本發(fā)明屬于真菌類生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到一種松露菌代謝產(chǎn)物的制備方法。
背景技術(shù)：
松露菌truffle,是子實(shí)體在地下土壤中生長并成熟，又被稱作塊菌。松露菌在分類上隸屬于子囊菌門(ascomycota)，盤菌(pezizomycetes)，盤菌目(pezizales)，塊菌科(tuberaceae)。松露菌是大型真菌中最為珍貴的食用菌之一。含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及多種易被人體吸收的氨基酸和無機(jī)鹽。因此歐洲人將松露稱為地下黃金、黑色金鋼石與魚子醬、鵝肝并列“世界三大珍肴”。松露對生長環(huán)境的要求極其苛刻，且無法人工培育，產(chǎn)量稀少，特別昂貴。因此松露的食藥用價(jià)值亟需要一種新型的技術(shù)方案來開發(fā)確認(rèn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種松露菌代謝產(chǎn)物的制備方法，采用液體深層發(fā)酵等技術(shù)，對松露菌在發(fā)酵中代謝的產(chǎn)物進(jìn)行低成本、易掌握、保質(zhì)實(shí)用的制備，保證松露菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物的供應(yīng)。
一種松露菌代謝產(chǎn)物的制備方法包括以下步驟，并且以下步驟順次進(jìn)行，
步驟一、斜面培養(yǎng)
將從野生松露菌中分離出的松露菌菌株，以10％的接種量接種入ph值為6～6.5的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22℃～28℃，培養(yǎng)時(shí)間為8天～10天；
步驟二、液體深層發(fā)酵種子培養(yǎng)
將所述步驟一中培養(yǎng)后的松露菌菌株接種至搖瓶，斜面與搖瓶的接種量比為1：2，搖瓶內(nèi)置液體培養(yǎng)基，進(jìn)行液體深層發(fā)酵種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22℃～28℃，培養(yǎng)時(shí)間5天～7天；
步驟三、種子罐培養(yǎng)
向10l清潔無菌的種子罐內(nèi)裝入占罐內(nèi)容積50％的培養(yǎng)基，按照1kg/㎝2～1.5kg/㎝2的高壓蒸汽滅菌0.3小時(shí)～0.5小時(shí)，其中蒸汽的溫度為120℃～125℃，冷卻至室溫后，無菌操作接入所述步驟二中培養(yǎng)后的菌種，進(jìn)行種子罐發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22℃～28℃，培養(yǎng)時(shí)間8天～10天；
步驟四、大發(fā)酵罐擴(kuò)繁培養(yǎng)
向100l清潔無菌的種子罐內(nèi)裝入占罐內(nèi)容積50％的培養(yǎng)基，按照1kg/㎝2～1.5kg/㎝2的高壓蒸汽滅菌0.3小時(shí)～0.5小時(shí)，其中蒸汽的溫度為120℃～125℃，冷卻至室溫后備用，
將所述步驟三培養(yǎng)好的菌種無菌操作移入大發(fā)酵罐，進(jìn)行大罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22℃～28℃，培養(yǎng)時(shí)間8天～10天，獲得大罐發(fā)酵產(chǎn)物；
步驟五、發(fā)酵產(chǎn)物提取濃縮
將所述步驟四中獲得的大罐發(fā)酵產(chǎn)物用離心機(jī)分離，得到濾液ⅰ及菌絲ⅰ，將菌絲ⅰ與清水按體積比1：4的比例混合靜止0.3小時(shí)后水提0.7小時(shí)，用200目濾布過濾得到濾液ⅱ，
將濾液ⅰ與濾液ⅱ混合并放入減壓濃縮裝置，設(shè)置減壓濃縮裝置的壓強(qiáng)參數(shù)為60kpa～70kpa，加熱溫度為50℃～60℃，濃縮至溶液含水量為30％，得到松露菌發(fā)酵產(chǎn)物濃縮液。
