本發(fā)明屬醫(yī)藥食品
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種以姜黃屬植物為原料制備的總倍半萜及三種倍半萜單體化合物及制備方法和其在制備具有抗糖尿病效果的藥物、保健食品和功能食品等產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：姜黃屬常用中藥包括姜黃、郁金和莪術(shù)。姜黃為植物姜黃(curcumalongal.)的干燥根莖；郁金為溫郁金(curcumawenyujiny.h.chenetc.ling)，姜黃(curcumalongal.)，廣西莪術(shù)(curcumakwangsiensiss.g.leeetc.f.liang)或蓬莪術(shù)(curcumaphaeocaulisval.)的干燥塊根，前兩者分別習(xí)稱“溫郁金”和“黃絲郁金”，其余按性狀不同習(xí)稱“桂郁金”或“綠絲郁金”；莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)(curcumaphaeocaulisval)，廣西莪術(shù)(curcumakwangsiensiss.g.leeetc.f.liang)或溫郁金(curcumawenyuiny.h.chenetc.ling)的干燥根莖，后者習(xí)稱“溫莪術(shù)”。中醫(yī)認(rèn)為，姜黃屬中藥具有行氣破血、消積止痛、清心解郁等功效。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外又從基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用等方面對(duì)該屬中藥做了大量研究工作，發(fā)現(xiàn)姜黃屬植物的根莖和塊根主要含有倍半萜(揮發(fā)油)類(lèi)和姜黃素類(lèi)成分，藥理活性以抗腫瘤和抗炎活性為主，較少見(jiàn)到姜黃屬植物中倍半萜的抗糖尿病活性的報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃屬植物中的總倍半萜具有良好的增加葡萄糖消耗的活性，其中主要活性物質(zhì)為莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮，本申請(qǐng)?zhí)峁┝丝偙栋胼坪腿N單體倍半萜及制備方法和其在抗糖尿病方面的用途。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供具有抗糖尿病活性的一種姜黃屬植物總倍半萜提取物，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：將姜黃屬植物的根制成飲片后，按藥材/溶劑(重量/體積比)加入8-12倍量有機(jī)溶劑，室溫浸提或回流提取2-3次，減壓濃縮得浸膏，用適量水將此浸膏混懸溶解，然后用低極性有機(jī)溶劑液液萃取至無(wú)顏色變化，回收溶劑，干燥得到該總倍半萜。其中提取有機(jī)溶劑包括70-95％乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷；萃取所用的低極性有機(jī)溶劑包括石油醚、己烷、二氯甲烷或三氯甲烷。該總倍半萜提取物中含有多種倍半萜單體，主要包括莪術(shù)烯醇(化合物1)、莪術(shù)二酮(化合物2)和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮(化合物3)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供三種主要倍半萜單體化合物的制備方法，通過(guò)以下步驟獲得：將總倍半萜提取物再經(jīng)過(guò)硅膠色譜柱純化，有機(jī)溶劑梯度洗脫，可得到三個(gè)含主要成分的部分，然后分別用有機(jī)溶劑結(jié)晶得到莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮的純品。其中，梯度洗脫使用的有機(jī)溶劑為石油醚或己烷：乙酸乙酯或丙酮體系，梯度范圍為50-70:1、20-40:1、10-20:1，分別相應(yīng)地制備得到化合物2、3、1的粗品。結(jié)晶所用的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、己烷及其組成的二相或三相系統(tǒng)。以上所述的姜黃屬植物，包括溫郁金curcumawenyujin、姜黃curcumalonga、廣西莪術(shù)curcumakwangsiensis、蓬莪術(shù)curcumaphaeocaulis、郁金curcumaaromatica等姜黃屬常用植物。通過(guò)多種波譜技術(shù)測(cè)試了莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮的性質(zhì)，包括uv、ir、ms及nmr(1d及2dnmr)以及x-射線單晶衍射，在對(duì)波譜信息進(jìn)行詳細(xì)的解析后確證結(jié)構(gòu)為莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮。