本發(fā)明涉及生物催化制備薯蕷皂苷元的方法及其所用菌劑。

背景技術(shù)：

薯蕷皂苷元(diosgenin)，工業(yè)上稱之為薯蕷皂素，是薯蕷屬(dioscoreal.)植物中的重要活性成分，作為合成甾體激素藥物重要的醫(yī)藥中間體，被稱為“藥用黃金”。世界各國生產(chǎn)的60％以上甾體激素以薯蕷皂苷元為原料，市場需求巨大。目前，生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法是基于rothrock等人1957年提出的化學(xué)酸水解法，該工藝存在諸多問題。如何從源頭根治污染是薯蕷皂苷元產(chǎn)業(yè)化持續(xù)發(fā)展亟待解決的問題。利用微生物發(fā)酵制備薯蕷皂苷元或者用生物酶制備薯蕷皂苷元，是無酸化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的一個發(fā)展方向。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是如何高效地制備薯蕷皂苷元。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了p1)至p3)的應(yīng)用：

p1)鐮孢屬真菌和彎孢霉屬真菌在制備薯蕷皂苷元中的應(yīng)用或下述c1或下述c2在制備薯蕷皂苷元中的應(yīng)用；

p2)鐮孢屬真菌和磚格孢屬真菌在制備薯蕷皂苷元中的應(yīng)用或下述c3或下述c4在制備薯蕷皂苷元中的應(yīng)用；

p3)鐮孢屬真菌在制備薯蕷皂苷元中的應(yīng)用。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了m1)至m3)的制備薯蕷皂苷元的方法：

m1)所述方法包括用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌和彎孢霉屬真菌，得到薯蕷皂苷元；

m2)所述方法包括用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌和磚格孢屬真菌，得到薯蕷皂苷元；

m3)所述方法包括用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌，得到薯蕷皂苷元。

上述方法或應(yīng)用中，m1)至m3)中和p1)至p3)中，所述鐮孢屬真菌可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712中的至少一種；所述彎孢霉屬真菌可為新月彎孢霉；所述磚格孢屬真菌可為磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718。

上述方法或應(yīng)用中，m1)、m3)、p1)和p3)中，所述鐮孢屬真菌具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709；m2)和p2)中，所述鐮孢屬真菌可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709；m2)和p2)中，所述鐮孢屬真菌還可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226；m2)和p2)中，所述鐮孢屬真菌還可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712。

上述方法或應(yīng)用中，m1)和p1)中，所述新月彎孢霉可為curvularialunata3.4381。

上述應(yīng)用中，所述制備薯蕷皂苷元包括用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基進行發(fā)酵。

上述方法或應(yīng)用中，所述含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基可為固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。

上述方法或應(yīng)用中，所述盾葉薯蕷可為盾葉薯蕷的根狀莖。

上述方法或應(yīng)用中，m1)和p1)中，所述鐮孢屬真菌和所述彎孢霉屬真菌的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)，如1：2。

上述應(yīng)用中，上述p2)具體可為p21)、p22)或p23)；所述p21)、p22)或p23)均為鐮孢屬真菌和磚格孢屬真菌在制備薯蕷皂苷元中的應(yīng)用。

所述p21)中的所述鐮孢屬真菌可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709；所述p21)中，所述鐮孢屬真菌和所述磚格孢屬真菌的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)，如1：2。

所述p22)中，所述鐮孢屬真菌具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226。所述p22)中，鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226和磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)：(0.5-4)，如1：1：1。

所述p23)中，所述鐮孢屬真菌菌劑具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712。所述p23)中，鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712和磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)：(0.5-4)：(0.5-4)，如1：1：1：1。

上述方法中，上述m1)中，用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌和彎孢霉屬真菌具體可為向含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基中先接入所述鐮孢屬真菌進行培養(yǎng)后再接入所述彎孢霉屬真菌進行培養(yǎng)。如向含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基中先接入所述鐮孢屬真菌在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)15-25天(如22天)后再接入所述彎孢霉屬真菌在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)5-10天(如7天)。