所述步驟二中搖瓶內(nèi)所用的液體培養(yǎng)基ph值為6～6.5，液體培養(yǎng)基成分為1000份的水、5份的蛋白胨、2.5份的酵母膏、40份的蔗糖、2份的kh2po4和2份的mgso4·7h2o。
所述步驟三種子罐培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與步驟二中所用的培養(yǎng)基相同，接種量為所用的培養(yǎng)基體積的8％～10％。
所述步驟四大罐培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與步驟二中所用的培養(yǎng)基相同，接種量為所用的培養(yǎng)基體積的8％～10％。
所述步驟五中離心機(jī)的離心速率為8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為5分鐘。
通過上述設(shè)計(jì)方案，本發(fā)明可以帶來如下有益效果：
本發(fā)明公開的一種松露菌代謝產(chǎn)物的制備方法，設(shè)計(jì)的工藝路線合理，投入的成本低，生產(chǎn)周期短，擴(kuò)大生產(chǎn)率高，代謝產(chǎn)物穩(wěn)定的特點(diǎn)。經(jīng)松露菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物對更年期動物的內(nèi)分泌失調(diào)、生殖系統(tǒng)和行為學(xué)等方面進(jìn)行藥理活性及有效劑量進(jìn)行測試證明松露菌發(fā)酵產(chǎn)物對更年期綜合癥有藥理活性，療效顯著。
附圖說明
以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明：
圖1為本發(fā)明一種松露菌代謝產(chǎn)物的制備方法的流程框圖。
具體實(shí)施方式
如圖所示，一種松露菌代謝產(chǎn)物的制備方法，包括以下步驟，并且以下步驟順次進(jìn)行，
步驟一、斜面培養(yǎng)
將從野生松露菌中分離出的松露菌菌株，以10％的接種量接種入ph值為6～6.5的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22℃～28℃，培養(yǎng)時(shí)間為8天～10天；
步驟二、液體深層發(fā)酵種子培養(yǎng)即搖瓶培養(yǎng)
將所述步驟一中培養(yǎng)后的松露菌菌株，按照斜面與搖瓶之比為1：2的接種量，接種至搖瓶，搖瓶內(nèi)置液體培養(yǎng)基，進(jìn)行液體深層發(fā)酵種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22℃～28℃，培養(yǎng)時(shí)間5天～7天；
步驟三、種子罐培養(yǎng)
10l種子罐清洗干凈后向罐內(nèi)裝入罐體容積50％的培養(yǎng)基，按照1kg/㎝2～1.5kg/㎝2的高壓蒸汽滅菌0.3小時(shí)～0.5小時(shí)，蒸汽溫度為溫度為120℃～125℃，冷卻至室溫后，無菌操作接入所述步驟二中培養(yǎng)后的菌種，進(jìn)行種子罐發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22℃～28℃，培養(yǎng)時(shí)間7天～10天；
步驟四、大發(fā)酵罐擴(kuò)繁培養(yǎng)
100l大罐清洗干凈后向罐內(nèi)裝入罐體容積50％的培養(yǎng)基，按照1kg/㎝2～1.5kg/㎝2的高壓蒸汽滅菌0.3小時(shí)～0.5小時(shí)，蒸汽溫度為溫度為120℃～125℃，冷卻至室溫后備用。將移種管路聯(lián)接在種子罐與大發(fā)酵罐上，通入蒸氣對移種管路進(jìn)行滅菌0.2小時(shí)～0.3小時(shí)，冷卻后將步驟三培養(yǎng)好的菌種通過壓力差移入大發(fā)酵罐，進(jìn)行大罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22℃～28℃，培養(yǎng)時(shí)間7天～10天；
