本發(fā)明屬藥物化學(xué)和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及新的噻唑烷酮類衍生物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

據(jù)資料顯示，20世紀五六十年代，全世界每年死于感染性疾病的人數(shù)約為700萬，而到了本世紀初上升到2000萬，其中死于敗血癥的人數(shù)上升了89%。美國nih的調(diào)查結(jié)果顯示：80%以上的細菌性感染與生物膜有關(guān)。細菌生物膜不但可以抵擋宿主的免疫殺傷，而且對大多數(shù)抗生素耐藥，其耐藥性比浮游菌高達1000倍。更嚴重的是生物膜內(nèi)的細菌可持續(xù)從生物膜中脫落進入體液和血液循環(huán)，從而引起病人心血管、耳鼻咽喉等部位慢性反復(fù)性感染，甚至發(fā)生敗血癥而死亡，死亡率高達8.9%。目前表皮葡萄球菌因生物膜感染已上升為醫(yī)院臨床細菌感染的前4位，由表皮葡萄球菌引起的靜脈留置導(dǎo)管相關(guān)血液感染的治療費用僅在美國每年就高達20億美元；徹底清除感染灶的唯一方法是將植入的醫(yī)療器械取出或更換，而更換一個細菌生物膜感染的人工關(guān)節(jié)或人工瓣膜費用高達數(shù)萬元。所以研究如何有效治療和控制細菌生物膜感染是當今世界范圍內(nèi)生物醫(yī)藥領(lǐng)域亟待解決的重大課題，具有十分重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。

現(xiàn)存的大多數(shù)抗生素都不能有效地穿透生物膜，或者因?qū)Σ牧媳砻娓街痛x率低的細菌殺傷作用有限而不能有效地治療生物膜相關(guān)感染。達托霉素和利奈唑胺是目前臨床治療葡萄球菌引起的生物膜相關(guān)感染的藥物，但研究表明它們均無法殺死生物膜中的細菌。萬古霉素是治療mrsa,mrse和其它多重耐藥的革蘭氏陽性菌的最后一道防線，但是它也不能對生物膜中的細菌進行有效的殺傷。利福平雖然可以滲透進入生物膜和有效防止生物膜的形成，但其副作用非常嚴重，包括肝臟損害，流感綜合征，腎臟損害，和皮膚綜合征。近年來文獻報道具有抑制細菌生物膜的活性化合物主要有胺基咪唑類，抗菌肽類，多酚類天然產(chǎn)物等，但研究進展緩慢，至今尚未有抗細菌生物膜的新藥上市。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供新型噻唑烷酮類衍生物。

本發(fā)明的另一個目的是提供該新型噻唑烷酮類衍生物的制備方法和用途。

本發(fā)明提供了如下式（1）所示的新型噻唑烷酮類衍生物：

（1）

式中，r1代表取代或非取代的吡啶基，r2代表氫或取代或非取代的烷基、烷氧基、羥基、鹵素、胺基、硝基、氰基、氨基甲?；被酋；⑷谆?、三氟甲氧基、巰基、羧基或酯基；x代表氧、硫或nh?；蛘咭陨涎苌镌谒帉W(xué)上可接受的鹽、酯、立體異構(gòu)體或前藥。

本發(fā)明還提供了上述噻唑烷酮類衍生物的制備方法，其具體步驟如下：

步驟a：胺基吡啶類化合物（2）在堿的催化下，在沒有溶劑條件下或在溶劑中與氯乙酰氯反應(yīng)生成氯乙酰氨基吡啶類化合物（3）；

步驟b：氯乙酰氨基吡啶類化合物（3）在堿的催化下，在沒有溶劑條件下或在溶劑中與異硫氰酸苯酯類化合物（4）反應(yīng)成環(huán)生成2-苯亞氨基-3-吡啶-噻唑-4-酮類化合物（5）；

步驟c：2-苯亞氨基-3-吡啶-噻唑-4-酮類化合物（5）與苯甲酸類化合物（6）在催化劑存在的條件下，在溶劑中回流進行縮合反應(yīng)，生成相應(yīng)的噻唑烷酮類化合物（1）。