上述m2)具體可為m21)、m22)或m23)。

所述m21)為所述方法包括用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌和磚格孢屬真菌，得到薯蕷皂苷元。所述m21)中，所述鐮孢屬真菌可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709；所述磚格孢屬真菌可為磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718。所述鐮孢屬真菌和所述磚格孢屬真菌的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)，如1：2。其中，用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌和磚格孢屬真菌具體可為向含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基中先接入所述鐮孢屬真菌進行培養(yǎng)后再接入所述磚格孢屬真菌進行培養(yǎng)。如向含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基中先接入所述鐮孢屬真菌在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)15-25天(如22天)后再接入所述磚格孢屬真菌在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)5-10天(如7天)。

所述m22)為所述方法包括用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌和磚格孢屬真菌，得到薯蕷皂苷元。所述m22)中，所述鐮孢屬真菌具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226；所述磚格孢屬真菌可為磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718。所述m22)中，鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226和磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)：(0.5-4)，如1：1：1。其中，用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌和磚格孢屬真菌具體可為向含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基中先接入鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709進行培養(yǎng)后再接入所述磚格孢屬真菌進行培養(yǎng)再接入鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226進行培養(yǎng)。如向含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基中先接入鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)15-25天(如22天)后再接入磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)5-10天(如7天)后再接入鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)5-10天(如7天)。

所述m23)為所述方法包括用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌和磚格孢屬真菌，得到薯蕷皂苷元。所述m23)中，所述鐮孢屬真菌具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712；所述磚格孢屬真菌可為磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718。所述m23)中，鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712和磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)：(0.5-4)：(0.5-4)，如1：1：1：1。其中，用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌和磚格孢屬真菌具體可為向含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基中先接入鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709進行培養(yǎng)后再接入磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718進行培養(yǎng)再接入鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226進行培養(yǎng)再接入鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712進行培養(yǎng)。如向含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基中先接入鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)15-25天(如22天)后再接入磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)5-10天(如7天)后再接入鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)5-10天(如7天)后再接入鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)7-15天(如10天)。

上述m3)中，用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌具體可為向含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基中接入所述鐮孢屬真菌在20-30℃(如28℃)培養(yǎng)15-25天(如22天)。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了用于制備薯蕷皂苷元的菌劑。

本發(fā)明所提供的用于制備薯蕷皂苷元的菌劑為c1至c4中任一種：

所述c1為由鐮孢屬真菌菌劑和彎孢霉屬真菌菌劑構(gòu)成的用于制備薯蕷皂苷元的成套菌劑，所述鐮孢屬真菌菌劑的活性成分含有所述鐮孢屬真菌，所述彎孢霉屬真菌菌劑的活性成分含有所述彎孢霉屬真菌；

所述c2為活性成分含有所述鐮孢屬真菌和所述彎孢霉屬真菌的用于制備薯蕷皂苷元的菌劑；

所述c3為由鐮孢屬真菌菌劑和磚格孢屬真菌菌劑構(gòu)成的用于制備薯蕷皂苷元的成套菌劑，所述鐮孢屬真菌菌劑的活性成分含有所述鐮孢屬真菌，所述磚格孢屬真菌菌劑的活性成分含有所述磚格孢屬真菌；