步驟五、發(fā)酵產(chǎn)物提取濃縮
將大罐發(fā)酵產(chǎn)物用離心機(jī)分離，離心機(jī)設(shè)置為離心速率為8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為5分鐘，得到濾液ⅰ及菌絲ⅰ。將菌絲與清水按體積比1：4的比例混合靜止0.3小時(shí)后水提0.7小時(shí)，200目濾布過濾得到濾液ⅱ，將濾液ⅰ與濾液ⅱ混合后，放入減壓濃縮裝置，設(shè)置減壓濃縮裝置的壓強(qiáng)參數(shù)為60kpa～70kpa，加熱溫度為50℃～60℃，濃縮至溶液含水量為30％，得到松露菌發(fā)酵中代謝產(chǎn)物濃縮液；
所述步驟二中搖瓶內(nèi)所用的液體培養(yǎng)基ph值為6～6.5，液體培養(yǎng)基成分為1000重量份的水、5重量份的蛋白胨、2.5重量份的酵母膏、40重量份的蔗糖、2重量份的kh2po4、2重量份的mgso4·7h2o。
所述步驟二液體深層發(fā)酵種子培養(yǎng)之后直接進(jìn)行步驟三種子罐培養(yǎng)，再進(jìn)行大罐移種發(fā)酵培養(yǎng)，其中種子罐與大罐培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與步驟二中所用的培養(yǎng)基相同，菌種為初始菌種，染菌率低，擴(kuò)大生產(chǎn)率穩(wěn)定。接種量為所用培養(yǎng)基體積的8％～10％，培養(yǎng)溫度為22℃～28℃，培養(yǎng)時(shí)間為7天～10天。
松露菌具有以下性質(zhì)：
1、菌落外觀：菌絲網(wǎng)狀、較長、氣生菌絲發(fā)達(dá)、白色。
2、鏡檢：(1)菌絲粗壯，呈細(xì)長圓柱形。
(2)美藍(lán)單染色著色深，均勻。
(3)可見大量生長點(diǎn)，有空泡。
(4)有鎖狀聯(lián)合，且較發(fā)達(dá)。
(5)無雜菌污染。
3、生理生化特征：
(1)菌絲生長最佳溫度22℃～28℃。
(2)生長最佳ph值6～6.5。
(3)對氧的需求：屬好氧性真菌。
(4)培養(yǎng)基生長最佳水分95％。
4、培養(yǎng)基成分：pda綜合培養(yǎng)基。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該松露菌屬于塊菌科塊菌屬。本發(fā)明的松露菌種傳代18次以上不退化，屬于抗老化能力、穩(wěn)定性及代謝能力都很強(qiáng)的菌株。
利用分離后的松露菌菌株進(jìn)行深層發(fā)酵采用固態(tài)分離-液態(tài)發(fā)酵-液態(tài)提取的工藝路線，包括如下步驟：
斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、大罐培養(yǎng)、濃縮提取。
所述的斜面培養(yǎng)，所選用的培養(yǎng)基為pda綜合培養(yǎng)基即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，ph值6～6.5，培養(yǎng)溫度22℃～28℃，培養(yǎng)時(shí)間8天～10天。
所述的液體深層發(fā)酵種子培養(yǎng)即搖瓶培養(yǎng)，搖瓶內(nèi)所用的液體培養(yǎng)基成分重量百分比為1000g水內(nèi)包括蛋白胨0.5％、酵母膏0.23％、蔗糖4％、kh2po40.2％、mgso4·7h2o0.2％，液體培養(yǎng)基ph值6～6.5，斜面與搖瓶接種量之比為1：2，培養(yǎng)溫度22℃～28℃，培養(yǎng)時(shí)間5天～7天。
所述的種子罐培養(yǎng)：種子罐內(nèi)裝入培養(yǎng)基為罐體容積50％，種子罐內(nèi)所用的液體培養(yǎng)基成分重量百分比為1000g水內(nèi)包括蛋白胨0.5％、酵母膏0.23％、蔗糖4％、kh2po40.2％、mgso4·7h2o0.2％，液體培養(yǎng)基ph值6～6.5，接種量為培養(yǎng)基體積的10％，培養(yǎng)溫度為22℃～28℃，空氣流量0.6v/v，罐壓0.2㎏/㎝2培養(yǎng)時(shí)間7天～10天；
