本發(fā)明涉及一種無需噬斑克隆和篩選標(biāo)簽的山羊痘病毒重組系統(tǒng)，還涉及由此系統(tǒng)構(gòu)建得到的雙表達(dá)小反芻獸疫病毒(pestedespetitsruminantsvirus，pprv)h和f蛋白且無篩選標(biāo)簽的重組山羊痘病毒疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

小反芻獸疫(pestedespetitsofruminants，ppr)和山羊痘(goatpox，gp)是分別由副黏病毒科(paramyxoviridae)麻疹病毒屬(morbolivirus)的小反芻獸疫病病毒(pestedespetitsofruminants，pprv)和正痘病毒科(orthopoxvirus)山羊痘病毒屬(capripoxvirus)的山羊痘病毒(goatpoxvirus，gpv)引起的危害綿羊和山羊等小反芻動(dòng)物的2種重大疫病。其中ppr長期以來一直在非洲、中東、中亞、南亞及東南亞地區(qū)流行，該病作為一種危害巨大的跨國動(dòng)物疫病，2007年傳入我國西部邊境地區(qū)并導(dǎo)致疫情發(fā)生。2013年12月至2014年，我國15個(gè)以上省份發(fā)生小反芻獸疫疫情造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，山羊痘多年來在世界和我國大部分地區(qū)表現(xiàn)為地方流行性，由于其降低產(chǎn)奶量、導(dǎo)致流產(chǎn)、損壞羊毛等，也造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其和小反芻獸疫都是oie必須通報(bào)的重大疫病。

pprv結(jié)構(gòu)蛋白中的血凝蛋白(h)蛋白和融合蛋白(f)是病毒兩個(gè)重要的糖蛋白，介導(dǎo)病毒傳染及激發(fā)宿主的免疫保護(hù)作用。其中h蛋白作為病毒和宿主細(xì)胞膜結(jié)合過程中的受體，具有調(diào)節(jié)病毒吸附并滲入寄主細(xì)胞的作用，并刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，參與體液免疫，是機(jī)體主要的保護(hù)性抗原，也是引起宿主細(xì)胞發(fā)生病變的主要決定因素。f糖蛋白具有細(xì)胞融合活性，是決定病毒感染成功與否的關(guān)鍵因素，能夠引起病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變，還具有病毒誘導(dǎo)細(xì)胞溶血素、細(xì)胞溶合和啟動(dòng)感染等其他生物學(xué)活性，也是pprv誘導(dǎo)中和抗體形成的主要免疫原。f蛋白誘導(dǎo)的中和抗體水平較h蛋白低，主要參與細(xì)胞免疫，即使很低的中和抗體水平也能夠提供ppr強(qiáng)毒攻擊保護(hù)。因此，能夠同時(shí)表達(dá)pprvh/f蛋白的重組山羊痘病毒免疫羊可以提供更加全面的免疫保護(hù)。但是之前構(gòu)建的小反芻獸疫重組病毒，一般只表達(dá)h或f其中一種蛋白，或?qū)和f蛋白進(jìn)行融合(可能會(huì)導(dǎo)致抗原性發(fā)生變化)提供的免疫保護(hù)并不全面，增加病毒在免疫壓力不足情況下產(chǎn)生變異突變的概率，從而產(chǎn)生新的免疫逃避機(jī)制。

山羊痘病毒弱毒疫苗預(yù)防gp安全有效。目前，山羊痘病毒已被廣泛用作活疫苗載體，其具有以下優(yōu)點(diǎn)：基因組龐大約150kb，遺傳穩(wěn)定；其胸苷激酶(tk)基因編碼區(qū)為復(fù)制非必需區(qū)，可允許大容量的外源基因插入和表達(dá)(至少25kb)；gpv感染宿主譜狹窄，只感染羊等小反芻動(dòng)物；生產(chǎn)成本低廉、儲(chǔ)藏運(yùn)輸無需冷凍、使用方便；特別重要的是，采用gp弱毒疫苗為載體構(gòu)建ppr-gp重組二聯(lián)活疫苗，可同時(shí)預(yù)防gp、綿羊痘和ppr，實(shí)現(xiàn)一種活毒疫苗預(yù)防多種烈性傳染病，而且能夠作為diva(differentiatinginfectedfromvaccinatedanimals)疫苗使用來區(qū)分自然感染和疫苗免疫感染，對(duì)中國廣大非疫區(qū)的ppr血清學(xué)監(jiān)測(cè)極為重要。目前，羊痘病毒作為載體已經(jīng)用于構(gòu)建重組疫苗，如狂犬病重組疙瘩皮膚病病毒疫苗(疙瘩皮膚病為羊痘病毒一個(gè)亞型)、牛瘟重組山羊痘病毒疫苗、藍(lán)舌病毒重組山羊痘病毒疫苗、小反芻獸疫重組山羊痘病毒疫苗等，都顯示了良好的免疫效果。

