本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從絞股藍(lán)的干燥葉中分離得到的一種具有治療腎癌作用的二萜類化合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

絞股藍(lán)(gynostemmapentaphyllum(thunb.)maki-no，gp)屬葫蘆科多年生蔓生草本，又名七葉膽、五葉參等。因其葉有甜味在日本被稱為“甘茶蔓”。性涼、苦、微甘，歸肺、脾、腎經(jīng)。具有益氣健脾，化痰止咳，清熱解毒的功效，可用于治療體虛乏力、虛勞失精、白細(xì)胞減少癥、高脂血癥、病毒性肝炎、慢性胃腸炎、慢性氣管炎。該植物主要生長(zhǎng)于亞熱帶，全世界約有16種和3個(gè)變種，我國有15種和3個(gè)變種，廣泛分布秦嶺及長(zhǎng)江以南地區(qū)。

絞股藍(lán)主要化學(xué)成分為絞股藍(lán)皂苷，分布于植物營養(yǎng)器官包括同化組織及韌皮部薄壁細(xì)胞，其含量因植物的部位不同而有所差別，一般情況下絞股藍(lán)葉中含量最高。目前從絞股藍(lán)中共分離得到140多種絞股藍(lán)皂苷，其中絞股藍(lán)皂苷3、4、8、12分別與人參皂苷rb1、rb3、rd、f2結(jié)構(gòu)相同，為同物異名。此外，絞股藍(lán)還含有黃酮類、糖類、萜類等多種化學(xué)成分。

現(xiàn)代藥理研究表明，絞股藍(lán)是一種化學(xué)成分比較明確的植物，具有藥效良好、毒副作用小等特點(diǎn)。絞股藍(lán)皂苷對(duì)胃癌、宮頸癌、舌癌等培養(yǎng)癌細(xì)胞均具有顯著的細(xì)胞毒作用。絞股藍(lán)皂苷具有顯著降低膽固醇(tch)、甘油三脂(tg)、低密度脂蛋白(ldl)、升高高密度脂蛋白(hdl)、保護(hù)血管內(nèi)壁，阻止脂質(zhì)在血管壁沉積，抗動(dòng)脈硬化的作用。絞股藍(lán)可以調(diào)節(jié)氧在體內(nèi)分解后產(chǎn)生的廢物——脂肪酸，達(dá)到降血脂的目的。絞股藍(lán)皂苷具有明顯降低血粘稠度、調(diào)整血壓功能、同時(shí)能防止微血栓形成并增加心肌細(xì)胞對(duì)缺氧的耐力，起到保護(hù)心肌的作用。絞股藍(lán)皂苷可提高衰老成纖維細(xì)胞增殖能力，且增殖效應(yīng)呈時(shí)間和濃度依賴性，延緩細(xì)胞衰老。絞股藍(lán)具有免疫調(diào)節(jié)作用，其活性主要體現(xiàn)為：增強(qiáng)非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫；影響淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和白細(xì)胞介素2分泌；增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(nk)的功能。此外，絞股藍(lán)還可制成保健茶、飲料、食品添加劑等功能性食品，具有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種從絞股藍(lán)的干燥葉中分離得到的一種具有治療腎癌作用的二萜類化合物及其制備方法。

本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(ⅰ)，

所述的化合物(ⅰ)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將絞股藍(lán)的干燥葉粉碎，用75～85％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用80％乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集80％乙醇洗脫液，減壓濃縮得80％乙醇洗脫物浸膏；(c)步驟(b)中80％乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1、45:1、25:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集10～12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(ⅰ)。

進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為d101大孔吸附樹脂。

進(jìn)一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為80％。

一種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物(ⅰ)和藥學(xué)上可接受的載體。

所述的化合物(ⅰ)在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。

所述的藥物組合物在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。

該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物(ⅰ)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì)人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。

所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可通過口服 或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。