所述c4為活性成分含有所述鐮孢屬真菌和所述磚格孢屬真菌的用于制備薯蕷皂苷元的菌劑。

上述用于制備薯蕷皂苷元的成套菌劑中，所述c1中，所述鐮孢屬真菌菌劑的活性成分可為所述鐮孢屬真菌，所述鐮孢屬真菌菌劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，該菌劑的其它活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率確定。所述c1中，所述鐮孢屬真菌具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709。所述c1中，所述彎孢霉屬真菌可為新月彎孢霉；所述新月彎孢霉具體可為curvularialunata3.4381。所述c1中，所述彎孢霉屬真菌菌劑的活性成分可為所述彎孢霉屬真菌，所述彎孢霉屬真菌菌劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，該菌劑的其它活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率確定。所述c1中所述鐮孢屬真菌菌劑和彎孢霉屬真菌菌劑均單獨包裝。所述c1中，所述鐮孢屬真菌和所述彎孢霉屬真菌的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)，如1：2。

上述用于制備薯蕷皂苷元的成套菌劑中，所述c2具體可為活性成分為所述鐮孢屬真菌和所述彎孢霉屬真菌的用于制備薯蕷皂苷元的菌劑；所述c2的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，所述c2的其它活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率確定。所述c2中，所述鐮孢屬真菌具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709。所述c2中，所述彎孢霉屬真菌可為新月彎孢霉；所述新月彎孢霉具體可為curvularialunata3.4381。所述c2中，所述鐮孢屬真菌和所述彎孢霉屬真菌的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)，如1：2。

上述用于制備薯蕷皂苷元的成套菌劑中，所述c3具體可為c31、c32或c33。所述c31、c32和c33均為由鐮孢屬真菌菌劑和磚格孢屬真菌菌劑構(gòu)成的用于制備薯蕷皂苷元的成套菌劑，所述鐮孢屬真菌菌劑的活性成分含有所述鐮孢屬真菌，所述磚格孢屬真菌菌劑的活性成分含有所述磚格孢屬真菌。所述c31、c32和c33中，所述磚格孢屬真菌可為磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718。所述c31、c32和c33中，所述磚格孢屬真菌菌劑的活性成分可為所述磚格孢屬真菌，所述磚格孢屬真菌菌劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，該菌劑的其它活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率確定。

所述c31中，所述鐮孢屬真菌具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709。所述鐮孢屬真菌菌劑的活性成分可為所述鐮孢屬真菌，所述鐮孢屬真菌菌劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，該菌劑的其它活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率確定。所述c31中，各菌劑均獨立包裝。所述c31中，所述鐮孢屬真菌和所述磚格孢屬真菌的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)，如1：2。

所述c32中，所述鐮孢屬真菌菌劑具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709菌劑和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226菌劑。所述鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709菌劑的活性成分可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，還可含有其他生物成分或非生物成分，該菌劑的其它活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率確定。所述鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226菌劑的活性成分可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226，還可含有其他生物成分或非生物成分，該菌劑的其它活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率確定。所述c32中，各菌劑均獨立包裝。所述c32中，鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226和磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)：(0.5-4)，如1：1：1。

所述c33中，所述鐮孢屬真菌菌劑具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709菌劑、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226菌劑和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712菌劑。所述鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709菌劑的活性成分可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，還可含有其他生物成分或非生物成分，該菌劑的其它活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率確定。所述鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226菌劑的活性成分可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226，還可含有其他生物成分或非生物成分，該菌劑的其它活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率確定。所述鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712菌劑的活性成分可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712，還可含有其他生物成分或非生物成分，該菌劑的其它活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率確定。所述c33中，各菌劑均獨立包裝。所述c33中，鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712和磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)：(0.5-4)：(0.5-4)，如1：1：1：1。

上述用于制備薯蕷皂苷元的成套菌劑中，所述c4具體可為c41、c42或c43。所述c41、c42和c43均為活性成分含有所述鐮孢屬真菌和所述磚格孢屬真菌的用于制備薯蕷皂苷元的菌劑。所述c41、c42和c43的活性成分可為所述鐮孢屬真菌和所述磚格孢屬真菌，還可含有其他生物成分或非生物成分，該菌劑的其它活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)薯蕷皂苷元的產(chǎn)率確定。所述c41、c42和c43中，所述磚格孢屬真菌可為磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718。