雖然傳統(tǒng)的ppr弱毒疫苗能夠提供充分的保護(hù)效力，但是其由于不能夠作為diva疫苗區(qū)分自然感染和疫苗接種感染，干擾該病的血清學(xué)監(jiān)測(cè)，影響該病的凈化和根除。針對(duì)ppr，已有諸多報(bào)道采用各種病毒載體ppr重組疫苗，如分別表達(dá)pprv全長融合蛋白(f)和血凝蛋白(h)的重組牛痘病毒疫苗(mva-h,mva-f)，表達(dá)pprvh蛋白的重組羊痘病毒疫苗，以腺病毒為載體表達(dá)pprvh和f蛋白的重組病毒疫苗(rad-h,rad-f,rad-f-h)等，這些都是單基因表達(dá)，或者將h和f蛋白融合后表達(dá)(可能會(huì)影響蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響抗原性)，不能提供天然、全面的免疫保護(hù)。其中羊痘作為載體的時(shí)候，由于其容易聚集、不易分散，需要復(fù)雜的純化過程，包括反復(fù)藥物篩選、噬斑克隆、超聲分散等方法綜合使用。在之前本發(fā)明發(fā)明人構(gòu)建的表達(dá)pprvh或f蛋白的重組山羊痘病毒的過程中，進(jìn)行了10代次以上的純化，工作量巨大。同時(shí)，為了易于純化，使用了綠色熒光蛋白(gfp)作為示蹤標(biāo)簽和gpt作為藥物篩選基因，使得插入序列更長，額外增加了不必要的免疫原，這對(duì)重組病毒疫苗將來的臨床應(yīng)用埋下潛在的不利影響。

為了克服山羊痘重組病毒構(gòu)建方法的缺點(diǎn)，并同時(shí)構(gòu)建提供更全面免疫原性的同時(shí)表達(dá)小反芻獸疫h(yuǎn)和f蛋白的重組山羊痘病毒，本發(fā)明在世界范圍內(nèi)首次建立了無需噬斑克隆和無篩選標(biāo)記的創(chuàng)新的重組山羊痘病毒構(gòu)建系統(tǒng)，并利用其構(gòu)建了雙表達(dá)pprvh和f蛋白的重組山羊痘病毒，最后對(duì)其免疫原性進(jìn)行了評(píng)估。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種無需噬斑克隆和篩選標(biāo)簽的山羊痘病毒重組系統(tǒng)。

本發(fā)明的目的之二在于提供由所述系統(tǒng)構(gòu)建得到的雙表達(dá)小反芻獸疫病毒h和f蛋白且無篩選標(biāo)簽的重組山羊痘病毒疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明的一種無需噬斑克隆和篩選標(biāo)簽的山羊痘病毒重組系統(tǒng)，包括以下部分：

(1)重組山羊痘病毒：

所述的重組山羊痘病毒的tk基因中依次插入有apai酶切位點(diǎn)、egfp基因、ires序列、gpt基因、p11啟動(dòng)子序列、p7.5啟動(dòng)子序列以及noti酶切位點(diǎn)，命名為rgpv-na；

(2)用于插入外源基因的雙表達(dá)質(zhì)粒載體：

所述的雙表達(dá)載體按照以下方法構(gòu)建得到：以tk-f和tk-r為引物，以提取的gpv基因組為模板，擴(kuò)增tk基因，并克隆至xhoi和ecori雙酶切的psp72質(zhì)粒，命名為psp72-tk；以p7.5-4-f和p7.5-4-r為引物、質(zhì)粒ptk-gpt-ires-egfp為模板pcr擴(kuò)增p7.5啟動(dòng)子片段，命名為p7.5-4；同時(shí)以psp72-tk-f和psp72-tk-r為引物，以psp72-tk質(zhì)粒為模板，pcr擴(kuò)增出psp72-tk片段；將psp72-tk片段和p7.5-4片段分別用nhei和saci雙酶切并連接，獲得質(zhì)粒psp72-tk-p7.5-4；以p7.5-interval-f和p7.5-interval-r為引物，以pprv基因組全長cdna克隆為模板，擴(kuò)增用于隔開兩個(gè)p7.5啟動(dòng)子的間隔序列p7.5-interval；以p7.5-5-f和p7.5-5-r為引物，質(zhì)粒ptk-gpt-ires-egfp為模板，pcr擴(kuò)增p7.5啟動(dòng)子片段，命名為p7.5-5；以psp72-tk-p7.5-4-f和psp72-tk-p7.5-4-r為引物，以質(zhì)粒psp72-tk-p7.5-4為模板，pcr擴(kuò)增出psp72-tk-p7.5-4片段；采用一步克隆法試劑盒將以上p7.5-interval、p7.5-5和psp72-tk-p7.5-4連接到一起，獲得用于插入外源基因的雙表達(dá)質(zhì)粒載體，命名為ptk-p7.5-4-5-double質(zhì)粒；