所述的大罐培養(yǎng)：迅速增加菌絲體數(shù)量，大罐內(nèi)裝入培養(yǎng)基為罐體容積的50％，大罐內(nèi)所用的液體培養(yǎng)基成分重量百分比為1000g水內(nèi)包括蛋白胨0.5％、酵母膏0.23％、蔗糖4％、kh2po40.2％、mgso4·7h2o0.2％，液體培養(yǎng)基ph值6～6.5，接種量為培養(yǎng)基的10％，溫度22℃～28℃，空氣流量0.6v/v，罐壓0.4㎏/㎝2，培養(yǎng)時(shí)間為7天～10天。
實(shí)施例1
斜面菌種培養(yǎng)：采用pda綜合培養(yǎng)基，ph6.3，培養(yǎng)溫度24℃。該菌萌發(fā)快，菌種接后2.5天內(nèi)形成以基點(diǎn)的明顯菌落，10天菌落長滿管。菌絲初期褐色，網(wǎng)狀，分枝多。通過鏡檢明顯觀察到菌絲粗壯，分枝多，鎖狀聯(lián)合發(fā)達(dá)，美藍(lán)單染色著色深，可見大量生長點(diǎn)，有空泡，無雜菌污染。
液體深層發(fā)酵種子培養(yǎng)：
搖瓶內(nèi)所用的液體培養(yǎng)基成分重量百分比為1000g水內(nèi)包括蛋白胨0.5％、酵母膏0.23％、蔗糖4％、kh2po40.2％、mgso4·7h2o0.2％，ph值6.3，高壓壓力1.2kg/㎝2滅菌30min，冷卻后接種，接種量為斜面與搖瓶之比1：6，即一個(gè)斜面接6個(gè)500ml的搖瓶(裝量150ml)，培養(yǎng)溫度26℃～27℃，旋轉(zhuǎn)式搖床150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)7天，菌球濕重達(dá)20％以上。其中，濕重測定方法：取100ml培養(yǎng)液置于量筒中，靜置15min，觀察菌球沉降的刻度的百分?jǐn)?shù)。菌球味為特殊香味，稍酸，鏡檢觀察到菌絲著色深，粗壯，分枝多，生長點(diǎn)明顯可見，有鎖壯聯(lián)合，未見雜菌污染，即可作為種子罐培養(yǎng)備用。
種子罐培養(yǎng)：培養(yǎng)基與搖瓶種子培養(yǎng)基相同，裝入培養(yǎng)基量為罐體的50％，ph值6.3，高壓壓力1.2kg/㎝2滅菌30min，冷卻后接種，接種量為培養(yǎng)基的10％，溫度26℃～27℃，空氣流量0.6v/v，罐壓0.2kg/㎝2，培養(yǎng)7天，當(dāng)外觀形態(tài)檢查到菌球濕重達(dá)30％以上，味感特殊香味，鏡檢觀察到菌絲著色深，粗壯，分枝多，生長點(diǎn)明顯可見有鎖狀聯(lián)合，未見雜菌污染即可進(jìn)行大罐培養(yǎng)。
大罐培養(yǎng)所用培養(yǎng)基配方種子罐培養(yǎng)基相同，裝入培養(yǎng)基量為罐體的50％，ph值6.3，高壓壓力1.2kg/㎝2滅菌30min后將移種通道連接好，通入蒸氣20min，滅菌冷卻后進(jìn)行移種，移種量為培養(yǎng)基的10％。ph值6.3，溫度26℃～27℃，空氣流量0.6v/v，罐壓0.4kg/㎝2，培養(yǎng)7天，當(dāng)外觀形態(tài)檢查到菌球濕重達(dá)30％以上，味感特殊香味，鏡檢觀察到菌絲著色深，粗壯，分枝多，生長點(diǎn)明顯可見有鎖狀聯(lián)合，未見雜菌污染即可進(jìn)行放罐。
外觀檢查，培養(yǎng)基呈粥狀，菌絲黃白、細(xì)膩，內(nèi)含部分菌球，直徑0.2-0.5mm，無雜菌污染.鏡檢菌絲著色深，粗壯，分枝多，有鎖狀聯(lián)合，生長點(diǎn)明顯可見。
