一種香菇中l(wèi)-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]
本發(fā)明屬于分析檢測領(lǐng)域，具體涉及一種香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]
香菇(Lentinula edodes)在我國已有近千年的栽培歷史，其產(chǎn)量逐年增加。其味道鮮美，香氣沁人，營養(yǎng)豐富，素有“山珍之王”之稱，是高蛋白、低脂肪的營養(yǎng)保健食品。但香菇子實體中普遍含有內(nèi)源性甲醛，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者一直致力于甲醛抑制劑的探索。其中有研究發(fā)現(xiàn)，外源添加L-半胱氨酸不僅能對香菇進行保鮮，還能降低香菇甲醛含量，有研究表明兩者發(fā)生反應(yīng)，生成L-噻卩坐燒-4-羧酸。L-噻卩坐燒-4-羧酸(L-Thiazolidine-4-carboxylicacid)，又稱L-硫代脯氨酸，國內(nèi)外許多研究已表明此物質(zhì)具有抑制癌細胞擴散、使腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)為正常細胞、抗炎、降血糖的功能，并且該物質(zhì)在一定劑量范圍內(nèi)，對人體不會產(chǎn)生副作用。目前對于L-噻唑烷-4-羧酸的檢測可供參考的方法較少，還沒有建立相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法。本發(fā)明以L-噻唑烷-4-羧酸標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測條件的優(yōu)化，建立快速檢測方法，并以L-半胱氨酸處理過的香菇為實驗材料，以未經(jīng)L-半胱氨酸處理的香菇為對照，實際應(yīng)用該方法進行了檢測和證明:采用固相萃取-親水作用色譜法測定其L-噻唑烷-4-羧酸含量。該方法無需衍生化、前處理簡單快速、重現(xiàn)性好，彌補了當(dāng)前基于高效液相色譜不能直接準(zhǔn)確快速的對香菇中L-噻唑烷-4-羧酸分離測定的空缺，并為研究香菇中甲醛的控制提供了新思路和檢測方法。
[0004]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
本發(fā)明的L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法，包括香菇子實體前處理、固相萃取、親水作用色譜測定，其操作步驟如下:
(1)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取50.0yg L-噻唑烷-4-羧酸標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL的容量瓶中，以流動相(乙腈-0.lwt%磷酸水溶液，85:15，v/v)定容，配成1000 yg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲存液；以此為母液，準(zhǔn)確移取20、50、100、500、1000 yL于10 mL容量瓶中，流動相定容至刻度，得到2、5、10、50、100 yg/mL系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液;測定標(biāo)準(zhǔn)品在2?100 yg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系;所得線性回歸方程為Y=5146.42Χ-1171.96，相關(guān)系數(shù)為0.9998 ；
(2)樣品預(yù)處理:準(zhǔn)確稱取2.0g研磨后的香燕樣品于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇-水(70:30，v/v)搖勻，100 W功率下超聲提取20 min，在10000 r/min轉(zhuǎn)速下，離心10 min;離心后，取10 mL上清液到50 mL離心管，加入10 mL乙腈飽和的正己烷渦旋混勻I min，除去脂類物質(zhì)，取5 mL下層提取液加入到試管中，再加5 11^2的%氨水搖勻作為上樣液；(3)樣品凈化:采用WondaSep MAX固相萃取小柱(陰離子萃取小柱，60 mg/3 mL，購自于島津公司)，先分別用3 mL甲醇和3 mL去離子水將小柱活化，再加入步驟(2)提取的上樣液過柱后，分別用3 mL 5wt%氨水和5 mL甲醇淋洗小柱，小柱空干后，用4 1111^甲醇-1.0 wt%甲酸(90:10，v/v)混合液作為洗脫液，洗脫目標(biāo)物，最后，氮吹儀設(shè)置溫度40°C將洗脫液吹干，加入I mL乙腈-0.1被%磷酸(85:15，￥八)溶液定容，渦旋混勻后過0.22 μπι有機濾膜，供HPLC測定；