所述步驟a中所述的堿可以是有機堿，如三乙胺、吡啶、n,n-二異丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一碳烯和1,2,2,6,6-五甲基哌啶等，也可以是無機堿，如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等；在該制備方法中所使用的溶劑可以是任何一種溶劑，只要該溶劑本身在反應(yīng)中是惰性的，且不會抑制反應(yīng)；所述的溶劑包括鹵代烴溶劑，如二氯甲烷，氯仿，1,2-二氯乙烷等；芳族烴類溶劑，如苯和甲苯等；非質(zhì)子傳遞性溶劑，如丙酮、乙腈，n,n-二甲基甲酰胺、n-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亞砜、環(huán)丁砜、環(huán)丁亞砜和六亞甲基磷酰三胺等；酯類溶劑，如乙酸乙酯和乙酸甲酯等；醚類溶劑，如四氫呋喃、乙醚和1,4-二噁烷等；有機堿溶劑，如吡啶、甲基吡啶等；或這些溶劑的混合物；反應(yīng)溫度可在-30℃至50℃之間，優(yōu)選采用0℃至室溫；原料摩爾比可以為任意，優(yōu)選使用1：1。

所述步驟b中所述的堿可以是有機堿，如三乙胺、吡啶、n,n-二異丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一碳烯和1,2,2,6,6-五甲基哌啶等，也可以是無機堿，如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等；在該制備方法中所使用的溶劑可以是任何一種溶劑，只要該溶劑本身在反應(yīng)中是惰性的，且不會抑制反應(yīng)。所述的溶劑包括鹵代烴溶劑，如二氯甲烷，氯仿，1,2-二氯乙烷等；芳族烴類溶劑，如苯和甲苯等；非質(zhì)子傳遞性溶劑，如丙酮、乙腈，n,n-二甲基甲酰胺、n-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亞砜、環(huán)丁砜、環(huán)丁亞砜和六亞甲基磷酰三胺等；酯類溶劑，如乙酸乙酯和乙酸甲酯等；醚類溶劑，如四氫呋喃、乙醚和1,4-二噁烷等；有機堿溶劑，如吡啶、甲基吡啶等；或這些溶劑的混合物；反應(yīng)溫度可在-30℃至50℃之間，優(yōu)選采用0℃至室溫；原料摩爾比可以為任意，優(yōu)選使用1：1；

所述步驟c中所述的催化劑可以是哌啶，所述的溶劑可以是乙醇，甲醇，冰醋酸。

本發(fā)明的噻唑烷酮類化合物可用于制備藥物，尤其是抗菌藥物。

本發(fā)明中，對通式（1）所示的化合物進行體外抑菌實驗，結(jié)果表明，所述的化合物的抑菌活性顯著高于陽性對照藥物，因而可用于制備以所述的噻唑烷酮類化合物作為有效成分的藥物。

本發(fā)明的新的噻唑烷酮類化合物可制成包含安全有效量新的噻唑烷酮類化合物及藥用載體的藥物組合物及各種制劑。

本發(fā)明中，“安全有效量”指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴重的副作用。安全有效量根據(jù)治療對象的年齡、病情、療程等來確定。

“藥用載體”指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì),它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。

“相容性”指的是組合物中各組份能與本發(fā)明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低所述化合物的藥效。

藥學(xué)上可以接受的載體部分例子有糖，如葡萄糖、蔗糖、乳糖等；淀粉，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉等；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等；明膠，滑石，固體潤滑劑，如硬脂酸、硬脂酸鎂；硫酸鈣，植物油，如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等；多元醇，如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等；乳化劑，如吐溫?；潤濕劑，如十二烷基硫酸鈉；著色劑，調(diào)味劑，穩(wěn)定劑，抗氧化劑，防腐劑，無熱原水等。

為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

具體實施方式

實施例1：合成氯乙酰氨基吡啶類化合物（3a-e）

取代氨基吡啶（2a-e,20mmol）加入100ml反應(yīng)瓶中，取20ml干燥二氯甲烷作為溶劑，加入氯乙酰氯（24mmol）完全溶解后，將三乙胺（24mmol）緩慢滴入反應(yīng)瓶中，tlc(ch2cl2:ch3oh=30:1)檢測反應(yīng)，常溫下攪拌5h終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去二氯甲烷，加水和乙酸乙酯多次萃取，有機相無水na2so4干燥除水，殘余物通過快速柱層析純化，得到以下目標物3a-e。