所述c41中，所述鐮孢屬真菌具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709。所述c41中，所述鐮孢屬真菌和所述磚格孢屬真菌的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)，如1：2。

所述c42中，所述鐮孢屬真菌具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226。所述c42中，鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226和磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)：(0.5-4)，如1：1：1。

所述c43中，所述鐮孢屬真菌具體可為鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712。所述c43中，鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712和磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比可為1：(0.5-4)：(0.5-4)：(0.5-4)，如1：1：1：1。

上述菌劑除活性成分外，還可包括輔料，如水、碳源和/或氮源等。碳源是微生物生長一類營養(yǎng)物，是含碳化合物，包括糖類、油脂、有機酸及有機酸酯和小分子醇等速效、遲效碳源。氮源是指提供微生物營養(yǎng)所需氮元素的物質(zhì)，包括花生餅粉、黃豆餅粉、酵母粉、蛋白胨、氨水、銨鹽和硝酸鹽等速效、遲效氮源。

所述菌劑中，各種真菌可以被培養(yǎng)的活細胞、活細胞的發(fā)酵液的形式存在。所述菌劑的劑型可為多種劑型，如液劑、粉劑或顆粒劑等。

實驗證明，新月彎孢霉和鐮孢屬真菌聯(lián)合發(fā)酵含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基的薯蕷皂苷元的得率比新月彎孢霉單獨發(fā)酵含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基與鐮孢屬真菌單獨發(fā)酵含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基二者的薯蕷皂苷元的得率之和還要高，新月彎孢霉和鐮孢屬真菌在發(fā)酵含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基產(chǎn)薯蕷皂苷元方面產(chǎn)生了協(xié)同作用(表1)。在薯蕷皂苷元的得率上，cpcc400709+cpcc400718成套菌劑處理比鐮孢屬真菌菌劑處理提高了9％，cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226成套菌劑處理比鐮孢屬真菌菌劑處理提高了16％，cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226+cpcc400712成套菌劑處理比鐮孢屬真菌菌劑處理提高了14％。

附圖說明

圖1為hplc鑒定薯蕷皂苷元的圖譜。

圖中，(a)為薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，(b)為3.3的新月彎孢霉菌劑發(fā)酵產(chǎn)物的hplc圖譜，(c)為3.4的鐮孢屬真菌菌劑發(fā)酵產(chǎn)物的hplc圖譜，(d)為3.1的鐮+新發(fā)酵產(chǎn)物的hplc圖譜，(e)為3.2的新+鐮發(fā)酵產(chǎn)物，其中，薯蕷皂苷元的色譜峰如箭頭所示。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的新月彎孢霉curvularialunata3.4381(bingfeng,etal.themicrobiologicaltransformationofsteroidalsaponinsbycurvularialunata.tetrahedron61(2005)11758–11763.25october2005)公眾可從申請人獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709已于2015年7月6日收藏于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所的中國藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心(chinapharmaceuticalculturecollection，簡稱cpcc，地址：北京天壇西里1號，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，郵政編碼：100050)，自該收藏日起公眾可從cpcc獲得該菌株。

下述實施例中的鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712已于2015年7月6日收藏于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所的中國藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心(chinapharmaceuticalculturecollection，簡稱cpcc，地址：北京天壇西里1號，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，郵政編碼：100050)，自該收藏日起公眾可從cpcc獲得該菌株。

磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718已于2015年7月6日收藏于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所的中國藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心(chinapharmaceuticalculturecollection，簡稱cpcc，地址：北京天壇西里1號，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，郵政編碼：100050)，自該收藏日起公眾可從cpcc獲得該菌株。

