本發(fā)明屬于固定化酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用磁性固定化堿性蛋白酶提取蝦殼蛋白的方法。

背景技術(shù)：

酶是一類具有催化功能的蛋白質(zhì)，作為一種高效和高度專一的生物催化劑，酶在常溫、常壓的溫和條件下就能催化某一類或某一生化反應(yīng)，反應(yīng)后數(shù)量和性質(zhì)不發(fā)生變化。但是酶的穩(wěn)定性差，對高溫、有機(jī)溶劑或極端ph敏感，使得酶的應(yīng)用、回收具有一定的困難，限制了酶的利用。

固定化酶是指利用化學(xué)或物理手段將游離的酶定位于限定的空間區(qū)域并使其保持活性和可反復(fù)使用的酶。酶被固定化后在保持其高效專一及溫和的酶催化作用，其性質(zhì)更穩(wěn)定，且易于和產(chǎn)物分離，還可以反復(fù)使用。固定化酶技術(shù)在工業(yè)、醫(yī)藥、化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。目前，固定化酶的制備方法有：吸附法、包埋法、共價鍵結(jié)合法和交聯(lián)法。

利用磁性高分子微球作為酶的固定化載體，不僅方便固定化酶從反應(yīng)體系中分離和回收，還可以利用外部磁場控制磁性材料固定化酶的運(yùn)動和方向，從而代替?zhèn)鹘y(tǒng)的機(jī)械攪拌方式，提高固定化酶的催化效率。使用磁力微球作為載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)可以保持活性和穩(wěn)定性；(2)方便回收，提高酶的使用效率；(3)適合大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)；(4)提高固定化酶的催化效率。

蝦殼中的蛋白質(zhì)含量約為7％-13％，是一種優(yōu)質(zhì)的動物性蛋白質(zhì)。蝦殼蛋白質(zhì)不僅可以用于食品、飲料，完全水解后制成氨基酸營養(yǎng)液，調(diào)料添加劑及飼養(yǎng)添加劑，也可將其用于制作蝦黃醬、蝦味素等調(diào)料或水解制取復(fù)合氨基酸。因此，充分利用蝦殼中的蛋白具有良好的應(yīng)用和開發(fā)前景。

目前，蝦殼中蛋白質(zhì)的提取主要是利用酸除去蝦殼中的鈣，然后用堿將蝦殼中的蛋白質(zhì)提取出來，調(diào)節(jié)提取液ph，使蛋白質(zhì)沉淀析出，或用鹽析法將蛋白質(zhì)回收。另一種方法是使用蛋白酶將蝦殼中的蛋白質(zhì)水解出來，所得水解液可以進(jìn)一步調(diào)配制成蝦油，或者經(jīng)噴霧干燥制成蛋白粉。用堿法提取蛋白的過程中會帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染，而單純用酶法來水解蛋白質(zhì)由于酶的不能回收利用，也存在著嚴(yán)重的浪費(fèi)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種利用磁性固定化堿性蛋白酶提取蝦殼蛋白的方法，該方法簡單易操作，穩(wěn)定性好，水解蛋白效果好，提取所需成本低。

實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采取的技術(shù)方案為：

一種利用磁性固定化堿性蛋白酶提取蝦殼蛋白的方法，包括如下步驟：

1、制備磁性固定化堿性蛋白酶：

1.1、將磁性殼聚糖微球加入ph＝9-12的硼砂緩沖液中，再加入堿性蛋白酶，磁性殼聚糖微球、堿性蛋白酶和硼砂緩沖液的比例為1mg:100-400u:0.1-1ml，在0-10℃下反應(yīng)2-5h，得到混合產(chǎn)物；

1.2、向混合產(chǎn)物中加入戊二醛，使戊二醛的終濃度為0.005-0.01g/ml，在0-10℃下反應(yīng)2-5h，過濾，將濾渣用硼砂緩沖液洗滌，干燥，得到磁性固定化堿性蛋白酶；