提取濃縮：將松露菌發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物用離心機(jī)分離，離心速率為8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為5分鐘。得到濾液ⅰ及菌絲ⅰ。將菌絲ⅰ與清水按1：4的體積比混合靜止0.3小時(shí)后水提0.7小時(shí)，200目濾布過濾得到濾液ⅱ，將濾液ⅰ與濾液ⅱ混合后，放入減壓濃縮裝置，設(shè)置減壓濃縮裝置的壓強(qiáng)參數(shù)為60kpa～70kpa，加熱溫度為50℃～60℃，濃縮至溶液含水量為30％，得到松露菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物濃縮液；
本發(fā)明采用液體深層發(fā)酵等技術(shù)，均根據(jù)所開發(fā)菌種的特點(diǎn)，依照低成本、易掌握、保質(zhì)實(shí)用原則，依托現(xiàn)有可行完善工藝，合理組合、優(yōu)化選擇，建立最佳生產(chǎn)工藝路線。
實(shí)施例2：
藥理測試：松露菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物對更年期動物的內(nèi)分泌失調(diào)、生殖系統(tǒng)和行為學(xué)等方面進(jìn)行藥理活性及有效劑量進(jìn)行測試，報(bào)告結(jié)果如下：
1.發(fā)酵產(chǎn)物對摘除卵巢小鼠雌激素及子宮系數(shù)的影響。
與正常對照組比較，模型組血清e2(雌二醇)水平明顯降低(p<0.01)，子宮系數(shù)降低，表明模型成立。給藥組與模型組比較，25ml/kg劑量組能夠明顯增加子宮重量，提高子宮系數(shù)，25.20ml/kg劑量組顯著升高e2水平。結(jié)果見表1。
表1樣品對摘除卵巢小鼠雌激素及子宮系數(shù)的影響
與模型組比較*p<0.05,**p<0.01
2.發(fā)酵產(chǎn)物對小鼠足跖部汗腺分泌的影響
與青年組比較，更年組汗點(diǎn)數(shù)明顯增加(p<0.05),樣品25ml/kg劑量組與更年給比較，汗點(diǎn)數(shù)明顯減少，其他劑量組同更年組比較變化不明顯。結(jié)果見表2。
表2樣品對大鼠足跖部汗腺分泌的影響
與更年組比較：*p<0.05
3.發(fā)酵產(chǎn)物對更年期小鼠自主活動的影響
樣品0.25及0.2ml/10g體重劑量組與更年組比較，能明顯減少更年期小鼠活動次數(shù)(p<0.05)。結(jié)果見表3。
表3樣品對更年期小鼠自主活動的影響
與更年組比較：*p<0.05
結(jié)論:
更年期綜合癥指婦女絕經(jīng)前后出現(xiàn)性激素波動或減少所致的一系列以自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主，伴有神經(jīng)心理癥狀的一組癥候群。更年期綜合癥的發(fā)生是隨著女性生殖年齡過渡到老年階段而引起的，是由于卵巢功能衰退、性激素分泌降低，促性腺激素升高，致神經(jīng)、內(nèi)分泌功能整體性失調(diào)，尤以下丘腦自主神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)功能紊亂為主，交感-腎上腺系統(tǒng)亢進(jìn)，而出現(xiàn)的一系列臨床體征。e2是女性卵巢成熟濾泡分泌的一種雌激素，絕經(jīng)后卵泡數(shù)目減少，功能衰退，雌激素水平下降，e2水平的下降可導(dǎo)致動物子宮萎縮，使子宮濕重、子宮系數(shù)明顯降低。本結(jié)果顯示：發(fā)酵產(chǎn)物25ml/kg劑量組能明顯提高雌二醇含量，增加子宮系數(shù)。
臨床上更年期癥狀主要表現(xiàn)為心煩不寐，烘熱汗出，口干咽噪，煩躁易怒和失眠多夢等陰虛火旺癥狀，本結(jié)果表明發(fā)酵產(chǎn)物能夠減少老年小鼠自主活動次數(shù)，減少摘除卵巢鼠汗液的分泌，改善更年期癥狀，可以提高機(jī)休雌激素水平。
綜上所述，松露菌發(fā)酵中的代謝產(chǎn)物可明顯提高雌激素水平，增加子宮系數(shù)，減少自主活動次數(shù)，減少汗液分泌。可改善更年期綜合癥的臨床癥狀。松露菌發(fā)酵產(chǎn)物對更年期綜合癥有藥理活性，療效顯著。