下述實施例中的黃曲霉aspergillusflavus3.2792(a.flavus3.2792)(hongzhihuang,etal.pathwaysofbiotransformationofzingiberennewsaponinfromdioscoreazingiberensisc.h.wrighttodiosgenin.journalofmolecularcatalysisb：enzymatic98(2013)1-7)公眾可從申請人獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226已于2007年2月1日收藏于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所的中國藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心(chinapharmaceuticalculturecollection，簡稱cpcc，地址：北京天壇西里1號，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，郵政編碼：100050)，自該收藏日起公眾可從cpcc獲得該菌株。

下述實施例中的黑曲霉(aspergillusniger)cpcc400524已于2015年7月6日收藏于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所的中國藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心(chinapharmaceuticalculturecollection，簡稱cpcc，地址：北京天壇西里1號，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，郵政編碼：100050)，自該收藏日起公眾可從cpcc獲得該菌株。

實施例1、用含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基培養(yǎng)鐮孢屬真菌和彎孢霉或鐮孢屬真菌制備薯蕷皂苷元

1、本實施例所用的培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮，200g切成小塊，加水煮沸30min，4層紗布過濾，加20g葡萄糖，瓊脂17g，蒸餾水定容到1000ml，煮沸混勻，121℃條件下滅菌20分鐘，得到pda培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2g，蔗糖1g，黃豆粉0.2g，蛋白胨1g，磷酸氫二鉀0.03g，聚乙二醇0.25g，硝酸鈉0.3g，硫酸銨0.3g，用水定容至100ml，ph6.0。121℃滅菌20分鐘，得到種子培養(yǎng)基。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基)：將1g葡萄糖，1g酵母提取物，20g稻殼，10g麩皮，1gk2hpo4，0.5gmgso4·7h2o，5g干盾葉薯蕷根狀莖粉，加入21ml去離子水浸泡，調(diào)ph6.0。121℃滅菌20分鐘，得到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。

2、產(chǎn)薯蕷皂苷元的菌劑的制備

2.1、新月彎孢霉菌劑的制備

將新月彎孢霉curvularialunata3.4381在pda培養(yǎng)基斜面28℃培養(yǎng)5天，然后挑取菌絲塊接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃震蕩培養(yǎng)2天得到新月彎孢霉curvularialunata3.4381發(fā)酵液。該新月彎孢霉curvularialunata3.4381發(fā)酵液即為新月彎孢霉菌劑。

2.2、鐮孢屬真菌菌劑的制備

將鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709在pda培養(yǎng)基斜面28℃培養(yǎng)5天，然后挑取菌絲塊接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃震蕩培養(yǎng)2天得到鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709發(fā)酵液。該鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709發(fā)酵液即為鐮孢屬真菌菌劑。

2.3產(chǎn)薯蕷皂苷元的成套菌劑的制備

將2.1的新月彎孢霉菌劑和2.2的鐮孢屬真菌菌劑分別單獨包裝后，按照新月彎孢霉curvularialunata3.4381和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比為2：1的比例裝在一個大包裝中,得到產(chǎn)薯蕷皂苷元的成套菌劑，將其命名為新月彎孢霉+鐮孢屬真菌成套菌劑。

2.4黃曲霉菌劑的制備

將黃曲霉aspergillusflavus3.2792在pda培養(yǎng)基斜面28℃培養(yǎng)5天，然后挑取菌絲塊接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃震蕩培養(yǎng)2天得到黃曲霉aspergillusflavus3.2792發(fā)酵液。該黃曲霉aspergillusflavus3.2792發(fā)酵液即為黃曲霉菌劑。

2.5黃曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑的制備

將2.4的黃曲霉菌劑和2.2的鐮孢屬真菌菌劑分別單獨包裝后，按照黃曲霉aspergillusflavus3.2792和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比為2：1的比例裝在一個大包裝中,得到黃曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑。

2.6黑曲霉菌劑的制備

將黑曲霉(aspergillusniger)cpcc400524在pda培養(yǎng)基斜面28℃培養(yǎng)5天，然后挑取菌絲塊接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃震蕩培養(yǎng)2天得到黑曲霉(aspergillusniger)cpcc400524發(fā)酵液。該黑曲霉(aspergillusniger)cpcc400524發(fā)酵液即為黑曲霉菌劑。