3a：白色固體；產(chǎn)率78%；¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.99(s,1h),8.32(d,j=4.0hz,1h),8.22(d,j=8.3hz,1h),7.77(t,j=7.1hz,1h),7.18–7.03(m,1h),4.21(s,2h)。

3b：白色固體；產(chǎn)率75%；¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.62(s,1h),8.26(s,1h),7.53(t,j=8.8hz,1h),7.22(s,1h),4.36(s,2h)。

3c：白色固體；產(chǎn)率81%；¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.97(s,1h),8.25(dd,j=9.0,3.9hz,1h),8.18(d,j=2.8hz,1h),7.56–7.41(m,1h),4.21(s,2h)。

3d：白色固體；產(chǎn)率76%；¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.70(s,1h),8.07(d,j=7.8hz,1h),7.83(q,j=8.1hz,1h),6.73(dd,j=8.0,2.4hz,1h),4.20(s,2h)。

3e：白色固體；產(chǎn)率72%；¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.93(s,1h),8.73(dd,j=8.1,1.4hz,1h),8.26–8.02(m,1h),7.30(dd,j=8.1,4.7hz,1h),4.25(s,2h)。

實施例2：合成2-苯亞氨基-3-吡啶-噻唑-4-酮類化合物（5a-g）

氯乙酰氨基吡啶（3a-e,5mmol），異硫氰酸苯酯或?qū)u異硫氰酸苯酯（6mmol），碳酸鉀（7.5mmol）并使用乙腈作為溶劑，tlc(pe:ea=2:1)檢測反應(yīng)進程，常溫下過夜得到目標物。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去乙腈，乙酸乙酯/水萃取，有機層用無水na2so4干燥除水，除去乙酸乙酯后殘余物通過快速柱層析純化，得到目標物5a-g。

5a：白色固體，產(chǎn)率80%，¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.70(d,j=3.3hz,1h),7.90(t,j=6.7hz,1h),7.42(d,j=7.2hz,2h),7.27(s,1h),7.00(t,j=8.6hz,1h),6.87(dd,j=13.1,6.9hz,2h),4.01(d,j=1.6hz,2h)。

5b：白色固體，產(chǎn)率72%，¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.71(d,j=3.4hz,1h),7.93(t,j=6.8hz,1h),7.43(d,j=7.3hz,2h),7.28(s,1h),7.00(t,j=8.7hz,1h),6.89(dd,j=13.0,6.8hz,2h),4.02(d,j=1.5hz,2h)。

5c：白色固體，產(chǎn)率75%，¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.51(d,j=4.1hz,1h),7.65(t,j=7.8hz,1h),7.49(dt,j=8.4,4.3hz,1h),7.27(d,j=8.7hz,2h),6.87(d,j=8.6hz,2h),4.05(s,2h).

5d：白色固體，產(chǎn)率73%，¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.65(d,j=3.4hz,1h),7.90(t,j=6.8hz,1h),7.40(d,j=7.3hz,2h),7.26(s,1h),7.01(t,j=8.7hz,1h),6.87(dd,j=13.0,6.8hz,2h),4.00(d,j=1.5hz,2h)。

5e：白色固體，產(chǎn)率69%，¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.54(d,j=2.8hz,1h),7.62(td,j=8.6,2.9hz,1h),7.46(dd,j=8.7,3.9hz,1h),7.32(t,j=7.7hz,2h),7.12(t,j=7.4hz,1h),6.92(d,j=7.4hz,2h),4.00(s,2h)。

5f：白色固體，產(chǎn)率78%，¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ7.99(dd,j=15.7,7.9hz,1h),7.32(dd,j=14.6,7.2hz,3h),7.12(t,j=7.4hz,1h),7.05(dd,j=8.1,2.1hz,1h),6.92(d,j=7.4hz,2h),3.98(s,2h)。

5g：白色固體，產(chǎn)率82%，¹hnmr(400mhz,cdcl3)：δ8.57–8.38(m,1h),7.78(dd,j=7.7,1.5hz,1h),7.43(dd,j=7.7,4.8hz,1h),7.33(t,j=7.7hz,2h),7.13(t,j=7.4hz,1h),6.92(d,j=7.4hz,2h),4.05(q,j=17.2hz,2h)。