附圖說明

圖1為化合物(ⅰ)結(jié)構(gòu)式；

圖2為化合物(ⅰ)理論ecd值與實(shí)驗(yàn)ecd值比較。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。

實(shí)施例1：化合物(ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證

試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。

制備方法：(a)將絞股藍(lán)的干燥葉(10kg)粉碎，用80％乙醇熱回流提取(25l×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(3l)，依次用石油醚(3l×3次)、乙酸乙酯(3l×3次)和水飽和的正丁醇(3l×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(431g)和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用d101大孔樹脂除雜，先用10％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用80％乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集80％乙醇洗脫液，減壓濃縮得80％乙醇洗脫物浸膏(161g)；(c)步驟(b)中80％乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1(8個(gè)柱體積)、45:1(8個(gè)柱體積)、25:1(8個(gè)柱體積)、15:1(10個(gè)柱體積)和1:1(5個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4(52g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1(8個(gè)柱體積)、15:1(10個(gè)柱體積)和8:1(8個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2(26g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集10-12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(ⅰ)(37mg)。

結(jié)構(gòu)確證：hr-esims顯示[m+na]⁺為m/z399.1402，結(jié)合核磁特征可得分子式為c20h24o7，不飽和度為9。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δh(ppm，dmso-d6，600mhz)：h-1(1.79，m)，h-1(1.66，m)，h-2(2.24，2h，m)，h-3(6.75，dd，j＝3.6，3.0)，h-6(4.61，dd，j＝10.2，6.6)，h-7(1.93，dd，j＝13.8，6.6)，h-7(2.08，dd，j＝13.8，10.2)，h-9(2.49，dd，j＝9.0，7.2)，h-11(2.55，dt，j＝13.0，7.2)，h-11(2.18，ddd，j＝13.0，9.0，6.0)，h-12(5.33，dd，j＝7.2，6.0)，h-14(6.27，br，s)，h-15(7.34，br，s)，h-16 (7.32，br，s)，h-17(1.42，s)，h-19(1.26，s)，h-20(5.75，d)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δc(ppm，dmso-d6，150hz)：33.3(ch2，1-c)，24.7(ch2，2-c)，135.1(ch，3-c)，132.0(c，4-c)，43.2(c，5-c)，78.5(ch，6-c)，34.4(ch2，7-c)，74.2(c，8-c)，49.8(ch，9-c)，97.3(c，10-c)，31.1(ch2，11-c)，72.2(ch，12-c)，124.6(c，13-c)，108.1(ch，14-c)，144.0(ch，15-c)，139.3(ch，16-c)，25.1(ch3，17-c)，168.9(c，18-c)，22.2(ch3，19-c)，98.5(ch，20-c)；碳原子標(biāo)記參見圖1。紅外光譜顯示該化合物含有羥基(3439cm^-1)和共軛內(nèi)酯(1684cm^-1)基團(tuán)。nmr譜表明，該化合物含有兩個(gè)甲基[δh1.42(s，h3-17)和1.26(s，h3-19)]，三個(gè)含氧次甲基[δh4.61(dd，j＝10.2，6.6hz，h-6)，5.33(dd，j＝7.2，6.0hz，h-12)和5.75(d，h-20)；δc78.5(c-6)，72.2(c-12)和98.5(c-20)]，三取代雙鍵[δh6.75(dd，j＝3.6，3.0hz，h-3)；δc135.1(c-3)和132.0(c-4)]，一個(gè)β單取代呋喃環(huán)[δc124.6(c-13)，108.1(c-14)，144.0(c-15)，和139.3(c-16)]以及共軛內(nèi)酯羰基[δc168.9(c-18)]。hmbc譜中，h-3和h-6與c-18的相關(guān)性表明該化合物含有18,6-內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)hmbc譜中h-12與c-14和c-16的相關(guān)性，可推斷呋喃環(huán)位于c-12位上。此外，h3-19與h-6，h-6與h3-17以及h3-17與h-9較強(qiáng)的noe相關(guān)性，表明它們都是α構(gòu)型。h-14與h-11α的noe相關(guān)表明β-單取代呋喃環(huán)為α構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、hmbc譜和noesy譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ecd試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。