2.7黑曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑的制備

將2.6的黑曲霉菌劑和2.2的鐮孢屬真菌菌劑分別單獨包裝后，按照黑曲霉(aspergillusniger)cpcc400524和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比為2：1的比例裝在一個大包裝中,得到黑曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑。

2.8cpcc400709+cpcc400718成套菌劑的制備

將磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718在pda培養(yǎng)基斜面28℃培養(yǎng)5天，然后挑取菌絲塊接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃震蕩培養(yǎng)2天得到磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718發(fā)酵液。該磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718發(fā)酵液即為cpcc400718菌劑。

將cpcc400718菌劑和2.2的鐮孢屬真菌菌劑分別單獨包裝后，按照磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比為2：1的比例裝在一個大包裝中,得到cpcc400709+cpcc400718成套菌劑。

2.9cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226成套菌劑的制備

將鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226在pda培養(yǎng)基斜面28℃培養(yǎng)5天，然后挑取菌絲塊接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃震蕩培養(yǎng)2天得到鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226發(fā)酵液。該鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226發(fā)酵液即為cpcc400226菌劑。

將該cpcc400226菌劑、2.8的cpcc400718菌劑和2.2的鐮孢屬真菌菌劑分別單獨包裝后，按照鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226、磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比為1：1：1的比例裝在一個大包裝中,得到cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226成套菌劑。

2.10cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226+cpcc400712成套菌劑的制備

將鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712在pda培養(yǎng)基斜面28℃培養(yǎng)5天，然后挑取菌絲塊接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃震蕩培養(yǎng)2天得到鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712發(fā)酵液。該鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712發(fā)酵液即為cpcc400712菌劑。

將該cpcc400712菌劑、2.9的cpcc400226菌劑、2.8的cpcc400718菌劑和2.2的鐮孢屬真菌菌劑分別單獨包裝后，按照鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712、鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226、磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比為1：1：1：1的比例裝在一個大包裝中,得到cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226+cpcc400712成套菌劑。

3、制備薯蕷皂苷元

本發(fā)明的發(fā)明人在實驗過程中發(fā)現(xiàn)同時接種兩種真菌會出現(xiàn)兩種真菌均無法正常生長的現(xiàn)象。因此，本實驗采取的是聯(lián)合順序發(fā)酵，即先接種一種真菌進行發(fā)酵，發(fā)酵一定時間后再接入第二種真菌進行發(fā)酵。這種方法在操作上比聯(lián)合同步發(fā)酵復(fù)雜，但可使每種菌均得到良好的增殖，從而提高薯蕷皂苷元的得率。本發(fā)明的發(fā)明人在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，一種真菌單獨發(fā)酵22天薯蕷皂苷元的得率最高，所以下述處理中，一種真菌單獨發(fā)酵的時間均設(shè)為22天。

實驗設(shè)13個處理，具體如下：

3.1新月彎孢霉+鐮孢屬真菌成套菌劑鐮+新處理

用2.3的產(chǎn)薯蕷皂苷元的成套菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.2的鐮孢屬真菌菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，混勻，28℃培養(yǎng)22天，在第23天再接入2.1的新月彎孢霉菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了2×10⁷cfu新月彎孢霉curvularialunata3.4381，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到鐮+新發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.2新月彎孢霉+鐮孢屬真菌成套菌劑新+鐮處理

用2.3的產(chǎn)薯蕷皂苷元的成套菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.1的新月彎孢霉菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了2×10⁷cfu新月彎孢霉curvularialunata3.4381，混勻，28℃培養(yǎng)22天，在第23天再接入2.2的鐮孢屬真菌菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到新+鐮發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.3新月彎孢霉菌劑處理