(4)液相色譜測定參數(shù):操作系統(tǒng)為島津LC-soIut1n工作站;色譜柱:島津Inertsi IHILIC液相色譜柱(4.6X250 mm,5 μπι)；流動相:有機相為乙腈，無機相為0.lwt%磷酸水，體積比為85:15，等度洗脫;流速:0.8 mL/min;柱溫:30°C;進樣體積:5 yL;檢測波長:193 nm。
[0005]本發(fā)明優(yōu)點在于:
①根據(jù)L-噻唑烷-4-羧酸顯弱酸性的特點，香菇樣品前處理首次采用陰離子固相萃取的方式進行凈化，有效保留了目標(biāo)物的同時降低了基質(zhì)效應(yīng)；
②由于L-噻唑烷-4-羧酸屬于極性小分子物質(zhì)，普通C18反相色譜柱難以進行分離，因此本發(fā)明采用親水作用色譜法對香菇中的L-噻唑烷-4-羧酸進行分離測定；
③本發(fā)明的檢測方法無需衍生化、前處理簡單快速、重現(xiàn)性好，彌補了當(dāng)前基于高效液相色譜不能直接準(zhǔn)確快速的對香菇中L-噻唑烷-4-羧酸分離測定的空缺，并為研究香菇中甲醛的控制提供了新思路和檢測方法;該檢測方法耗時5h;加標(biāo)回收率為96.3%?101.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%?4.8%之間，檢出限為0.24 48/1^，定量限為0.73 yg/mL。
【具體實施方式】
[0006]
為了充分公開本發(fā)明的香菇L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法，以下結(jié)合實施例加以說明。
[0007] 實施例1
一種香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法，包括以下步驟:
1.配制標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取50.0yg L-噻唑烷-4-羧酸標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL的容量瓶中，以流動相(乙腈-0.lwt%磷酸水溶液，85:15，v/v)定容，配成1000 yg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲存液；以此為母液，準(zhǔn)確移取20、50、100、500、1000 yL于10 mL容量瓶中，流動相定容至刻度，得到2、5、10、50、100 yg/mL系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液;測定標(biāo)準(zhǔn)品在2?100 yg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系;所得線性回歸方程為Y=5146.42Χ-1171.96，相關(guān)系數(shù)為0.9998 ；
2.香燕樣品前處理:將香燕樣品分成兩份，其中一份噴灑40mM L-半胱氨酸，另外一份噴灑等量的水做對照，常溫下放置16h，待其自然晾干;晾干后，分別進行研磨，準(zhǔn)確稱取2.0 g的香菇樣品于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇-水(70:30，v/v)搖勻，100 W功率下超聲提取20 min，在10000 r/min轉(zhuǎn)速下，離心10 min;離心后，取10 mL上清液到50 mL離心管，加入10 mL乙腈飽和的正己烷渦旋混勻I min，除去脂類物質(zhì)，取5 mL下層提取液加入到試管中，再加5 mL 2?七%氨水搖勻作為上樣液；
3.固相萃取:采用WondaSepMAX固相萃取小柱(陰離子)，先分別用3 mL甲醇和3 mL去離子水將小柱活化，再加入上述提取的上樣液過柱后，分別用3 mL 5wt%氨水和5 mL甲醇淋洗小柱，小柱空干后，用4 mL甲醇-1.0被％甲酸水溶液(90:10,v/v)混合液作為洗脫液，洗脫目標(biāo)物，最后，氮吹儀設(shè)置溫度40°C將洗脫液吹干，加入I mL乙腈-0.1%磷酸(85:15，v/v)溶液定容，渦旋混勻后過0.22 μπι有機濾膜，供HPLC測定；
4.液相色譜測定:操作系統(tǒng)為采用島津LC-solut1n工作站;色譜柱:島津InertsilHILIC液相色譜柱(4.6X250 mm,5 μπι)；流動相:有機相為乙腈，水相為0.1%磷酸水，體積比為85:15，等度洗脫;流速:0.8 mL/min;柱溫:30°C;進樣體積:5 yL;檢測波長:193 nm。以上參數(shù)選定后，分別對提取的樣品進行分離測定；
5.樣品分離測定后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)L-半胱氨酸處理后的香菇可檢測到L-噻唑烷-4-羧酸，含量為13.95yg/g，對照未檢測到L-噻唑烷-4-羧酸。
[0008]整體耗時為21h。
