本發(fā)明涉及一種天然的植物提取物，具體涉及一種從喙果皂帽花莖中提取的阿樸啡生物堿及提取方法。

背景技術(shù)：

喙果皂帽花（dasymaschalonrostratum）是番荔枝科喙果皂帽花屬（dasymaschalon）植物。近年來(lái)藥理篩選表明其具有很好的生物活性。例如周立冬等（喙果皂帽花的a環(huán)具酮基黃酮類(lèi)化合物和氧化阿樸咔類(lèi)生物堿【j】.中國(guó)中藥雜志，2001.26（1）：39）從其莖中分離得3個(gè)a環(huán)具酮基黃酮類(lèi)化合物和1個(gè)氧化阿樸咔類(lèi)生物堿，均具有抗腫瘤活性。宋煌旺、宋鑫明等（喙果皂帽花揮發(fā)油gc-ms分析及活性研究，中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，第19卷第16期，2013年8月）經(jīng)過(guò)gc-ms分析喙果皂帽花葉揮發(fā)油得到91個(gè)化合物，堅(jiān)定了73個(gè)化合物，占總含量的90.25%，主要為烯類(lèi)化合物。喙果皂帽花葉的揮發(fā)油中含有很多活性成分，β-欖香烯能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞核酸合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化，而且能增強(qiáng)腫瘤的免疫原性。α-石竹烯可強(qiáng)烈誘導(dǎo)小鼠肝和小腸中的解毒酶谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶活性而對(duì)化學(xué)致癌起抑制作用。

對(duì)喙果皂帽花進(jìn)一步的化學(xué)成分分離、結(jié)構(gòu)鑒定和物質(zhì)用途的工作還需繼續(xù)進(jìn)行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種從喙果皂帽花中提取的阿樸啡生物堿及提取方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種由下述式（?。┍硎镜陌惴壬飰A：

（ⅰ）。

上述阿樸啡生物堿從喙果皂帽花中提取，包括以下步驟：

①將自然風(fēng)干的喙果皂帽花的莖粉碎后用乙醇浸泡回流提取，將收集到的回流液合并、減壓蒸餾，得到乙醇總浸膏，然后將上述乙醇總浸膏均勻分散于蒸餾水中，用石油醚進(jìn)行萃取，得到石油醚部位浸膏；對(duì)石油醚萃取后的水相進(jìn)行酸堿處理，先用hcl調(diào)節(jié)水相ph值為1～2，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到非生物堿層的乙酸乙酯部位浸膏；接著用naoh調(diào)節(jié)乙酸乙酯萃取后得到的水相的ph值為10～11，用氯仿進(jìn)行萃取，得到生物堿層氯仿部位浸膏；

②將步驟①得到的生物堿層氯仿部位浸膏經(jīng)過(guò)硅膠柱層析，采用氯仿-甲醇溶劑體系進(jìn)行梯度洗脫，收集、濃縮、合并相同流分；

③將步驟②硅膠柱分離得到的第二大段組份依次進(jìn)行硅膠柱色譜分離和sephadexlh-20葡聚糖凝膠柱層析分離，最后經(jīng)高效液相色譜分離得到目標(biāo)提取物阿樸啡生物堿。

上述步驟③中硅膠柱色譜分離使用的溶劑體系為氯仿∶甲醇=10∶1，sephadexlh-20葡聚糖凝膠柱層析分離使用的溶劑體系為氯仿∶甲醇=1∶3，高效液相色譜分離使用的流動(dòng)相體系組成為60%乙腈和40%水。

本發(fā)明具有積極的效果：本發(fā)明從喙果皂帽花中提取獲得一種阿樸啡生物堿，該化合物對(duì)hiv-1型病毒具有較好的抑制活性。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的核磁共振氫譜圖。

圖2為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的核磁共振碳譜圖。

圖3為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的核磁共振無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)譜（dept）。

圖4為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的氫氫相關(guān)譜(h-h-cosy譜)。

圖5為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的hsqc譜。

圖6為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的hmbc譜。

圖7為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的x-ray單晶衍射圖。

圖8為本發(fā)明提取的阿樸啡生物堿的高分辨電噴霧電離質(zhì)譜（hresims）圖。

具體實(shí)施方式

（實(shí)施例1）

本發(fā)明的從喙果皂帽花中提取的阿樸啡生物堿的分子式為c20h20n2o7，分子量為401.13443，外觀(guān)為無(wú)色油狀液體，易溶于氯仿、乙酸乙酯；其結(jié)構(gòu)式如下式（?。?/p>