2、提取蝦殼中的蛋白：

2.1、將蝦殼粉加入到濃度為50-90g/l乙酸溶液中，蝦殼粉與乙酸溶液的質(zhì)量體積比為1g:6-14ml，在55-75℃下反應(yīng)1-5h，得混合液；

2.2、將混合液過濾，向濾渣中加入堿性溶液至體系呈中性，過濾，再用蒸餾水洗滌濾渣，干燥，得改性蝦殼粉；

2.3、測定改性蝦殼粉中蝦殼蛋白的含量；

2.4、將改性蝦殼粉加入到ph為9-12的硼砂緩沖液中，接著加入磁性固定化堿性蛋白酶(磁性固定化堿性蛋白酶的活性可以通過folin-酚法進(jìn)行測定)，磁性固定化堿性蛋白酶與蝦殼蛋白的比例為10-20u:1mg，在溫度為45-60℃下攪拌酶解1-5小時，酶解結(jié)束后，用吸鐵石分離出磁性固定化堿性蛋白酶，將分離出的磁性固定化堿性蛋白酶洗滌后保存?zhèn)溆?，再將所得的酶解液過濾，將濾液進(jìn)行冷凍干燥，得到蝦殼蛋白多肽，即為蝦殼蛋白粉。

進(jìn)一步，所述的堿性蛋白酶比活力為20000-32000u/ml。

進(jìn)一步，所述的堿性溶液為氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明的方法提取步驟簡單，所需成本較低，蝦殼蛋白粉產(chǎn)量高，且酶解過程可連續(xù)進(jìn)行，不需要進(jìn)行滅酶，可實現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)。

2、采用本發(fā)明的方法提取蝦殼中的蛋白，提取率高達(dá)57％以上。

3、本發(fā)明采用磁性固定化堿性蛋白酶，所得的固定化堿性蛋白酶不僅酶活高，且性質(zhì)穩(wěn)定，方便儲存。

4、本發(fā)明制備的固定化堿性蛋白酶具有較強(qiáng)的磁場響應(yīng)性，因此可以使用外部磁場快速方便地聚集、分離、回收固定化堿性蛋白酶，從而使堿性蛋白酶反復(fù)使用，進(jìn)而提高堿性蛋白酶的使用率。

附圖說明

圖1為磁性殼聚糖微球的透射電鏡掃描圖。

圖2為磁性殼聚糖微球(下)和固定化堿性蛋白酶(上)的紅外光譜圖。

圖3為蝦殼蛋白的提取率與溫度的關(guān)系曲線。

圖4為蝦殼蛋白的提取率與提取ph的關(guān)系曲線。

圖5為蝦殼蛋白的提取率與酶底比的關(guān)系曲線。

圖6為磁性固定化堿性蛋白酶的酶活保留比例與使用次數(shù)的關(guān)系曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

以下實施例中所使用的磁性殼聚糖微球為發(fā)明人自制(李丹丹，江連洲，李楊.磁性殼聚糖微球固定化堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì))，其制備方法如下：

a、取3-9g殼聚糖溶解于1.5％(v/v)的乙酸溶液中，于600r/min下攪拌30min，得到殼聚糖乙酸溶液；

b、取fe3o4分散液a(將粒徑為10-50nm的fe3o4納米顆粒分散于水溶液中)4-6ml于20ml殼聚糖乙酸溶液中，超聲分散2小時，得到fe3o4分散液b；

c、取40-50ml液體石蠟、2-4ml吐溫于燒杯中，于600r/min下進(jìn)行攪拌，得到混合液a；

d、將fe3o4分散液b逐漸滴加入混合液a中，于40℃、600r/min下攪拌1h，得混合液b；

e、將混合液b加入5wt％的戊二醛中，并繼續(xù)于40℃、600r/min下攪拌反應(yīng)20min，得混合產(chǎn)物a；

f、向混合產(chǎn)物a中加入0.1mol/lnaoh溶液，調(diào)節(jié)ph值至10，在600r/min下進(jìn)行攪拌反應(yīng)2h，得混合產(chǎn)物b；

g、用外加磁場從混合產(chǎn)物b中分離出顆粒狀物，將顆粒狀物用乙醚、丙酮、乙醇和超純水依次洗滌，重復(fù)洗滌幾次，最后將顆粒狀物冷凍干燥，得到磁性殼聚糖微球。