實施例3：合成目標化合物（1a-i）

2-苯亞氨基-3-吡啶-噻唑-4-酮類化合物（5a-g）（1mmol），苯丙酸類化合物（6,1mmol），β-丙氨酸（1mmol），并使用冰醋酸（5ml）做溶劑，100℃回流，tlc（ch2cl2:ch3oh=15:1）檢測反應(yīng)，大約3h反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液冷卻后加入大量水，過濾析出的固體，濾餅通過快速柱層析純化，得到目標物1a-i。

3-{5-[2-(4-氟苯亞氨基)-3-(吡啶-2-基)-噻唑-4-酮-5-亞基甲基]呋喃-2-基}苯甲酸(1a)：淡黃色固體，產(chǎn)率93.1%；¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.23(s,1h),8.67(s,1h),8.27(s,1h),8.08(t,j=7.5hz,1h),7.91(dd,j=17.4,7.7hz,2h),7.71(d,j=6.3hz,2h),7.56(dt,j=15.4,7.6hz,2h),7.39(d,j=3.4hz,1h),7.25(dd,j=17.7,6.3hz,3h),7.06(s,2h)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ166.75,165.04,155.50,149.68,149.58,148.33,143.84,139.18,131.89,129.49,129.24,128.05,124.83,124.52,124.30,122.84,122.75,120.55,118.20,117.18,116.31,116.09,110.58；esi-msm/z486.0[m+h]⁺.

3-{5-[2-(4-氯苯亞氨基)-3-(吡啶-2-基)-噻唑-4-酮-5-亞基甲基]呋喃-2-基}苯甲酸(1b)：淡黃色固體，產(chǎn)率92.2%；¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.24(s,1h),8.68(s,1h),8.29(s,1h),8.09(t,j=7.4hz,1h),7.90(m,2h),7.71(s,2h),7.62–7.45(m,4h),7.39(d,j=3.5hz,1h),7.23(s,1h),7.05(d,j=7.9hz,2h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ166.74,164.98,155.48,151.53,149.69,149.53,148.24,146.39,139.20,131.90,129.43,129.24,129.16,127.96,124.87,124.68,124.29,122.95,120.54,118.13,117.34,110.60;esi-msm/z502.0[m+h]⁺.

3-{5-[2-(4-氯苯亞氨基)-3-(3-氟吡啶-2-基)-噻唑-4-酮-5-亞基甲基]呋喃-2-基}苯甲酸(1c)：淡黃色固體，產(chǎn)率89.6%；¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.43–13.09(m,1h),8.56(s,1h),8.29(s,1h),8.11(s,1h),7.94(d,j=7.6hz,1h),7.88(d,j=7.1hz,1h),7.78(s,2h),7.52(dd,j=23.2,8.1hz,3h),7.41(d,j=3.5hz,1h),7.27(d,j=3.6hz,1h),7.06(d,j=8.6hz,2h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ166.76,164.26,155.90,153.36,150.15,149.34,145.80,136.03,135.90,133.27,131.97,130.67,129.65,129.55,129.15,128.99,128.07,127.93,126.45,126.27,124.77,122.95,121.39,118.50,116.78,110.74;esi-msm/z520.0[m+h]⁺.

3-{5-[2-(苯亞氨基)-3-(3-氟吡啶-2-基)-噻唑-4-酮-5-亞基甲基]呋喃-2-基}苯甲酸(1d)：淡黃色固體，產(chǎn)率76.9%；¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.23(s,1h),8.58(d,j=3.8hz,1h),8.25(s,1h),8.12(t,j=8.6hz,1h),7.90(dd,j=22.3,7.4hz,2h),7.76(s,2h),7.53(t,j=7.9hz,2h),7.48–7.37(m,3h),7.30–7.20(m,2h),7.03(d,j=7.4hz,2h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ166.77,164.35,155.85,149.43,146.95,145.80,136.18,131.92,129.60,129.46,129.16,128.10,127.85,126.39,126.21,125.36,124.58,121.26,120.95,118.15,117.05,110.70;esi-msm/z486.2[m+h]⁺.