實(shí)施例2：化合物(ⅰ)藥理作用試驗(yàn)

一、材料和儀器

786-0腎癌細(xì)胞株、os-rc-2腎癌細(xì)胞株均購自中科院細(xì)胞庫?；衔?ⅰ)自制，hplc歸一化純度大于98％。rpmi-1640培養(yǎng)基、100u/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素、1×pbs緩沖液、胰酶-edta購于美國hyclone。胎牛血清購于美國gibco。細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒(中國)?；|(zhì)膠購于美國bdbioscience。

heracell240i恒溫孵箱、gmbhd-37520低溫離心機(jī)、1510酶標(biāo)儀為芬蘭thermo公司產(chǎn)品。imt-2倒置相差顯微鏡為日本olympus公司產(chǎn)品。dfc480正置顯微鏡為德國徠卡公司產(chǎn)品。mdf-u53v-80℃超低溫冰箱為日本sanyo公司產(chǎn)品。yds-50b-80液氮儲(chǔ)存罐購自中國成都液氮容器廠。bc-185ge4℃冰箱為中國益友公司產(chǎn)品。minispinplus小離心機(jī)為eppendorf公司產(chǎn)品。powerpac300電泳儀為美國biorad公司產(chǎn)品。las4000mini凝膠成像儀為日本fujifilm公司。

二、試驗(yàn)方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)

(1)常規(guī)培養(yǎng)及細(xì)胞傳代：786-0及os-rc-2腎癌細(xì)胞株均培養(yǎng)在改良型rpmi-1640培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)時(shí)加入了10％胎牛血清及1％青霉素和鏈霉素，構(gòu)成完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37℃、5％co2的恒溫培養(yǎng)箱。正常情況下786-0及os-rc-2細(xì)胞均為貼壁生長(zhǎng)。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般隔天換液一次。換液時(shí)先吸去培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，加pbs洗漆2次后再加入完全培養(yǎng)基。細(xì)胞密度達(dá)到80-90％且細(xì)胞形態(tài)仍保持良好時(shí)進(jìn)行傳代，傳代周期一般為3天。細(xì)胞傳代步驟如下：1)先棄去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基，pbs洗2次；2)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加1ml胰蛋白酶-edta，37℃孵育約3分鐘，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓并脫落后，加入3ml完全培養(yǎng)基終止消化，并用吸管將成團(tuán)的細(xì)胞吹散；3)細(xì)胞懸液移至15ml離心管中，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞沉淀，分裝到3個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％co2中繼續(xù)培養(yǎng)。

(2)細(xì)胞凍存:細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，狀態(tài)良好并且細(xì)胞密度達(dá)到80-90％凍存細(xì)胞，步驟如下：1)配制細(xì)胞凍存液：將改良型rpmi-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、dmso按7:2:1比例混合、震蕩混勻；2)消化、離心細(xì)胞(具體見細(xì)胞傳代步驟)；3)離心后吸去上清液，加入凍存液并吹勻，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)約l×10⁷ml，移至1.2ml凍存管中。在凍存管標(biāo)記凍存日期及細(xì)胞株信息，用封口膜封口。置于4℃冰箱30分鐘，移至-20℃冰箱2小時(shí)，再移至-80℃冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中保存。

(3)細(xì)胞復(fù)蘇：1)水浴鍋預(yù)熱到37℃準(zhǔn)備；2)從-80℃冰箱或液氮中取出細(xì)胞，迅速放入37℃的水浴鍋中并搖動(dòng)，使其內(nèi)液體在1-2分鐘內(nèi)融化；3)將融化后的細(xì)胞懸液移置15ml離心管中，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，離心后棄去上清并加入完全培養(yǎng)基。4)將細(xì)胞置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞狀態(tài)并換液。