以下實施例中所使用的堿性蛋白酶均為sigma公司生產(chǎn)的堿性蛋白酶。

實施例1

1、制備磁性固定化堿性蛋白酶：

1.1、將0.1g磁性殼聚糖微球加入25mlph＝10的硼砂緩沖液中，再加入1ml32000u/ml的堿性蛋白酶，在4℃下反應(yīng)3h，得到混合產(chǎn)物；

1.2、向混合產(chǎn)物中加入500μl戊二醛(純度為50％)，在4℃下反應(yīng)3h，過濾，將濾渣反復(fù)用硼砂緩沖液洗滌，冷凍干燥，得到磁性固定化堿性蛋白酶；

2、制備蝦殼粉：

去除全部肉質(zhì)取蝦殼，將蝦殼用蒸餾水反復(fù)清洗，直至沒有懸浮的雜質(zhì)物質(zhì)，然后置于鼓風(fēng)干燥箱中，在100℃下烘干24小時，再將干燥好的蝦殼用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過100目篩，貯存?zhèn)溆茫?/p>

3、提取蝦殼中的蛋白：

3.1、將0.5g蝦殼粉加入到5ml50g/l乙酸溶液中，在65℃下反應(yīng)3h，得混合液；

3.2、將混合液過濾，向濾渣中加入0.5mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值為7，過濾，再用蒸餾水洗滌濾渣，干燥，得改性蝦殼粉；

3.3、測定改性蝦殼粉中蝦殼蛋白的含量，測得蝦殼蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53.98％；

3.4、將0.2g改性蝦殼粉加入到10mlph為10的硼砂緩沖液中，接著按照15u/mg的酶底比加入磁性固定化堿性蛋白酶(事先將磁性固定化堿性蛋白酶在ph為10的硼砂緩沖液中溶脹過夜)，在酶解溫度為55℃、轉(zhuǎn)速為100r/min下攪拌酶解3小時，酶解結(jié)束后，用吸鐵石分離出磁性固定化堿性蛋白酶，將分離出的磁性固定化堿性蛋白酶用緩沖液洗滌后保存于4℃、ph為10的硼砂緩沖液中，再將所得的酶解液過濾，將濾液進(jìn)行冷凍干燥，得到蝦殼蛋白多肽，即為蝦殼蛋白粉，蝦殼蛋白提取率為57.36％。

本實施例制備的磁性固定化堿性蛋白酶的透射電鏡掃描圖如圖2所示，而磁性殼聚糖微球的透射電鏡掃描圖如圖1所示，磁性殼聚糖微球表面有大量凹凸不平的孔徑，這樣可以有效的增加微球的比表面積，有利于堿性蛋白酶的交聯(lián)，表明該微球是酶的良好的載體，

本實施例制備的磁性固定化堿性蛋白酶和磁性殼聚糖微球的紅外光譜圖如圖3所示，由圖2可知，在磁性固定化堿性蛋白酶和磁性殼聚糖微球的紅外光譜圖中，545cm-1處的特征吸收峰是fe3o4的特征峰；1545cm^-1處是cn伸縮振動的特征吸收峰，表明交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生；636cm^-1處是戊二醛的特征吸收峰；3409cm^-1處是-nh2和-oh伸縮振動的特征吸收峰。由此表明，磁性固定化堿性蛋白酶與磁性殼聚糖微球一樣，保持了殼聚糖和fe3o4原有的特征吸收峰，表明磁性固定化堿性蛋白酶具備磁性和交聯(lián)酶的功能。

