本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種提高淡紫紫孢菌產(chǎn)白灰制菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)(meloidogynespp.)屬于側(cè)尾腺綱(secernentea)、墊刃目(tylenchida)、異皮總科(heteroderoidea)、黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)科(meloidogyne)中的黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)屬(meloidogynegoeldi)，是一類嚴(yán)重危害經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物并廣泛分布于世界各地的重要的植物病原線蟲(chóng)。黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)具有非常廣的寄主范圍，它不僅可以侵染經(jīng)濟(jì)性的糧食作物、蔬菜以及觀賞性的花卉樹(shù)木，甚至連雜草都可以侵染。黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)病害可以使經(jīng)濟(jì)作物減產(chǎn)10～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)到75%以上，甚至導(dǎo)致絕收。在我國(guó)，由于農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展、產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的不斷改革調(diào)整、種植制度的不斷合理優(yōu)化以及溫室和大棚栽培面積的迅速發(fā)展，再加上農(nóng)民的管理意識(shí)淡薄，從而導(dǎo)致黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)病害發(fā)病程度逐年呈上升趨勢(shì)，如我國(guó)南方黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)造成寄主作物常年減產(chǎn)15～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)到70%以上。黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)不僅造成作物減產(chǎn)，而且也同時(shí)誘發(fā)寄主產(chǎn)生其它的病害如根腐、青枯病、枯萎病和煙草黑脛病。目前，由黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)引起的病害已嚴(yán)重制約著我國(guó)保護(hù)地作物的發(fā)展和穩(wěn)產(chǎn)，影響著全國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)持續(xù)快速健康的發(fā)展。

淡紫紫孢菌（purpureocilliumlilacinum）作為一種線蟲(chóng)生防因子，大量研究表明其不僅有廣泛的寄主范圍，而且可以適應(yīng)不同的氣候條件，可以寄生于南方根結(jié)線蟲(chóng)、孢囊線蟲(chóng)、異皮線蟲(chóng)、金色線蟲(chóng)、穿刺線蟲(chóng)和珍珠線蟲(chóng)等多種線蟲(chóng)。淡紫紫孢菌因?yàn)榫哂辛餍杏|殺性、安全無(wú)污染性以及和發(fā)展環(huán)境友好型社會(huì)相符合的特點(diǎn)，可以作為一種新的有效生防因子，而且克服了傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的諸多問(wèn)題，是極具推廣潛力的應(yīng)用生防菌和功能菌。

park等在淡紫紫孢菌發(fā)酵液中檢測(cè)到白灰制菌素的存在，并用來(lái)作為線蟲(chóng)活性的指示劑，目前已被廣泛的用于防治植物線蟲(chóng)。白灰制菌素是由非核糖體代謝途徑產(chǎn)生的廣泛存在于植物、細(xì)菌和真菌中的一種九環(huán)脂肽類物質(zhì)。白灰制菌素有很多組分組成，其中白灰制菌素a和b是廣泛而大量存在的，其余的還有白灰制菌素d、e、f、h、k和l等組分，其中白灰制菌素a的作用是抑制線粒體atp的合成和參與不同的磷酸代謝途徑。

但目前現(xiàn)有技術(shù)中，淡紫紫孢菌的快速繁殖及白灰制菌素產(chǎn)量的提高仍存在著亟待解決的技術(shù)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種提高淡紫紫孢菌產(chǎn)白灰制菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基，采用該發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)淡紫紫孢菌具有成本低、發(fā)酵周期短、白灰制菌素產(chǎn)量高等特點(diǎn)。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

設(shè)計(jì)一種提高淡紫紫孢菌產(chǎn)白灰制菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基ppdb，包括以下重量份的原料：葡萄糖45～55份、蛋白胨4.5～5.5份、酵母提取物4.5～5.5份、k2hpo40.5～2.0份、na2co38.5～12.5份、mgso4·7h2o0.1～0.5份、玉米粉1.5～10份、feso4·7h2o0.005～0.05份和尿素1.5～10.5份。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下重量份的原料：葡萄糖50份、蛋白胨5份、酵母提取物5份、k2hpo41.0份、na2co310份、mgso4·7h2o0.2份、玉米粉3份、feso4·7h2o0.047份和尿素5份。

更優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有以下濃度的原料：葡萄糖50.0g/l、蛋白胨5.0g/l、酵母提取物5g/l、k2hpo41.0g/l、na2co310.0g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、玉米粉3g/l、feso4·7h2o0.047g/l和尿素5g/l。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值為7.5～8.5，優(yōu)選7.8～8.0。

所述葡萄糖為培菌工業(yè)葡萄糖，所述尿素為農(nóng)業(yè)尿素。

本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一種提高淡紫紫孢菌產(chǎn)白灰制菌素的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將活化的淡紫紫孢菌菌液接入搖瓶中培養(yǎng)，得到懸液后，再在轉(zhuǎn)速為200rpm/min、溫度為28℃的條件下震蕩培養(yǎng)48～36h，至od600=0.8～1.2，得搖瓶培養(yǎng)菌液；

所述搖瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，每升該培養(yǎng)基由馬鈴薯200g和葡萄糖20g加水定容，混合均勻，滅菌而成。

（2）種子罐培養(yǎng)

在種子罐內(nèi)設(shè)置所述提高淡紫紫孢菌產(chǎn)白灰制菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基，將步驟（1）所得搖瓶培養(yǎng)菌液接入種子罐中（搖瓶培養(yǎng)菌液接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基的1～3wt%），在通氣量為1.4l/h、溫度28℃、轉(zhuǎn)速180rpm/min的條件下（ph7.8），發(fā)酵培養(yǎng)36～54h，至溶氧量下降到20～30%（空氣飽和度），得種子罐培養(yǎng)菌液；