(4)細(xì)胞計(jì)數(shù)：1)細(xì)胞消化，吹散制備細(xì)胞懸液，方法同細(xì)胞傳代。用加樣器吸取20μl懸液沿蓋玻片邊緣燒靠外側(cè)滴加，使懸液由于氣壓影響均勻吸入計(jì)數(shù)察，健康活細(xì)胞呈規(guī)則圓形、透明狀。計(jì)算計(jì)數(shù)板4個(gè)角的4大格內(nèi)細(xì)胞數(shù)(格子邊線上的細(xì)胞只記上邊、不計(jì)下邊；只記左邊、不記右邊)。細(xì)胞密度＝4大格細(xì)胞總數(shù)×0.25×10⁷ml。

2、細(xì)胞增殖曲線繪制

(1)當(dāng)786-0及os-rc-2細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，密度80-90％時(shí)，制備細(xì)胞懸液并細(xì)胞計(jì)數(shù)，方法同上。調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為l×10⁵/ml；(2)接種細(xì)胞懸液1ml接種于于24孔板上，然后再根據(jù)不同條件加藥，保證每孔細(xì)胞數(shù)基本一致。同一種細(xì)胞同一種加藥條件設(shè)計(jì)計(jì)數(shù)6天，每天計(jì)數(shù)3個(gè)孔，即每種條件需設(shè)置18個(gè)孔；(3)將培養(yǎng)板置于37℃、5％co2中培養(yǎng)；(4)從接種次日開始計(jì)數(shù)，記為第1天(第0天細(xì)胞數(shù)記為接種細(xì)胞數(shù)，即1×10⁵)。每孔加200μl胰酶-edta，消化、吹散、計(jì)數(shù)即可。每隔24小時(shí)取3個(gè)孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；(5) 根據(jù)計(jì)數(shù)所得數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

3、wst-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)

(1)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-0及os-rc-2細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液、細(xì)胞計(jì)數(shù)，方法同上。調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為4×10⁴ml；(2)每孔中加入50μl細(xì)胞懸液(即2000個(gè)細(xì)胞/孔)，然后各逾加入含有設(shè)計(jì)值2倍濃度藥物的完全培養(yǎng)基50μl混勾，這樣使藥物終濃度恰好為設(shè)計(jì)值，且保證了各孔細(xì)胞數(shù)的一致性。每個(gè)條件設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；(3)將細(xì)胞置于5％co2、37℃條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育；(4)分別在24小時(shí)和48小時(shí)后終止培養(yǎng)，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)基，更換新鮮完全培養(yǎng)基，每孔加入10μlwst-8溶液，用加了新鮮完全培養(yǎng)基和wst-1溶液但沒有接種細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照；(5)避光條件下置于搖床5分鐘搖勾，后繼續(xù)放入37℃、5％co2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)；(6)酶標(biāo)儀下測(cè)定450nm吸光度值；(7)細(xì)胞活性抑制率＝(對(duì)照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值)/(對(duì)照組吸光度值/空白組吸光度值)×100％。