結(jié)構(gòu)如下：化合物(1)：莪術(shù)烯醇curcumenol的結(jié)構(gòu)如下：化合物(2)莪術(shù)二酮curdione的結(jié)構(gòu)如下：化合物(3)蓬莪術(shù)環(huán)氧酮zederone的結(jié)構(gòu)如下：本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的總倍半萜及莪術(shù)烯醇(化合物1)、莪術(shù)二酮(化合物2)和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮(化合物3)在抗糖尿病方面的用途，包括制備抗糖尿藥物、抗糖尿保健食品或功能食品等產(chǎn)品中的應(yīng)用。本研究選取了人肝腫瘤細(xì)胞系hepg2對(duì)總倍半萜、莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮的抗糖尿病活性的研究，結(jié)果顯示總倍半萜及莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮能有效增加人肝癌細(xì)胞系hepg2的葡萄糖消耗。其中總倍半萜(10μg/ml)的葡萄糖消耗增加百分率為64.1，莪術(shù)烯醇(10μm)、莪術(shù)二酮(10μm)和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮(10μm)的葡萄糖消耗增加百分率為47.0、74.0、57.0，表明他們具有明顯的抗糖尿病活性。本發(fā)明提供的具有抗糖尿病活性的總倍半萜及莪術(shù)烯醇(化合物1)、莪術(shù)二酮(化合物2)和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮(化合物3)，通過(guò)添加一定輔料，可以應(yīng)用于制備抗糖尿病藥物、保健食品和功能食品。本發(fā)明開(kāi)發(fā)了姜黃屬植物中倍半萜的抗糖尿病新用途，拓展了姜黃屬植物的藥物作用范圍，為推廣利用和深加工中藥材提供依據(jù)，并提供了新的應(yīng)用方向。附圖說(shuō)明圖1是莪術(shù)烯醇的1hnmr譜(500mhzind6-dmso)。圖2是莪術(shù)烯醇的13cnmr譜(125mhzind6-dmso)。圖3莪術(shù)烯醇的質(zhì)譜。圖4是莪術(shù)二酮的1hnmr譜(500mhzincdcl3)。圖5是莪術(shù)二酮的13cnmr譜(125mhzincdcl3)。圖6是莪術(shù)二酮的質(zhì)譜。圖7是蓬莪術(shù)環(huán)氧酮的1hnmr譜(500mhzincdcl3)。圖8是蓬莪術(shù)環(huán)氧酮的13cnmr譜(125mhzind6-cdcl3)。圖9蓬莪術(shù)環(huán)氧酮的質(zhì)譜。具體實(shí)施方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1干燥的溫郁金塊根10kg，打粉，用80l的95％乙醇溶液室溫浸提兩次，每次5天。合并提取液，蒸至無(wú)醇味得總浸膏210g?？偨嘤?l的水分散，用石油醚等體積萃取，得到石油醚萃取部分clp，干燥后得到總倍半萜(98g)。再將總倍半萜上200～300目硅膠，用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫(1:0-0:1)，收集石油醚：乙酸乙酯50:1、20:1、10:1洗脫流份，再用正己烷-丙酮系統(tǒng)結(jié)晶即可分別得到化合物2(2g)、化合物3(400mg)和化合物1(4g)。實(shí)施例2干燥的郁金根莖8.5kg，打粉，用85l的乙酸乙酯回流提取3次，每次4h，過(guò)濾后合并提取液，得到總浸膏900g?？偨嘤?l的水分散，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑后得到氯仿部位，干燥后得到總倍半萜180g。將氯仿部位浸膏用200-300目硅膠柱色譜分離，石油醚-丙酮(1:0-1:1)梯度洗脫，收集其中的石油醚-丙酮(60:1)、(30:1)和(15:1)部位，分別得到化合物2、化合物3和1的粗品。然后用二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)重結(jié)晶，可分別得到化合物2(3g)、化合物3(100mg)和1(1g)的純品。實(shí)施例3干燥的姜黃粗粉5kg，粉碎后加入40l二氯甲烷，80攝氏度回流提取兩次，第一次2小時(shí)，提取液過(guò)濾后補(bǔ)加40l二氯甲烷繼續(xù)回流提取1小時(shí)。合并兩次提取液后減壓濃縮得浸膏270g，用2l水將此浸膏混懸溶解，用正己烷等體積萃取，干燥后得到總倍半萜110g。實(shí)施例4干燥的蓬莪術(shù)藥材飲片9kg，用8倍量的環(huán)己烷回流提取2次，每次2h；合并2次提取液，減壓回收溶劑，得到環(huán)己烷部位135g，即為總倍半萜部位。再將總倍半萜上100目硅膠，用己烷-乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫(1:0-0:1)，收集己烷：乙酸乙酯60:1、25:1、15:1洗脫流份，再用二氯甲烷結(jié)晶即可分別得到化合物2(2g)、化合物3(600mg)和化合物1(3g)。實(shí)施例5干燥的蓬莪術(shù)藥材飲片2kg，用超臨界co2設(shè)備進(jìn)行萃取，萃取溫度為50℃，提取2次，每次2h；合并2次提取液，減壓回收溶劑，得到總倍半萜部位35g。