用2.1的新月彎孢霉菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.1的新月彎孢霉菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了3×10⁷cfu新月彎孢霉curvularialunata3.4381，混勻，28℃培養(yǎng)22天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到新月彎孢霉菌劑發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.4鐮孢屬真菌菌劑處理

用鐮孢屬真菌菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.2的鐮孢屬真菌菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了3×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，混勻，28℃培養(yǎng)22天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到鐮孢屬真菌菌劑發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.5黃曲霉菌劑處理

用2.4的黃曲霉菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.4的黃曲霉菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了3×10⁷cfu黃曲霉aspergillusflavus3.2792，混勻，28℃培養(yǎng)22天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到黃曲霉菌劑發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.6黃曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑黃+鐮處理

用2.5的黃曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.4的黃曲霉菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了2×10⁷cfu黃曲霉aspergillusflavus3.2792，混勻，28℃培養(yǎng)22天，在第23天再接入2.2的鐮孢屬真菌菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到黃+鐮發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.7黃曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑鐮+黃處理

用2.5的黃曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.2的鐮孢屬真菌菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，混勻，28℃培養(yǎng)22天，在第23天再接入2.4的黃曲霉菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了2×10⁷cfu黃曲霉aspergillusflavus3.2792，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到鐮+黃發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.8黑曲霉菌劑處理

用2.6的黑曲霉菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.6的黑曲霉菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了3×10⁷cfu黑曲霉(aspergillusniger)cpcc400524，混勻，28℃培養(yǎng)22天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到黑曲霉菌劑發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.9黑曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑黑+鐮處理

用2.7的黑曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.6的黑曲霉菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了2×10⁷cfu黑曲霉(aspergillusniger)cpcc400524，混勻，28℃培養(yǎng)22天，在第23天再接入2.2的鐮孢屬真菌菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到黑+鐮發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.10黑曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑鐮+黑處理

用2.7的黑曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.2的鐮孢屬真菌菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，混勻，28℃培養(yǎng)22天，在第23天再接入2.6的黑曲霉菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了2×10⁷cfu黑曲霉(aspergillusniger)cpcc400524，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到鐮+黑發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.11cpcc400709+cpcc400718成套菌劑處理

用2.8的cpcc400709+cpcc400718成套菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.2的鐮孢屬真菌菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，混勻，28℃培養(yǎng)22天，在第23天再接入2.8的cpcc400718菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了2×10⁷cfu磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到cpcc400709+cpcc400718成套菌劑發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.12cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226成套菌劑處理

用2.9的cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226成套菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.2的鐮孢屬真菌菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，混勻，28℃培養(yǎng)22天，在第23天再接入2.8的cpcc400718菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)7天，在第30天再接入2.9的cpcc400226菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226成套菌劑發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

3.13cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226+cpcc400712成套菌劑處理

用2.10的cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226+cpcc400712成套菌劑制備薯蕷皂苷元，具體方法如下：

將2.2的鐮孢屬真菌菌劑接入裝有50g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709，混勻，28℃培養(yǎng)22天，在第23天再接入2.8的cpcc400718菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu磚格孢屬菌種(dictyosporiumsp.)cpcc400718，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)7天，在第30天再接入2.9的cpcc400226菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400226，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)7天，在第37天再接入2.10的cpcc400712菌劑，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接入了1×10⁷cfu鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400712，混勻，繼續(xù)28℃培養(yǎng)10天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226+cpcc400712成套菌劑發(fā)酵產(chǎn)物。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)設(shè)10個錐形瓶。

