,2]硼唑-7-基)丙酰胺(20)

采用與實(shí)施例1類似的合成方法，最終的檢測(cè)結(jié)果如下：¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.98(s,1h),9.01(s,1h),8.05(d,j＝8.4hz,2h),7.98(s,1h),7.76(d,j＝8.4hz,2h),7.60(d,j＝7.0hz,1h),7.44-7.35(m,3h),7.21(d,j＝7.4hz,1h),7.17(d,j＝7.4hz,1h),4.97(s,2h),3.12(t,j＝7.6hz,2h),2.67(t,j＝7.6hz,2h),2.61(s,3h)ppm；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ197.4,170.7,154.1,145.3,144.4,139.9,139.3,135.6,130.7,129.4,128.9,126.7,126.6,121.5,118.9,118.8,117.4,69.7,38.2,29.4,26.7ppm；hrms(esi):[m+h]⁺c24h23bno4calcd400.1720,found400.1722；mp:167-171℃；hplc:purity98.1％,retentiontime13.4min.

對(duì)上述物質(zhì)進(jìn)行測(cè)試，具體步驟如下：

1、細(xì)胞增殖抑制測(cè)試

(1)細(xì)胞培養(yǎng)。所有腫瘤細(xì)胞系(mda-mb231，skov3和hct116)和人正常細(xì)胞系(mcf-10a和wi-38)均購(gòu)于atcc(美國(guó)菌種保藏中心)。腫瘤細(xì)胞系在dmem完全培養(yǎng)基(高糖dmem培養(yǎng)基，加入10％胎牛血清，100units/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素)中培養(yǎng)。mcf-10a在dmem完全培養(yǎng)基(高糖dmem培養(yǎng)基，加入10％胎牛血清)中培養(yǎng)。wi-38在mem完全培養(yǎng)基(mem培養(yǎng)基，加入10％胎牛血清和1％非必需氨基酸(neaa))中培養(yǎng)。細(xì)胞在co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞復(fù)蘇后傳代三次以上，長(zhǎng)至80％滿時(shí)且狀態(tài)良好時(shí)可用于活性測(cè)試。

(2)具體操作。用四氮唑(mtt)法測(cè)試化合物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制活性。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞種于96孔板中，加入不同濃度的化合物孵育72h。然后在每孔中加入20μlmtt(5mg/ml)并孵育4h。吸去上清，每孔加入150μldmso并震搖20min。酶標(biāo)儀(thermovarioskanflash)讀取550nm下各孔的光密度值(od)。每個(gè)化合物在每個(gè)濃度下設(shè)三個(gè)復(fù)孔。

(3)按下式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞系的增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率＝(od陰性對(duì)照試-od試驗(yàn))/(od陰性對(duì)照-od空白)×100％。以同一樣品的不同濃度對(duì)細(xì)胞增殖抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，用軟件graphpadprism5分析，從中求出樣品的半數(shù)抑制濃度ic50。

表1部分化合物對(duì)細(xì)胞增殖抑制的ic50

從表1中可以看出，本發(fā)明提供的化合物部分具有較好的抑制細(xì)胞增殖的活性。

2、體內(nèi)腫瘤增殖抑制活性測(cè)試。

五周齡雌性裸鼠購(gòu)自上海靈暢實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀況良好的skov3細(xì)胞，用pbs調(diào)節(jié)濃度至5×10⁷cells/ml。裸鼠皮下種植腫瘤，每個(gè)裸鼠種植5×10⁶個(gè)細(xì)胞。待瘤塊長(zhǎng)至約100mm³，隨機(jī)將裸鼠分成兩組，每組八只，分別腹腔注射空白溶劑(5％乙醇，20％peg400和75％ddh2o)和化合物20。給藥劑量為5mg/kg，每天一次，持續(xù)30天。瘤塊直徑和小鼠體重每三天分別用游標(biāo)卡尺和電子天平測(cè)量一次。腫瘤體積用公式(a×b²)/2計(jì)算，a為瘤塊最大直徑，b為瘤塊最小直徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頸法處死裸鼠并拍照，再取出瘤塊并稱重拍照。本實(shí)驗(yàn)得到上海交通大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表2.化合物20在skov3裸鼠荷瘤模型中的活性

如圖1所示，化合物20可以顯著地抑制腫瘤的增長(zhǎng)。第30天時(shí)，化合物20組的瘤塊平均體積為1020mm³，而空白組的瘤塊體積為1793mm³(表2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取下的瘤塊大小和重量也表明了化合物抑瘤效果較為明顯，如圖3所示。空白組平均瘤重為1.51g，而化合物20組平均瘤重為0.96g(表2)。通過(guò)比較小鼠體重的變化可以看出(圖2和表2)化合物20組體重相對(duì)于空白組沒有明顯的降低。