實(shí)施例6莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮的波譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。表1.莪術(shù)烯醇(1)(d6-dmso)、莪術(shù)二酮(2)(cdcl3)和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮(3)的1h(500mhz)和13c(125mhz)nmr數(shù)據(jù)及信號(hào)歸屬實(shí)施例7抗糖尿病活性研究總倍半萜、莪術(shù)烯醇(1)、莪術(shù)二酮(2)和蓬莪術(shù)環(huán)氧酮(3)的抗糖尿病活性研究方法：hepg2細(xì)胞用含10％胎牛血清的高糖型dmem培養(yǎng)基于37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，隔天更換新鮮培養(yǎng)液，2-3天傳代1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)，hepg2細(xì)胞接種于96孔板，并設(shè)無(wú)細(xì)胞空白對(duì)照孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％融合，棄去原培養(yǎng)基，用pbs緩沖液洗2遍，換上含0.2％bsa的無(wú)血清1640培養(yǎng)液，分組加藥。設(shè)dmso對(duì)照組，met(鹽酸二甲雙胍)對(duì)照組(終濃度為1mm)和不同受試組。作用24h后，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定每孔培養(yǎng)液的葡萄糖含量。每孔培養(yǎng)液葡萄糖消耗量＝無(wú)細(xì)胞空白孔培養(yǎng)液葡萄糖含量－每孔培養(yǎng)液葡萄糖含量，每組設(shè)3個(gè)以上復(fù)孔。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。葡萄糖含量測(cè)定后，細(xì)胞用10％三氯醋酸固定1小時(shí)，用雙蒸水洗滌并干燥后，每孔加入100微升srb溶液(4mg/ml)，室溫染色20分鐘，1％醋酸洗滌，干燥。每孔加入100微升10mmtris溶液使srb溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔o(hù)d值(檢測(cè)波長(zhǎng)：515nm)，用于反映細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，以矯正細(xì)胞接種數(shù)目及受試物毒性等綜合因素造成的實(shí)驗(yàn)誤差。最后計(jì)算各組葡萄糖消耗量與溶劑對(duì)照組比較的增加百分率。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t-檢驗(yàn)。結(jié)果：陽(yáng)性藥met和受試物作用于人肝hepg2細(xì)胞24h后，與溶劑對(duì)照組比較，1mmmet促進(jìn)葡萄糖消耗的百分率為67.6％(p<0.01)；10μm化合物1、2和3以及總倍半萜10μg/ml增加葡萄糖消耗百分率分別為47.0％(p<0.01)，74.0％(p<0.05)，57.0％(p<0.05)以及64.1％(p<0.05)，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2.表2.受試物對(duì)人肝hepg2細(xì)胞24h葡萄糖消耗的影響(n＝4)組別受試物濃度葡萄糖消耗(mm)葡萄糖消耗增加百分率(％)dmso0.5％v/v1.07±0.16-met1mm1.79±0.18**67.6110μm1.57±0.21**47.0210μm1.86±0.61*74.0310μm1.68±0.41*57.0總倍半萜10μg/ml1.76±0.49*64.1實(shí)施例8總倍半萜片劑的制備總倍半萜10.0g與淀粉180g混勻，加10％淀粉漿4g制成軟材，加入硬脂酸鎂0.04g，干淀粉3.6g混勻后壓制成2000片，即得。每片含總倍半萜5mg。實(shí)施例9總倍半萜滴丸劑的制備精密稱取0.50g的總倍半萜，加適量無(wú)水乙醇，微熱溶解，加人到3.75g的peg4000熔融液中，攪拌混合均勻，直至乙醇揮盡，靜置于90℃水浴上保溫30min。待氣泡除盡，在保溫的條件下，用1.6mm的注射器吸取熔融物,控制滴距在6～8cm范圍內(nèi)，冷卻高度為15cm，滴人5℃冷凝液液體石蠟中待冷凝完全，傾去冷凝液，收集滴丸，瀝凈和用濾紙除去滴丸上的冷凝液，即得。每粒滴丸含總倍半萜5mg。實(shí)施例10莪術(shù)烯醇片劑的制備莪術(shù)烯醇14.0g與淀粉90g混勻，加10％淀粉漿2g制成軟材，加入硬脂酸鎂0.02g，干淀粉1.8g混勻后壓制成2000片，即得。每片含莪術(shù)烯醇7mg。實(shí)施例11莪術(shù)二酮片劑的制備莪術(shù)烯醇10g與淀粉90g混勻，加10％淀粉漿2g制成軟材，加入硬脂酸鎂0.02g，干淀粉1.8g混勻后壓制成2000片，即得。每片含總倍半萜5mg。當(dāng)前第1頁(yè)12