本發(fā)明涉及一種用于提高微生物次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)量的培養(yǎng)基，具體涉及一種用于提高深黃被孢霉代謝產(chǎn)物多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的培養(yǎng)基，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，pufas)是指含兩個或兩個以上不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)且碳原子數(shù)為16～22的直鏈脂肪酸。根據(jù)第一個不飽和鍵位置的不同，pufas可分為ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列(即ω編號系統(tǒng)，也叫n編號系統(tǒng))。其中，ω-3系列pufas主要有：α-亞麻酸(ala)、二十碳五烯酸(epa)、二十二碳五烯酸(dpa)和二十二碳六烯酸(dha)等；ω-6系列pufas主要有：亞油酸(la)、二高-γ-亞麻酸(dhgla)、γ-亞麻酸(gla)和花生四烯酸(aa)等。pufas大多數(shù)是重要生物活性物質(zhì)的前體，在機體內(nèi)具有穩(wěn)定細胞膜功能、調(diào)控基因表達、維持細胞因子和脂蛋白平衡、減肥、抗心血管病、促進生長發(fā)育、抗炎、抗癌、增加動物的產(chǎn)仔率和成活率等生理功能，而且雙鍵愈多，不飽和程度愈高，營養(yǎng)價值也愈高。目前，pufas在食品、醫(yī)藥、精細化工、飼料等許多行業(yè)和領(lǐng)域都得到了廣泛的應用，發(fā)展極為迅速，已受到越來越多業(yè)內(nèi)人士的關(guān)注。
目前，la、gla和ala主要通過植物種子來提取，而aa、epa和dha從海洋魚油中提取，一些哺乳動物也能提取aa。但是pufas的植物來源受氣候和地域的限制，并且植物資源受農(nóng)藥污染的威脅。而魚油有特殊氣味，在提煉過程中易氧化，工藝復雜，尚不能滿足市場需求。并且，由于各國老年人口比例的逐漸增加，心腦血管疾病的肆虐，以及人們?nèi)找嬷匾暯】档膽B(tài)度，作為藥品和保健食品材料的pufas的需求量會愈來愈多。因此，除la以外，目前的pufas資源遠遠不能滿足市場需求。
與傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝相比，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)pufas除了具有產(chǎn)量高外，還具有許多其他的優(yōu)點。例如，微生物細胞增殖快，生產(chǎn)周期短；微生物生長所需的原料豐富，價格便宜，如淀粉、糖類、特別是食品工業(yè)和造紙行業(yè)的廢棄物都可以加以利用，從而保護了環(huán)境；用微生物方法比農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所需的勞動力少，同時不受季節(jié)、氣候變化的限制；能連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低等。這些優(yōu)點決定了利用微生物生產(chǎn)pufas是一條開發(fā)新油源的良好途徑。產(chǎn)pufas的微生物多種多樣,包括細菌(嗜酸乳桿菌、混濁紅球菌、弧菌等)、酵母(彎假絲酵母、淺白色隱球酵母、膠黏紅酵母、斯達氏油脂酵母、產(chǎn)油油脂酵母等)、霉菌(深黃被孢霉、高山被孢霉、卷枝毛霉、米曲霉、土曲霉、雅致枝霉、三孢布拉氏霉)和藻類(鹽生杜氏藻、粉核小球藻、等鞭金藻、三角褐指藻、新月菱形藻等)。由于細菌產(chǎn)量低，目前對于pufas的生產(chǎn)主要集中在真菌和藻類。
檢索發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)中以深黃被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)pufas的研究多集中在以高濃度葡萄糖為營養(yǎng)碳源進行油脂生產(chǎn)，而通過降低培養(yǎng)基中葡萄糖的比例以低成本生物質(zhì)資源為營養(yǎng)進行發(fā)酵產(chǎn)脂的研究卻鮮有報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有的技術(shù)不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種用于提高深黃被孢霉代謝產(chǎn)物多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述用于提高深黃被孢霉代謝產(chǎn)物多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；其中所述的多不飽和脂肪酸是指：棕櫚酸(c16:0)，硬脂酸(c18:0)，油酸(c18:1)，亞油酸(c18:2)，α-亞麻酸(c18:3)，γ-亞麻酸(c18:3)，花生酸(c20:0)，花生一烯酸(c20:1)，花生二烯酸(c20:2)和/或花生四烯酸(c20:4)；