4、劃痕細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

(1)準(zhǔn)備無菌6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，marker筆在6孔板背面每隔1cm劃一道標(biāo)線；(2)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，pbs液洗漆2次，0.25％胰蛋白酶消化、吹散，將細(xì)胞懸液離心，更換完全培養(yǎng)基重懸。接種于標(biāo)記好的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加5×10⁵細(xì)胞；(3)37℃、5co2培養(yǎng)，待倒置相差顯微鏡下觀察各孔細(xì)胞密度約達(dá)到90％時(shí)吸取完全培養(yǎng)基，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，以消除由于血清引起的增殖對(duì)遷移作用的干擾；(6)無血清培養(yǎng)到指定時(shí)間后用高壓消毒的200μl槍頭垂直6孔板上的標(biāo)記線劃痕。劃痕與孔板上mark筆上的橫線交叉點(diǎn)即為觀察的固定點(diǎn)。(7)pbs清洗2次洗去劃下的細(xì)胞。更換新鮮的無血清培養(yǎng)基，按照實(shí)驗(yàn)條件在各組培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的藥物，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，置37℃、5co2孵箱中培養(yǎng)；(6)每個(gè)孔取8個(gè)固定點(diǎn)觀察劃痕后12h、18h的細(xì)胞遷移情況并照相，使用imagej圖像分析軟件測(cè)定每張圖片劃痕區(qū)的面積；(8)遷移率＝(觀察時(shí)間固定點(diǎn)劃痕面積-起始時(shí)間固定點(diǎn)劃痕面積)/起始時(shí)間固定點(diǎn)劃痕面積×100％。遷移抑制率＝(實(shí)驗(yàn)組遷移率-對(duì)照組遷移率)/實(shí)驗(yàn)組遷移率×100％。

5、transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

(1)取培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期786-0和os-rc-2腎癌細(xì)胞株，pbs洗漆2次，換用無血清的rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時(shí)，以減少細(xì)胞增殖對(duì)侵襲實(shí)驗(yàn)的影響；(2)準(zhǔn)備transwell小室。小室可搭置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，底面為直徑6.5mm、孔徑5μm的膜。取40μl以1:5稀釋的1mg/ml基質(zhì)膠鋪在上室，并放入4℃過夜風(fēng)干，該操作需在冰上完成，因基質(zhì)膠在室溫下易迅速凝固；(3)786-0和os-rc-2腎癌細(xì)胞株經(jīng)無血清rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)到12小時(shí)后，胰酶-edta消化、離心后吸去上清，加入無血清的rpmi-1640培養(yǎng)基 重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁶/ml；(4)將準(zhǔn)備好的帶有transwell小室的24孔板取出，下室(即24孔板的孔)中加入500μl含有10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，以提供對(duì)細(xì)胞的趨化作用。將上室搭在孔上，此時(shí)可見上室底面的膜剛好浸在了下室中的培養(yǎng)基里。觀察下室的培養(yǎng)基與上室底面的膜之間沒有氣泡即可；(5)取50μl細(xì)胞懸液加在各個(gè)孔的上室，再加入含有不同濃度藥物的無血清rpmi-1640培養(yǎng)基50μl，使各個(gè)孔上室藥物的濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度。觀察各孔中沒有氣泡；(6)將細(xì)胞放入37℃、5co2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)，取出上室。用棉棒輕柔擦拭小室膜的上面，將沒有穿過膜的細(xì)胞擦掉；(7)將小室用pbs輕柔沖洗，洗去表面的培養(yǎng)基；(8)將小室放入95％乙醇中固定10分；(9)用pbs輕柔沖洗小室表面的固定液，再將小室放入蘇木素中染色5分鐘；(10)小室放入1％鹽酸酒精中分化，自來水沖洗返藍(lán)5分鐘；(11)將小室放入伊紅中染色5分鐘，然后自來水沖洗；(12)小室依次放入75％乙醇1分鐘、85％乙醇1中分鐘、95％乙醇1中分鐘、100％乙醇4分鐘；(13)將小室風(fēng)干，用刀片小心沿邊緣切下小室底面的膜。膜底面朝上放在蓋玻片上，中性樹膠封片；(14)在正置顯微鏡下觀察，每張片在200×下取8個(gè)隨機(jī)視野，數(shù)出每個(gè)視野中穿過的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

6、統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用spss20.0(ibminc，usa)軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)用表示。多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用dunnett-t檢驗(yàn)，兩組間比較差異采用student-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a＝0.05。