實施例2

1、制備磁性固定化堿性蛋白酶：

1.1、將0.2g磁性殼聚糖微球加入25mlph＝10的硼砂緩沖液中，再加入1ml20000u/ml的堿性蛋白酶，在4℃下反應(yīng)3h，得到混合產(chǎn)物；

1.2、向混合產(chǎn)物中加入250μl戊二醛(純度為50％)，在4℃下反應(yīng)3h，過濾，將濾渣反復(fù)用硼砂緩沖液洗滌，冷凍干燥，得到磁性固定化堿性蛋白酶；

2、制備蝦殼粉：

去除全部肉質(zhì)取蝦殼，將蝦殼用蒸餾水反復(fù)清洗，直至沒有懸浮的雜質(zhì)物質(zhì)，然后置于鼓風(fēng)干燥箱中，在100℃下烘干24小時，再將干燥好的蝦殼用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過100目篩，貯存?zhèn)溆茫?/p>

3、提取蝦殼中的蛋白：

3.1、將0.5g蝦殼粉加入到5ml75g/l乙酸溶液中，在65℃下反應(yīng)3h，得混合液；

3.2、將混合液過濾，向濾渣中加入0.5mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值為7，過濾，再用蒸餾水洗滌濾渣，干燥，得改性蝦殼粉；

3.3、測定改性蝦殼粉中蝦殼蛋白的含量，蝦殼蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.32％。

3.4、將0.1g改性蝦殼粉加入到10mlph為10的緩沖液中，接著按照15u/mg的酶底比加入磁性固定化堿性蛋白酶(事先將堿性蛋白酶在ph為10的硼砂緩沖液中溶脹過夜)，在酶解溫度為55℃、轉(zhuǎn)速為100r/min下攪拌酶解3小時，酶解結(jié)束后，用吸鐵石分離出磁性固定化堿性蛋白酶，將分離出的磁性固定化堿性蛋白酶用緩沖液洗滌后保存于4℃、ph為10的硼砂緩沖液，再將所得的酶解液過濾，將濾液進(jìn)行冷凍干燥，得到蝦殼蛋白多肽，即為蝦殼蛋白粉，蝦殼蛋白提取率為53.14％。

實施例3

1、制備磁性固定化堿性蛋白酶：

1.1、將0.2g磁性殼聚糖微球加入25mlph＝10的硼砂緩沖液中，再加入2ml32000u/ml的堿性蛋白酶，在10℃下反應(yīng)4h，得到混合產(chǎn)物；

1.2、向混合產(chǎn)物中加入350μl戊二醛(純度為50％)，在4℃下反應(yīng)3h，過濾，將濾渣反復(fù)用硼砂緩沖液洗滌，冷凍干燥，得到磁性固定化堿性蛋白酶；

2、制備蝦殼粉：

去除全部肉質(zhì)取蝦殼，將蝦殼用蒸餾水反復(fù)清洗，直至沒有懸浮的雜質(zhì)物質(zhì)，然后置于鼓風(fēng)干燥箱中，在100℃下烘干24小時，再將干燥好的蝦殼用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過100目篩，貯存?zhèn)溆茫?/p>

3、提取蝦殼中的蛋白：

3.1、將0.5g蝦殼粉加入到5ml90g/l乙酸溶液中，在65℃下反應(yīng)3h，得混合液；

3.2、將混合液過濾，向濾渣中加入0.5mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值為7，過濾，再用蒸餾水洗滌濾渣，干燥，得改性蝦殼粉；

3.3、測定改性蝦殼粉中蝦殼蛋白的含量，蝦殼蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.21％。