（ⅰ）。

從喙果皂帽花中提取上式阿樸啡生物堿的方法包括以下步驟：

①將22.5kg自然風(fēng)干的喙果皂帽花的莖粉碎后，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡回流提取3次，每次5天，將收集到的回流液合并、減壓蒸餾，得到920g的乙醇總浸膏，然后將上述乙醇總浸膏均勻分散于3.0l蒸餾水中，用石油醚（3×3.5l）進(jìn)行萃取，得到石油醚部位浸膏（260g）；對(duì)石油醚萃取后的水相進(jìn)行酸堿處理，先用1mol/l的hcl調(diào)節(jié)水相ph值為1～2，用乙酸乙酯（4×4.0l）進(jìn)行萃取，得到非生物堿層乙酸乙酯部位浸膏（430g）；接著用1mol/l的naoh調(diào)節(jié)乙酸乙酯萃取后得到的水相的ph值為10～11，用氯仿（5×4.0l）進(jìn)行萃取，得到生物堿層氯仿部位浸膏（35g）。

本實(shí)施例所用的喙果皂帽花的莖采自海南昌江縣霸王嶺國(guó)家森林保護(hù)區(qū)，標(biāo)本存放于海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

②將步驟①得到的35g生物堿部位的氯仿層浸膏經(jīng)過(guò)硅膠柱層析，采用氯仿-甲醇溶劑體系，按照100∶0～0∶100（v/v）的梯度進(jìn)行洗脫，每500ml收集流分，濃縮流分，通過(guò)tlc（薄層色譜）檢測(cè)，合并相同流分。

③將步驟②硅膠柱分離得到的第二大段組份依次進(jìn)行硅膠柱色譜分離（溶劑體系氯仿∶甲醇=10∶1，v/v）和sephadexlh-20葡聚糖凝膠柱層析（溶劑體系為氯仿∶甲醇=1∶3，v/v）分離后，最后經(jīng)高效液相色譜使用流動(dòng)相60%乙腈和40%水（流動(dòng)相中含0.1%二乙胺）分離得到目標(biāo)提取物阿樸啡生物堿9.6mg。

目標(biāo)提取物阿樸啡生物堿產(chǎn)品分析：

分離得到的目標(biāo)提取物的旋光值為[α]²⁵d-158.2（檢測(cè)儀器為上海樸貝公司的jascop-1020型號(hào)的旋光儀）。

阿樸啡生物堿的核磁共振氫譜圖（布魯克(北京)科技有限公司av-iii400mhz型號(hào)核磁共振儀，以下檢測(cè)也使用該臺(tái)儀器，溶劑cdcl3，tms內(nèi)標(biāo)，400/100hz）見(jiàn)圖1。

阿樸啡生物堿的核磁共振碳譜圖（溶劑cdcl3，tms內(nèi)標(biāo)，100mhz）見(jiàn)圖2。

化合物的¹h和¹³c-nmr(400/100mhz,cdcl3)數(shù)據(jù)如下表1。

表1化合物1的¹h和¹³c-nmr(400/100mhz,cdcl3)數(shù)據(jù)(ppm)

阿樸啡生物堿的核磁共振無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)（dept）譜見(jiàn)圖3，溶劑cdcl3。

阿樸啡生物堿的氫氫相關(guān)譜(h-h-cosy譜)見(jiàn)圖4，溶劑cdcl3。

阿樸啡生物堿的hsqc譜見(jiàn)圖5，溶劑cdcl3。

阿樸啡生物堿的hmbc譜見(jiàn)圖6，溶劑cdcl3。

阿樸啡生物堿的x-ray衍射見(jiàn)圖7。

阿樸啡生物堿的高分辨電噴霧電離質(zhì)譜圖（q-traplc/ms/mssystem質(zhì)譜儀，esi源）見(jiàn)圖8，圖中[m+h]⁺的calc.mass—理論分子量為401.13445，實(shí)測(cè)分子量401.13443。

總結(jié)：根據(jù)化合物的圖8高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)401.13443[m+h]⁺，推算出該化合物的分子式為c20h20n2o7，不飽和度為12。