3-{5-[2-(苯亞氨基)-3-(5-氟吡啶-2-基)-噻唑-4-酮-5-亞基甲基]呋喃-2-基}苯甲酸(1e)：淡黃色固體，產(chǎn)率73.1%；¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.22(s,1h),8.70(d,j=2.6hz,1h),8.24(s,1h),8.05(dd,j=8.3,5.6hz,1h),7.91(d,j=7.7hz,1h),7.85(d,j=8.3hz,2h),7.69(s,1h),7.51(dd,j=14.0,6.3hz,1h),7.47–7.34(m,3h),7.21(t,j=5.8hz,2h),7.02(d,j=7.5hz,2h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ166.78,165.00,160.47,157.93,155.50,150.73,149.59,147.40,144.37,137.88,137.62,131.89,129.49,129.22,127.97,126.14,125.98,125.93,125.08,124.50,120.99,120.52,118.21,117.13,110.56;esi-msm/z486.2[m+h]⁺.

3-{5-[2-(苯亞氨基)-3-(5-氟吡啶-2-基)-噻唑-4-酮-5-亞基甲基]噻吩-2-基}苯甲酸(1f)：黃色固體，產(chǎn)率77.4%；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ13.23(s,1h),8.61(s,1h),8.25(s,1h),8.05(s,2h),7.95(d,j=7.4hz,1h),7.82(s,1h),7.75(s,2h),7.61(s,1h),7.54(d,j=6.2hz,2h),7.49(s,2h),7.08(s,1h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ166.86,165.04,158.00,157.43,153.53,152.48,152.00,148.29,137.38,135.85,133.10,132.06,129.95,129.77,129.40,129.01,128.67,127.79,127.68,127.56,126.20,126.08,124.53,122.60,122.39;esi-msm/z502.0[m+h]⁺.

3-{5-[2-(苯亞氨基)-3-(6-氟吡啶-2-基)-噻唑-4-酮-5-亞基甲基]呋喃-2-基}苯甲酸(1g)：淡黃色固體，產(chǎn)率75.3%；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ13.20(s,1h),8.34–8.26(m,1h),8.24(s,1h),7.91(d,j=7.6hz,1h),7.85(d,j=7.6hz,1h),7.77–7.67(m,2h),7.52(t,j=7.6hz,1h),7.47–7.35(m,4h),7.22(d,j=3.6hz,2h),7.01(t,j=12.3hz,2h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ166.77,164.75,160.92,155.57,150.41,149.56,147.28,145.85,145.72,144.72,144.65,131.90,129.50,129.20,127.99,125.16,124.51,122.42,121.00,120.67,118.01,117.31,110.60;esi-msm/z486.2[m+h]⁺.

3-{5-[2-(苯亞氨基)-3-(2-氟吡啶-3-基)-噻唑-4-酮-5-亞基甲基]呋喃-2-基}苯甲酸(1h)：

淡黃色固體，產(chǎn)率75.8%；¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.23(s,1h),8.59(s,1h),8.26(s,2h),7.82(d,j=67.7hz,4h),7.43(s,4h),7.22(s,2h),7.01(s,2h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ166.78,164.33,155.71,150.62,149.75,149.45,148.98,147.09,140.94,131.90,129.86,129.55,129.46,129.18,128.04,125.25,124.52,124.43,120.95,117.75,117.64,110.63;esi-msm/z502.2[m+h]⁺.

3-{5-[2-(苯亞氨基)-3-(2-氟吡啶-3-基)-噻唑-4-酮-5-亞基甲基]噻吩-2-基}苯甲酸(1i)：

淡黃色固體，產(chǎn)率79.7%；¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ13.23(s,1h),8.59(s,1h),8.17(s,2h),7.97(d,j=7.5hz,1h),7.90(d,j=8.0hz,2h),7.80(s,1h),7.75(s,1h),7.56(s,4h),7.41(d,j=7.5hz,2h),6.97(d,j=7.5hz,1h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ165.86,163.42,154.79,149.70,148.83,148.54,148.07,146.17,140.02,130.99,128.95,128.64,128.54,128.26,127.12,124.33,123.61,123.50,120.03,116.83,116.73,109.71;esi-msm/z518.0[m+h]⁺.