4、薯蕷皂苷元的得率

將3.1的鐮+新發(fā)酵產(chǎn)物、3.2的新+鐮發(fā)酵產(chǎn)物、3.3的新月彎孢霉菌劑發(fā)酵產(chǎn)物、3.4的鐮孢屬真菌菌劑發(fā)酵產(chǎn)物、3.5的黃曲霉菌劑發(fā)酵產(chǎn)物、3.6的黃+鐮發(fā)酵產(chǎn)物、3.7的鐮+黃發(fā)酵產(chǎn)物、3.8的黑曲霉菌劑發(fā)酵產(chǎn)物、3.9的黑+鐮發(fā)酵產(chǎn)物、3.10的鐮+黑發(fā)酵產(chǎn)物、3.11的cpcc400709+cpcc400718成套菌劑發(fā)酵產(chǎn)物、3.12的cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226成套菌劑發(fā)酵產(chǎn)物和3.13的cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226+cpcc400712成套菌劑發(fā)酵產(chǎn)物分別烘干后研磨成粗粉狀，10倍體積的乙酸乙酯回流提取1h，再重復(fù)提取2次，將得到的提取液合并蒸干，甲醇溶解后過0.22μm濾膜，進行hplc分析，計算薯蕷皂苷元的得率：薯蕷皂苷元質(zhì)量(mg)/盾葉薯蕷藥材質(zhì)量(mg)×100％。取薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容，進行hplc制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。hplc色譜條件如下：agilent1100，配有elsd檢測器和chemstation色譜工作站；xdb-c18色譜柱(250×4.6mm，5μm)；用90％乙腈-水溶液(由乙腈和水按照9：1的體積比混合得到的液體)進行洗脫，流速1ml/min；柱溫30℃；進樣量10μl。

結(jié)果表明，所有的13個處理中均有薯蕷皂苷元的產(chǎn)生(圖1和表1)：

1、新月彎孢霉+鐮孢屬真菌成套菌劑鐮+新處理比新月彎孢霉菌劑處理和鐮孢屬真菌菌劑處理的薯蕷皂苷元的得率之和還要高，說明在新月彎孢霉+鐮孢屬真菌成套菌劑鐮+新處理中，新月彎孢霉curvularialunata3.4381和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709在發(fā)酵含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基產(chǎn)薯蕷皂苷元方面產(chǎn)生了協(xié)同作用；而新月彎孢霉+鐮孢屬真菌成套菌劑新+鐮處理比鐮孢屬真菌菌劑處理的薯蕷皂苷元的得率還要低，說明在新月彎孢霉+鐮孢屬真菌成套菌劑新+鐮處理中，新月彎孢霉curvularialunata3.4381和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709在發(fā)酵含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基產(chǎn)薯蕷皂苷元方面并未產(chǎn)生協(xié)同作用。

2、在薯蕷皂苷元的得率上，無論是黃曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑黃+鐮處理還是黃曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑鐮+黃處理均比鐮孢屬真菌菌劑處理和黃曲霉菌劑處理都低，說明黃曲霉aspergillusflavus3.279和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709在發(fā)酵含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基產(chǎn)薯蕷皂苷元方面產(chǎn)生了拮抗作用。

3、在薯蕷皂苷元的得率上，無論是黑曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑黑+鐮處理還是黑曲霉+鐮孢屬真菌成套菌劑鐮+黑處理均比鐮孢屬真菌菌劑處理低，說明黑曲霉(aspergillusniger)cpcc400524和鐮孢屬菌種(fusariumsp.)cpcc400709在發(fā)酵含有盾葉薯蕷的培養(yǎng)基產(chǎn)薯蕷皂苷元方面產(chǎn)生了拮抗作用。

4、在薯蕷皂苷元的得率上，cpcc400709+cpcc400718成套菌劑處理比鐮孢屬真菌菌劑處理提高了9％，cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226成套菌劑處理比鐮孢屬真菌菌劑處理提高了16％，cpcc400709+cpcc400718+cpcc400226+cpcc400712成套菌劑處理比鐮孢屬真菌菌劑處理提高了14％。

表1、各處理薯蕷皂苷元的產(chǎn)量和得率

注：每克盾葉薯蕷根狀莖粉的蕷皂苷元的產(chǎn)量(mg)是以干重計。