¹hnmr譜中顯示，在低場(chǎng)區(qū)有3個(gè)單峰的質(zhì)子信號(hào)δh6.51(1h,s,h-10),6.00(1h,s,och2o),5.84(1h,s,och2o),3個(gè)甲氧基信號(hào)δh4.02(3h,s,ch3o-3),3.93(3h,s,ch3o-9)和3.94(3h,s,ch3o-11),1個(gè)次甲基信號(hào)δh3.71(1h,dt,j=14.8,2.0hz,h-6a),此外，還有3個(gè)亞甲基信號(hào)δh3.35(1h,m,h-5),2.87(1h,m,h-5),2.83(2h,m,h-4),2.78(1h,dd,j=14.8,4.0hz,h-7),2.44(1h,t,j=14.8hz,h-7)。¹³cnmr和dept顯示20個(gè)碳信號(hào)，包括2個(gè)苯環(huán)和8個(gè)sp³雜化碳(3個(gè)甲氧基，4個(gè)亞甲基，1個(gè)次甲基碳)。分析光譜數(shù)據(jù)可知該化合物是一個(gè)阿樸啡類(lèi)生物堿化合物。結(jié)合¹h-¹hcosy,hsqc和hmbc譜分析可以進(jìn)一步證實(shí)該化合物是一個(gè)阿樸啡類(lèi)生物堿化合物。在hmbc譜中，通過(guò)h-och3-3與c-3、h-och3-9與c-9、h-och3-11與c-11的相關(guān)確定三個(gè)甲氧基分別連在c-3、c-9和c-11位。

從化合物hresims401.13443[m+h]⁺判定化合物中含兩個(gè)氮原子，且c-8位少了一個(gè)質(zhì)子氫信號(hào)，推測(cè)c-8連有一個(gè)硝基。以上推測(cè)通過(guò)hmbc譜h-10,h-7與c-8的相關(guān)得到確認(rèn)。同時(shí)，通過(guò)緩慢的揮發(fā)甲醇溶劑得到該化合物的單晶，圖7的x-ray衍射清晰證實(shí)了該化合物中c-8位連有一個(gè)硝基。通過(guò)x-ray衍射和左旋旋光值[α]²⁵d-158.2(c0.25,meoh)確定該化合物的絕對(duì)構(gòu)型為6ar.因此，該化合物是一個(gè)含有硝基的阿樸啡生物堿，是一種天然化合物，結(jié)構(gòu)式如上式（?。?。發(fā)明人將其命名為dasymaroinea。

（試驗(yàn)例1、化合物的體外抗hiv活性評(píng)價(jià)）

試驗(yàn)方法：取實(shí)施例1分離得到的阿樸啡生物堿對(duì)hiv-1進(jìn)行活性測(cè)試。以hiv-1病毒感染的mt4細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停圆《疽鸷习w的產(chǎn)生為評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀(guān)察藥物的作用。

將8×10⁵/mlc8166細(xì)胞50μl/孔接種到含有100μl/孔梯度倍比稀釋藥物的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，然后加入50μl的hiv-1iiib稀釋上清，1300tcid50/孔(tcid5050%tissuecultureinfectivedose，即感染50%培養(yǎng)細(xì)胞所需病毒量)。設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不含藥物的正常細(xì)胞對(duì)照孔。置37℃，5%co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天，倒置顯微鏡下(100×)計(jì)數(shù)合胞體的形成。ec50(50%effectiveconcentration)為抑制合胞體形成50%時(shí)的化合物濃度。mtt法測(cè)定細(xì)胞活性，確定cc50值。azt(3?-azido-3?-deoxythymidine)為陽(yáng)性藥物對(duì)照。

試驗(yàn)結(jié)果如下：

上表中：^acc50:半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(50%cytotoxicconcentration)。

^bec50:半數(shù)有效濃度(50%effectiveconcentration)。

^cti治療指數(shù)(therapeuticindex)=cc50/ec50。

^dazt(3?-azido-3?-deoxythymidine)為陽(yáng)性對(duì)照。

試驗(yàn)結(jié)果表明該化合物有一定的細(xì)胞毒性，對(duì)hiv-1型病毒具有較好的抑制活性，ec50為4.50μm，治療指數(shù)(ti)為6.38。