實施例4：體外抑菌活性測試

1）化合物的最小抑菌濃度的測定

參照美國臨床和實驗室標準研究所clsi（clinicalandlaboratorystandardsinstitute）推薦的操作規(guī)范，采用肉湯稀釋方法（brothmicro-dilution）進行最小抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration，mic）檢測；以表皮葡萄球菌atcc35984株和表皮葡萄球菌atcc12228株為測試菌株；

（1）用無菌接種環(huán)沾取少許細菌菌種，在tsb平皿（表面分區(qū)劃線，37℃孵育過夜；

（2）從平皿上挑取單個菌落，接種至3～5mlmh液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（約需4h）；

（3）菌液準備：將處于對數(shù)生長中期的菌液用生理鹽水調(diào)節(jié)濁度至0.5麥氏比濁標準（相當于0.5×10⁸cfu/ml），再用mh肉湯1:200稀釋，使細菌的終濃度約為10⁵cfu/ml；

（4）將化合物進行連續(xù)倍比稀釋，藥物濃度范圍根據(jù)clsi推薦采用合適的濃度梯度，每個試管中加入稀釋好藥物溶液的量為2ml，因為在加入等體積的接種菌液時，藥物將被1:2稀釋，所以各管中抗菌藥物的濃度應(yīng)是所需最終濃度的2倍；

（5）菌液接種：用微量移液器分別取2ml稀釋好的菌液依次接種至裝有2ml含從低濃度到高濃度藥物mh培養(yǎng)基的試管中，將每只試管混勻，試管內(nèi)的藥物均被1:2稀釋，菌液的最終濃度約為10⁵cfu/ml；同時設(shè)立不加藥物的生長質(zhì)控管和不加細菌的空白對照管；

（6）培養(yǎng)和結(jié)果判斷：將菌液置于37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)16～20h，肉眼觀察有無細菌的生長；mic為肉眼觀察試管中的細菌生長完全被抑制時的最小藥物濃度。

2）化合物對細菌的最小殺菌濃度（mbc）的測定

在最小抑菌濃度的實驗中，從mic濃度以上的試管（包括mic濃度肉眼觀察細菌生長完全被抑制）中每管取100μl，均勻涂布于mh平板上，每個濃度涂6塊平板，37℃培養(yǎng)24小時，每板單克隆數(shù)≤5個時的最小濃度定為最小殺菌濃度。

3）化合物的細胞毒性和溶血性檢測

化合物對vero細胞的細胞毒性采用cellproliferationkiti(mtt)(roche,indianapolis,usa)檢測，操作流程按照試劑盒提供的方法進行。其中1％dmso經(jīng)檢測對vero細胞的細胞毒性很小，可以忽略不計，最后將結(jié)果轉(zhuǎn)換成細胞毒性的百分數(shù)（以1％dmso處理組的結(jié)果為本底進行計算）；cc50代表對50％vero細胞產(chǎn)生毒性的化合物濃度，通過origin8.0軟件計算獲得，每個樣本設(shè)六復(fù)孔，實驗重復(fù)三次；

化合物對健康人紅細胞的溶血作用按照以下方法檢測，首先將紅細胞用無菌生理鹽水洗滌三次，然后稀釋至5％濃度。然后將含有濃度為200μm化合物的紅細胞懸液加入96孔板，每孔200μl，于37℃靜置1小時，同時以不含化合物處理的紅細胞懸液和1%triton-100處理的紅細胞懸液作為陰性（0%溶血）和陽性（100％溶血）對照，然后將處理過的紅細胞懸液在1000×g離心10分鐘，100μl上清轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板于570nm處讀數(shù)，1%dmso處理對紅細胞無溶血作用，整個實驗重復(fù)三次；

試驗結(jié)果顯示：實施例所示的部分化合物具有與陽性對照藥相同或更好的抗菌活性，且具有一定的殺菌活性，濃度在200μm時對vero細胞未產(chǎn)生毒性，且沒有溶血作用。

表1.化合物生物活性1a-i

^amic代表化合物對表皮葡萄球菌atcc35984和atcc12228的最小抑制濃度；^bmbc代表化合物對表皮葡萄球菌atcc35984最小殺菌濃度；^ccc50代表化合物對vero細胞產(chǎn)生50%細胞毒性的濃度；^dhemolytic代表在200μm濃度下化合物對人類健康的紅細胞溶血作用,“—”：代表化合物在200μm濃度下沒有溶血作用。