其特征在于：
所述種子培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖50g/l、大豆油1ml/l、酵母浸提物2g/l、硫酸銨2g/l、磷酸二氫鉀1g/l、磷酸氫二鉀1g/l、硫酸鎂2g/l；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖20～80g/l、大豆油1～4ml/l、玉米黃漿100～500ml/l、酵母浸提物2～10g/l、硫酸銨2g/l、磷酸二氫鉀1g/l、磷酸氫二鉀1g/l、硫酸鎂2g/l。
上述用于提高深黃被孢霉代謝產(chǎn)物多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的培養(yǎng)基中：所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分優(yōu)選為：葡萄糖80g/l、大豆油1ml/l、玉米黃漿200ml/l、酵母浸提物4g/l、硫酸銨2g/l、磷酸二氫鉀1g/l、磷酸氫二鉀1g/l、硫酸鎂2g/l。
上述用于提高深黃被孢霉代謝產(chǎn)物多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的培養(yǎng)基中：所述培養(yǎng)基采用自來水配制，ph為7.0±0.2，115℃滅菌30min。
本發(fā)明公開了一種用于提高深黃被孢霉代謝產(chǎn)物多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的培養(yǎng)基，是通過優(yōu)化培養(yǎng)基尤其是發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，降低培養(yǎng)基中葡萄糖的比例，增加低成本生物質(zhì)資源的比例，提高深黃被孢霉產(chǎn)多不飽和脂肪酸的產(chǎn)量，從而降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明所采用的玉米黃漿里面含有大量的玉米蛋白和少量的玉米淀粉，其是一種便宜易得的工業(yè)原料。本發(fā)明通過優(yōu)化培養(yǎng)基組分，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的玉米黃漿實現(xiàn)了降低生產(chǎn)成本的目的，同時所述培養(yǎng)基對發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的提升也有明顯的促進效果，具有工業(yè)應用前景。
附圖說明
圖1.深黃被孢霉多不飽和脂肪酸的氣相色譜分析圖譜。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明提供的發(fā)酵方法進行詳細描述和說明。所描述的實例僅僅是本發(fā)明內(nèi)容的一部分實例，不是全部實例。其內(nèi)容是對本發(fā)明的解釋而非用于限定本發(fā)明的保護范圍。
實施例1：深黃被孢霉的發(fā)酵及產(chǎn)脂分析
(1)菌株活化
將深黃被孢霉(編號3.341，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)在pda試管斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯浸出液200ml/l、葡萄糖20g/l、瓊脂15g/l，用自來水配制，ph自然，115℃滅菌30min)上活化，28℃恒溫箱培養(yǎng)5～7天，形成深黃色的分生孢子。
(2)種子液的制備
用無菌鏟挖取(1)中活化后的深黃被孢霉，投入到種子培養(yǎng)基(葡萄糖50g/l、大豆油1ml/l、酵母浸提物2g/l、硫酸銨2g/l、磷酸二氫鉀1g/l、磷酸氫二鉀1g/l、硫酸鎂2g/l，用自來水配制，ph為7.0±0.2，115℃滅菌30min)中，在26℃、180r/min條件下培養(yǎng)42h。
(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的(2)種子液按照體積比為5％的接種量轉(zhuǎn)接到裝有100ml新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為180r/min，28℃培養(yǎng)8天。采用4層無菌紗布過濾回收菌絲體。
(4)生物量的測定
將(3)中收集的菌絲體用自來水沖洗干凈，于60℃烘干，稱重。用g干菌體/l發(fā)酵液來計算生物量。
(5)菌體粗脂質(zhì)的測定
稱取干燥后的菌絲體于研缽中，加入適量石英砂研磨至微粒。將濾紙片疊成紙包后移入烘箱中105±2℃干燥2h。取出放入干燥器中冷卻至室溫。向濾紙包中裝入研細的菌絲體并稱量其總重量。將裝有樣品的濾紙包用長鑷子放入抽提筒中，加入石油醚使樣品包完全浸沒。連接好抽提器各部分，接通冷凝水水流在70-80℃恒溫水浴中進行抽提，每小時回流7次左右，萃取7h。抽提完畢后，用長鑷子取出濾紙包，在通風處使石油醚揮發(fā)。將濾紙包置于105±2℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重為止。再次稱量裝有樣品的濾紙包，減少的重量即為菌體粗脂質(zhì)的重量。粗脂質(zhì)重量/菌體重量即為產(chǎn)脂率(％)。