3.4、將0.15g改性蝦殼粉加入到10mlph為10的緩沖液中，接著加入按照10u/mg的酶底比加入磁性固定化堿性蛋白酶(事先將堿性蛋白酶在ph為10的硼砂緩沖液中溶脹過夜)，在酶解溫度為55℃、轉(zhuǎn)速為100r/min下攪拌酶解3小時，酶解結(jié)束后，用吸鐵石分離出磁性固定化堿性蛋白酶，將分離出的磁性固定化堿性蛋白酶用緩沖液洗滌后保存于4℃、ph為10的硼砂緩沖液，再將所得的酶解液過濾，將濾液進(jìn)行冷凍干燥，得到蝦殼蛋白多肽，即為蝦殼蛋白粉，蝦殼蛋白提取率為54.66％。

實驗一、溫度對磁性固定化堿性蛋白酶提取蝦殼蛋白的影響

試驗方法：以酶底比(磁性固定化堿性蛋白酶活與蝦殼蛋白質(zhì)量的比值)為15u/mg，在ph為10的硼砂緩沖液中酶解，酶解時間為3h，酶解溫度分別為45℃，50℃，55℃，60℃，酶解結(jié)束后，測定不同溫度條件下蝦殼蛋白的提取率。

實驗結(jié)果：

所得蝦殼蛋白的提取率與溫度的關(guān)系如圖3所示，從圖3可以看出，蝦殼蛋白較佳的酶解溫度為45-60℃，蝦殼蛋白最佳的酶解溫度為55℃。

實驗二、ph對磁性固定化堿性蛋白酶提取蝦殼蛋白的影響

試驗方法：以酶底比(磁性固定化堿性蛋白酶活與蝦殼蛋白質(zhì)量的比值)為15u/mg，分別在ph為9.5、10、10.5的緩沖液中酶解，酶解時間為3h，酶解溫度為55℃，酶解結(jié)束后，測定不同ph條件下蝦殼蛋白的提取率。

實驗結(jié)果：

所得蝦殼蛋白的提取率與提取ph值的關(guān)系如圖4所示，從圖4可以看出，蝦殼蛋白較佳的提取ph值為9.5-10.5℃，蝦殼蛋白最佳的酶解提取ph值為10。

實驗三、酶底比(磁性固定化堿性蛋白酶活與蝦殼蛋白質(zhì)量的比值)對磁性固定化堿性蛋白酶提取蝦殼蛋白的影響

試驗方法：分別以酶底比為10u/mg、15u/mg、20u/mg，在ph為10的緩沖液中酶解，酶解時間為3h，酶解溫度為55℃，酶解結(jié)束后，測定不同酶底比條件下蝦殼蛋白的提取率。

實驗結(jié)果：

所得蝦殼蛋白的提取率與酶底比的關(guān)系如圖5所示，從圖5可以看出，蝦殼蛋白較佳的酶底比為10-20u/mg，蝦殼蛋白最佳的酶底比值為15u/mg。

實驗四、磁性固定化堿性蛋白酶重復(fù)使用實驗

試驗方法：(參照sb/t10317-1999蛋白酶活力測定法)

在ph為10、酶解溫度為40℃下，用磁性固定化堿性蛋白酶酶解1wt％的酪蛋白溶液(稱取酪蛋白1克于研缽中，先用少量蒸餾水濕潤后，慢慢加入4ml0.2mol/lnaoh，充分研磨，用蒸餾水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分鐘，溶解后冷卻，定容至100ml，保存于冰箱內(nèi))，酶解時間為15min，重復(fù)使用磁性固定化堿性蛋白酶5次在上述條件下酶解酪蛋白，測定每次酶解結(jié)束后磁性固定化堿性蛋白酶的酶活。

實驗結(jié)果：

所得酶活保留比例與使用次數(shù)的關(guān)系如圖6所示，從圖6可以看出，磁性固定化堿性蛋白酶重復(fù)使用5次后，仍然可保留69.64％的酶活力。