(3)用于病毒重組的宿主細(xì)胞。

在所述的山羊痘病毒重組系統(tǒng)中，優(yōu)選的，所述的重組山羊痘病毒通過以下方法制備得到：

(1)穿梭質(zhì)粒ptk-na的構(gòu)建：

以na-f和na-r為引物和質(zhì)粒ptk-gpt-ires-egfp為模板，擴(kuò)增gpt-ires-egfp序列，并在兩端分別引入noti和apai酶切位點(diǎn)；以ptk-f和ptk-r為引物和ptk-gpt-ires-egfp為模板，擴(kuò)增包含質(zhì)粒和tk基因的pcr片段，命名為ptk；用一步克隆試劑盒將含有noti和apai酶切位點(diǎn)的gpt-ires-egfppcr片段和ptkpcr片段連接，獲得穿梭質(zhì)粒，命名為ptk-na；

(2)重組山羊痘病毒的構(gòu)建

lt細(xì)胞生長于6孔板中，至細(xì)胞長至密度80％，接種gpv病毒液，37℃感作1h后，轉(zhuǎn)染穿梭質(zhì)粒ptk-na，聯(lián)合gpt、gfp和噬斑克隆等篩選方法，最終獲得純化的含有noti和apai的重組gpv，命名為rgpv-na。

在所述的山羊痘病毒重組系統(tǒng)中，優(yōu)選的，所述的pprv基因組全長cdna克隆為pprv/n75/1疫苗株的全長cdna克隆。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的pprv/n75/1疫苗株的全長cdna克隆記載在申請(qǐng)?zhí)枮?01010559545.8，發(fā)明名稱為“小反芻獸疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用”的中國專利申請(qǐng)中，在該申請(qǐng)中記載了pci-pprv的質(zhì)粒序列(從5′端到3′端)，其中1154-17101為pprv/n75/1基因組序列，即pprv/n75/1疫苗株的全長cdna克隆。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的山羊痘病毒重組系統(tǒng)在構(gòu)建同時(shí)表達(dá)1個(gè)或兩個(gè)以上外源基因且無篩選標(biāo)簽的重組山羊痘病毒疫苗中的用途。

其中，優(yōu)選的，所述的山羊痘病毒重組系統(tǒng)用于構(gòu)建同時(shí)表達(dá)1-4個(gè)外源基因且無篩選標(biāo)簽的重組山羊痘病毒疫苗。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的重組山羊痘病毒疫苗為雙表達(dá)小反芻獸疫病毒h和f蛋白且無篩選標(biāo)簽的重組山羊痘病毒疫苗。

一種使用所述的山羊痘病毒重組系統(tǒng)構(gòu)建雙表達(dá)小反芻獸疫病毒h和f蛋白且無篩選標(biāo)簽的重組山羊痘病毒的方法，包括以下步驟：

(1)以f-double-f/f-double-r和h-double-f/h-double-r為引物，以pprv基因組全長cdna克隆為模板，擴(kuò)增出的pprvf和pprvh片段分別以xbai/spei和pmei/hindiii雙酶切，依次克隆至ptk-p7.5-4-5-double質(zhì)粒的xbai/saci和smai/hindiii位點(diǎn)，最終獲得質(zhì)粒ptk-p7.5-double-double-pprv-h/f；

(2)雙表達(dá)小反芻獸疫病毒h和f蛋白且無篩選標(biāo)簽的重組山羊痘病毒的拯救

lt細(xì)胞生長于6孔板中，至細(xì)胞長至密度80％，接種禽痘病毒，37℃感作1h后，轉(zhuǎn)染ptk-p7.5-double-pprv-h/f及noti/apai酶切后的rgpv-na基因組，轉(zhuǎn)染后觀察綠色熒光蛋白表達(dá)及細(xì)胞病變，待試驗(yàn)孔出現(xiàn)cpe及綠色熒光噬斑時(shí)，同時(shí)陰性對(duì)照孔沒有綠色熒光噬斑時(shí)，收獲細(xì)胞及其培養(yǎng)上清，反復(fù)凍融3次，于-80℃保存，獲得雙表達(dá)小反芻獸疫病毒h和f蛋白且無篩選標(biāo)簽的重組山羊痘病毒，命名為rgpv-pprv-h/f。

其中，優(yōu)選的，步驟(2)中ptk-p7.5-double-pprv-h/f及noti/apai酶切后的rgpv-na基因組的質(zhì)量比為1:3。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了按照所述的方法構(gòu)建得到的雙表達(dá)小反芻獸疫病毒h和f蛋白且無篩選標(biāo)簽的重組山羊痘病毒及其在制備預(yù)防或治療小反芻獸疫和山羊痘藥物中的用途。