所述通氣量和溫度的控制方法如下：

開(kāi)始發(fā)酵時(shí)，控制氣液體積比為0.4～0.7；發(fā)酵中期，當(dāng)溶氧量下降至50%時(shí)，將氣液體積比調(diào)整為1.4～1.6；發(fā)酵后期，當(dāng)溶氧量下降至50%，將氣液體積比調(diào)整為2.1～2.3，保持通氣量，直至發(fā)酵結(jié)束。

（3）發(fā)酵

按5～10wt%的接種量將所得種子罐培養(yǎng)菌液接種發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵中期：當(dāng)溶氧量下降至50%時(shí)，將氣液體積比調(diào)整為1.0～1.8；發(fā)酵后期：當(dāng)溶氧量下降至50%時(shí)，將氣液體積比調(diào)整為2.1～2.7，保持通氣量，直至發(fā)酵結(jié)束，此過(guò)程中溫度維持在25～30℃，轉(zhuǎn)速200rpm/min。

本發(fā)明具有以下積極有益的技術(shù)效果：

（1）本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基成分配比均衡合理，能夠?yàn)榈献湘呔拇罅糠敝澈彤a(chǎn)白灰制菌素提供均衡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)淡紫紫孢菌快速生長(zhǎng)繁殖，并促其在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的白灰制菌素。

（2）本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基的原料主要來(lái)自廉價(jià)易得的農(nóng)副產(chǎn)品，且在進(jìn)行淡紫紫孢菌發(fā)酵的過(guò)程中，不僅提高了淡紫紫孢菌的孢子數(shù)量，而且還縮短了發(fā)酵周期、提高了白灰制菌素的產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但以下實(shí)施例只是用來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下實(shí)施例中所涉及的儀器設(shè)備如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)儀器設(shè)備；所涉及的生化試劑及原料如無(wú)特別說(shuō)明，均為市售常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：一種提高淡紫紫孢菌產(chǎn)白灰制菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基ppdb，含有以下濃度的原料：葡萄糖50.0g/l、蛋白胨5.0g/l、酵母提取物5g/l、k2hpo41.0g/l、na2co310.0g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、玉米粉3g/l、feso4·7h2o0.047g/l和尿素5g/l。

實(shí)施例2：一種提高淡紫紫孢菌產(chǎn)白灰制菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基ppdb，包括以下重量份的原料：葡萄糖55g/l、蛋白胨4.5g/l、酵母提取物5.5g/l、k2hpo40.5g/l、na2co312.5g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、玉米粉10g/l、feso4·7h2o0.005g/l和尿素10.5g/l。

實(shí)施例3：一種提高淡紫紫孢菌產(chǎn)白灰制菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基ppdb，包括以下重量份的原料：葡萄糖45g/l、蛋白胨5.5g/l、酵母提取物4.5g/l、k2hpo42.0g/l、na2co38.5g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、玉米粉1.5g/l、feso4·7h2o0.05g/l和尿素1.5g/l。

實(shí)施例4：一種提高淡紫紫孢菌產(chǎn)白灰制菌素的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將活化的淡紫紫孢菌菌液接入搖瓶中培養(yǎng)，得到懸液后，再在轉(zhuǎn)速為200rpm/min、溫度為28℃的條件下震蕩培養(yǎng)40h，至od600=1.0，得搖瓶培養(yǎng)菌液；所述搖瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，每升該培養(yǎng)基由馬鈴薯200g和葡萄糖20g加水定容，混合均勻，滅菌而成。

（2）種子罐培養(yǎng)

在種子罐內(nèi)設(shè)置實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)基ppdb，將步驟（1）所得搖瓶培養(yǎng)菌液接入種子罐中（搖瓶培養(yǎng)菌液接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基的2wt%），在通氣量為1.4l/h、溫度28℃、轉(zhuǎn)速180rpm/min的條件下（ph7.8），發(fā)酵培養(yǎng)48h，至溶氧量下降到25%（空氣飽和度），得種子罐培養(yǎng)菌液；

所述通氣量和溫度的控制方法如下：開(kāi)始發(fā)酵時(shí)，控制氣液體積比為0.5～0.6；發(fā)酵中期，當(dāng)溶氧量下降至50%時(shí)，將氣液體積比調(diào)整為1.5～1.6；發(fā)酵后期，當(dāng)溶氧量下降至50%，將氣液體積比調(diào)整為2.1～2.2，保持通氣量，直至發(fā)酵結(jié)束。

（3）發(fā)酵

按8wt%的接種量將所得種子罐培養(yǎng)菌液接種發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵（效果數(shù)據(jù)見(jiàn)表1），發(fā)酵中期：當(dāng)溶氧量下降至50%時(shí)，將氣液體積比調(diào)整為1.4～1.5；發(fā)酵后期：當(dāng)溶氧量下降至50%時(shí)，將氣液體積比調(diào)整為2.4～2.5，保持通氣量，直至發(fā)酵結(jié)束，此過(guò)程中溫度維持在27～28℃，轉(zhuǎn)速200rpm/min。

對(duì)比例

除了步驟（2）中在種子罐內(nèi)設(shè)置常規(guī)對(duì)照pdb培養(yǎng)基外，對(duì)照其它實(shí)施步驟與實(shí)施例4基本相同，實(shí)施例4與對(duì)比例的試驗(yàn)效果數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1不同處理對(duì)淡紫紫孢菌發(fā)酵效果對(duì)比

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