三、結(jié)果及結(jié)論

1、化合物(ⅰ)對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0和os-rc-2增殖能力的影響

生長(zhǎng)曲線顯示加入不同濃度的化合物(ⅰ)后，兩種腎癌細(xì)胞株的增殖都受到了明顯的抑制。0.1mg/ml化合物(ⅰ)作用于786-0細(xì)胞24小時(shí)即出現(xiàn)顯著的抑制生長(zhǎng)作用(p<0.035)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，0.1mg/ml化合物(ⅰ)及0.25mg/ml化合物(ⅰ)對(duì)細(xì)胞增殖保持明顯的抑制作用，而0.5mg/ml化合物(ⅰ)使786-0細(xì)胞的增殖停滯?；衔?ⅰ)對(duì)os-rc-2細(xì)胞的增殖同樣有抑制作用，在培養(yǎng)第3天0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml表現(xiàn)出對(duì)os-rc-2細(xì)胞的顯著抑制(p分別為0.026、0.004、0.002)。繪制的生長(zhǎng)曲線顯示化合物(ⅰ)對(duì)786-0細(xì)胞株的增殖抑制作用較對(duì)os-rc-2細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯。生長(zhǎng)曲線周期中每天的細(xì)胞增殖情況見表1(注：*在相應(yīng)作用時(shí)間與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05))。

wst-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物(ⅰ)對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞及os-rc-2細(xì)胞活力均有明顯的抑制作用，化合物(ⅰ)0.1mg/ml即在24小時(shí)對(duì)786-0及os-rc-2細(xì)胞的活力有顯著的抑制作用，且與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物在24小時(shí)對(duì)兩種細(xì)胞的半 數(shù)抑制濃度(ic50)分別為3.5mg/ml和16.45mg/ml，在48小時(shí)分別為為0.165mg/ml和1.762mg/ml。對(duì)兩種細(xì)胞的活性抑制作用見表2(注：*在相應(yīng)作用時(shí)間與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05))。

2、化合物(ⅰ)抑制腎癌細(xì)胞株遷移和侵襲能力

細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物(ⅰ)對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0和os-rc-2的遷移能力有抑制作用，化合物(ⅰ)0.25mg/ml組在6h、12h、18h對(duì)786-0遷移的抑制率為10.95％、21.96％和43.02％，12h和18h的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值分別為0.004和0.000)；對(duì)os-rc-2的抑制率為3.81％、19.67％、28.44％，12h和18h的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值分別為0.009和0.000)。化合物(ⅰ)0.5mg/ml組在6h、12h、18h對(duì)786-0的抑制率為76.82％、81.18％、和82.62％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值分別為0.001、0.000和0.000)；對(duì)os-rc-2細(xì)胞的抑制率為22.01％、52.95％、和61.50％，12小時(shí)和18小時(shí)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值分別為0.000和0.000)。各組在對(duì)應(yīng)時(shí)間的遷移率如表3。

transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過12小時(shí)后，786-0細(xì)胞株加藥組(0.25mg/ml化合物(ⅰ))和對(duì)照組每個(gè)200×視野穿過的細(xì)胞數(shù)分別為262.38±22.13和74.75±10.50，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＝0.000)；os-rc-2細(xì)胞株則分別為102.75±8.75、65.13±9.66，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＝0.000)。

結(jié)論，本研究結(jié)果表明一定濃度的化合物(ⅰ)對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、死亡都有顯著地影響，且在這些實(shí)驗(yàn)中對(duì)786-0細(xì)胞系的作用明顯比對(duì)os-rc-2細(xì)胞系更為明顯。表明這種藥物也有可能通過這一機(jī)制對(duì)控制腎癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移發(fā)揮一定的作用。

表1化合物(ⅰ)對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0和os-rc-2增殖能力的影響

表2化合物(ⅰ)對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0和os-rc-2抑制率的影響

表3化合物(ⅰ)對(duì)腎癌細(xì)胞株遷移和侵襲能力的影響

實(shí)施例3

片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:7的比例加入賦形劑，制粒壓片。

實(shí)施例4

口服液制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服液。

實(shí)施例5

膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:7的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。

實(shí)施例6

注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。

實(shí)施例7

無菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。

上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫 離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。