[0009]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1.一種香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液:配制2yg/mL、5 yg/mL、10 yg/mL、50 yg/mL、100 yg/mL系列質(zhì)量濃度的L-噻唑烷-4-羧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定L-噻唑烷-4-羧酸標(biāo)準(zhǔn)品在2?100 yg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系； (2)香菇樣品的預(yù)處理:準(zhǔn)確稱取2.0g研磨后的香菇樣品于50 mL離心管中，加入20mL甲醇水溶液搖勻，100 W功率下超聲提取20 min;再在10000 r/min轉(zhuǎn)速下，離心10 min；離心后，取10 mL上清液到50 mL離心管，加入10 mL乙腈飽和的正己燒，禍旋混勾I min，除去脂類物質(zhì)，取5 mL下層提取液加入到試管中，再加5 mL 2被%氨水搖勻作為上樣液； (3)固相萃取:采用WondaSepMAX固相萃取小柱，先分別用3 mL甲醇和3 mL去離子水將小柱活化，再加入步驟(2)提取的上樣液過柱后，分別用3 mL 5wt%氨水和5 mL甲醇淋洗小柱，小柱空干后，用4 mL甲醇-1.0 wt%甲酸水溶液的混合液作為洗脫液，洗脫目標(biāo)物，最后，氮吹儀設(shè)置溫度40°C將洗脫液吹干，加入I mL乙腈-0.lwt%磷酸溶液定容，渦旋混勻后過0.22 μπι有機濾膜，供HPLC測定； (4)液相色譜測定:操作系統(tǒng)為島津^:-8011^丨011工作站;色譜柱:島津1116^8丨1HILIC液相色譜柱，其規(guī)格為4.6 X 250 mm,5 Mi;流動相:有機相為乙腈，無機相為0.lwt%磷酸水溶液，體積比為85:15,等度洗脫;流速:0.8 mL/min;柱溫:30°C；進樣體積:5 yL;檢測波長:193 nmD2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法，其特征在于:步驟(1)所述配制標(biāo)準(zhǔn)溶液具體為:稱取50.0yg L-噻唑烷-4-羧酸標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL的容量瓶中，以體積比為85:15的乙腈-0.lwt%磷酸水溶液的混合液定容，配成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲存液；以此為母液，準(zhǔn)確移取20、50、100、500、1000 yL于10 mL容量瓶中，流動相定容至刻度，得到2、5、10、50、100 yg/mL系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法，其特征在于:步驟(2)中所述甲醇水溶液中甲醇和水的體積比為70:30。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法，其特征在于:步驟(3)所述WondaSepMAX固相萃取小柱為陰離子固相萃取小柱，其規(guī)格為60 mg/3 mL;步驟(3)所述甲醇-1.0 wt%甲酸水溶液的混合液中，甲醇、1.0 wt%甲酸水溶液的體積比為90:10。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法，其特征在于:步驟(3)所述乙腈-0.lwt%磷酸溶液中，乙腈、0.lwt%磷酸溶液的體積比為85:15。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法，其特征在于:步驟(I)所得線性關(guān)系為:線性回歸方程為Y=5146.42Χ-1171.96，相關(guān)系數(shù)為0.9998。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析檢測領(lǐng)域，具體涉及一種香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速檢測方法，包括香菇前處理提取、樣品凈化、液相色譜檢測。其主要步驟如下：樣品用甲醇-水（70:30，v/v）進行前處理提??；經(jīng)過WondaSep？MAX固相萃取小柱凈化處理；樣品分析采用Inertsil？HILIC親水作用色譜柱（4.6×250mm，5μm）進行分離測定，流動相采用乙腈-0.1%磷酸水（85:15，v/v）等度洗脫，流速0.8mL/min，檢測波長193nm，柱溫30℃，進樣量5μL。該方法無需衍生化、前處理簡單快速、重現(xiàn)性好。彌補了當(dāng)前基于高效液相色譜不能直接準(zhǔn)確快速的對香菇中L-噻唑烷-4-羧酸分離測定的空缺。
【IPC分類】G01N30/06
【公開號】CN105467045
【申請?zhí)枴緾N201610002664
【發(fā)明人】謝寶貴, 何世行, 江玉姬, 陳炳智, 詹藝舒, 吳培淋, 李少斌, 鄭明俊, 劉新銳, 鄧優(yōu)錦
【申請人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2016年1月6日