結(jié)果顯示，在上述條件下發(fā)酵結(jié)束后深黃被孢霉生物量為16.1g/l，產(chǎn)脂量5.43g/l，產(chǎn)脂率33.7％。
實施例2：深黃被孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化
為了選擇更適合深黃被孢霉產(chǎn)多不飽和脂肪酸的培養(yǎng)基，對深黃被孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖(a)、大豆油(b)、玉米黃漿(c)和酵母浸提物(d)的用量進行了l9(34)正交實驗優(yōu)化。設(shè)定實驗因素和水平如表1所示。
表1正交實驗因素水平表
深黃被孢霉的發(fā)酵及產(chǎn)脂分析方法同實施例1。
正交實驗結(jié)果如表2所示。
表2正交試驗結(jié)果
從表2中可以看出，葡萄糖20g/l、大豆油4ml/l、玉米黃漿500ml/l、酵母浸提物10g/l的條件下深黃被孢霉的生物量達到最大值34.04g/l，此時深黃被孢霉的產(chǎn)脂率為17.24％；其次是葡萄糖80g/l、大豆油4ml/l、玉米黃漿200ml/l、酵母浸提物2g/l的條件下深黃被孢霉的生物量達到32.98g/l，產(chǎn)脂率為36.70％。雖然在葡萄糖40g/l、大豆油1ml/l、玉米黃漿200ml/l、酵母浸提物10g/l以及葡萄糖80g/l、大豆油1ml/l、玉米黃漿500ml/l、酵母浸提物4g/l條件下深黃被孢霉的產(chǎn)油率達到最大，分別是52.23％和52.16％，但是此時深黃被孢霉的生物量和產(chǎn)油量也偏低。對生物量和產(chǎn)脂率的極差分析表明，對生物量影響最大的是大豆油，其后依次是玉米黃漿、葡萄糖和酵母浸提物，優(yōu)選方案是b3c2a3d1；對產(chǎn)脂率影響最大的是大豆油，其后依次是葡萄糖、玉米黃漿和酵母浸提物，優(yōu)選方案是b1a3c2d2。
對優(yōu)選的方案b3c2a3d1、b1a3c2d2進行搖瓶發(fā)酵后,前一組優(yōu)化培養(yǎng)基得到的生物量達到32.98g/l，產(chǎn)脂量達到12.10g/l，產(chǎn)脂率為36.70％；后一組優(yōu)化培養(yǎng)基得到的生物量為32.53g/l,產(chǎn)脂量達到17.29g/l，產(chǎn)脂率為53.16％。
驗證結(jié)果顯示：方案b1a3c2d2優(yōu)于方案b3c2a3d1，故選定的優(yōu)化方案為b1a3c2d2，即培養(yǎng)基中葡萄糖、大豆油、玉米黃漿、酵母浸提物的含量分別優(yōu)選80g/l、1ml/l、200ml/l、4g/l。
實施例3深黃被孢霉發(fā)酵液中多不飽和脂肪酸的檢測
(1)選用實施例2中優(yōu)化的培養(yǎng)基作為深黃被孢霉生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的發(fā)酵培養(yǎng)基。
(2)深黃被孢霉的發(fā)酵及菌體中脂質(zhì)的提取方法同實施例1。
以不接入深黃被孢霉的液體培養(yǎng)基作為對照組，對照組和實驗組分別設(shè)立3個平行。
(3)深黃被孢霉中多不飽和脂肪酸組分的氣相色譜分析
脂肪酸甲酯化：取脂質(zhì)樣品0.05g，置于10ml試管中，加入28g/l氫氧化鉀-甲醇溶液溶液1ml，60℃水浴皂化15min，冷卻后加入14％的三氟化硼-甲醇溶液1ml，于60℃水浴中振蕩2min進行甲酯化，放冷，準確加入正己烷1ml，振蕩加入飽和氯化鈉1ml，取上清液。
氣相色譜條件：脂肪酸甲酯化樣品采用gc-2010(shimadzuco.,japan)進行分析，色譜柱為db-waxetr(30m×0.32mm，φ0.25μm)。氫火焰離子檢測器檢測，汽化室和檢測器溫度分別為250℃和260℃，分流方式進樣1μl，分流比10:1，載氣為氮氣。程序升溫：初始溫度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以1℃/min升到210℃，保持15min。
多不飽和脂肪酸標準品購自上海甄準生物科技有限公司。
比對樣品和標準品在氣相色譜上出峰的保留時間(見圖1)，利用面積歸一化計算深黃被孢霉發(fā)酵液中不飽和脂肪酸的含量分別為：棕櫚酸(c16:0)2.02g/l，硬脂酸(c18:0)1.85g/l，油酸(c18:1)2.16g/l，亞油酸(c18:2)3.02g/l，α-亞麻酸(ala,c18:3)0.38g/l，γ-亞麻酸(gla,c18:3)0.31g/l，花生酸(c20:0)0.064g/l，花生一烯酸(c20:1)0.026g/l，花生二烯酸(c20:2)0.019g/l,花生四烯酸(c20:4)2.14g/l。
結(jié)果顯示，本發(fā)明所述培養(yǎng)基對發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的提升有明顯的促進效果，具有工業(yè)應用前景。