山羊痘病毒gpv具有較強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)合特性，難以分散，使重組型病毒與野生型緊密相伴，又由于缺失了tk基因，親本毒的復(fù)制能力比重組型較強(qiáng)，進(jìn)一步給重組病毒的克隆純化帶來了更大的困難。山羊痘病毒為雙鏈dna病毒，其基因組dna沒有感染性，但是在禽痘的輔助下就能夠在體外成功拯救出病毒，這為重組痘病毒的改造和構(gòu)建提供了新的策略。為了提高重組痘病毒的構(gòu)建效率，本發(fā)明首先在gpv基因組中引入noti和apai這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，并通過這兩個(gè)酶切位點(diǎn)切斷基因組，這樣可以徹底避免親本毒被拯救出來，從而避免最繁瑣的純化工作。然后通過與含有同源臂的質(zhì)粒同源重組，將斷裂的gpv基因組連接起來，同時(shí)引入外源基因，從而實(shí)現(xiàn)重組病毒構(gòu)建的目的。這個(gè)策略與以前表達(dá)pprvh或f蛋白的重組山羊痘病毒研究相比較，只需要一步就能夠拯救出不含有親本毒的重組山羊痘病毒，節(jié)省了繁雜耗時(shí)的克隆、篩選和純化過程，大大節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間和勞力。此外，本發(fā)明建立的新型gpv重組系統(tǒng)獲得的重組病毒，不需要任何篩選標(biāo)簽(如egfp或gpt等)，避免了篩選標(biāo)簽對(duì)疫苗使用中可能存在的一些潛在不利影響，例如增加重組病毒的不必要的表達(dá)負(fù)擔(dān)，減少標(biāo)簽基因在自然界重組導(dǎo)致散播的風(fēng)險(xiǎn)等。

之前本發(fā)明發(fā)明人構(gòu)建了分別單表達(dá)pprvh或f蛋白的重組山羊痘病毒[chenw,hus,qul,huq,zhangq,zhih,etal.agoatpoxvirus-vectoredpeste-des-petits-ruminantsvaccineinduceslong-lastingneutralizationantibodytohighlevelsingoatsandsheep.vaccine.2010；28:4742-50.]，并且其他研究者也采用了該策略，這是由于目前的構(gòu)建策略的缺陷造成的，篩選基因占用了表達(dá)資源。雖然h或f單個(gè)抗原已經(jīng)能夠提供足夠的免疫效力，但是如果能夠同時(shí)表達(dá)兩個(gè)免疫原，那么將提供更全面的免疫保護(hù)，并且可以減少免疫劑量，減少成本。其中h能夠誘導(dǎo)較高的中和抗體而有利于免疫效力監(jiān)測(cè)，而f抗原能夠提供更高的病毒攻擊保護(hù)。因此，本發(fā)明利用前面建立的高效的無篩選標(biāo)記的羊痘病毒重組系統(tǒng)，嘗試構(gòu)建雙表達(dá)h和f的重組山羊痘病毒。為此，我們首先構(gòu)建雙p7.5啟動(dòng)子(背靠背連接)的重組質(zhì)粒。但是，在構(gòu)建psp72-tk-p7.5-h/f雙表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，嘗試將p7.5啟動(dòng)子背靠背直接連接在一起時(shí)，始終無法獲得穩(wěn)定的質(zhì)粒(結(jié)果未顯示)。因此，在這兩個(gè)啟動(dòng)子之間插入了pprv基因組中的一段序列(3298-4315)，最終將兩個(gè)啟動(dòng)子以背靠背的方式連接在一起。pprvh基因與f基因分別在p7.5啟動(dòng)子的作用下轉(zhuǎn)錄表達(dá)，可以達(dá)到該啟動(dòng)子的最大啟動(dòng)效率，而使用ires連接兩個(gè)基因時(shí)，ires后面的基因的表達(dá)效率降低幾倍，導(dǎo)致疫苗免疫效力的下降，這也是為什么傳統(tǒng)的采用篩選基因的系統(tǒng)一般不采用ires雙表達(dá)兩個(gè)抗原的原因。

由于pprv是oie規(guī)定的必須通報(bào)的烈性傳染病，強(qiáng)毒病原操作需要嚴(yán)格的生物安全設(shè)施，該病在我國作為新發(fā)傳染病，攻毒試驗(yàn)是不被允許的，因此采用中和抗體效價(jià)評(píng)價(jià)疫苗的免疫效力符合我國國情。oie也推薦采用中和抗體檢測(cè)為pprv疫苗保護(hù)效力評(píng)價(jià)指標(biāo)，中和抗體效價(jià)大于等于10則表明抗體轉(zhuǎn)陽。rgpv-pprv-h/f在第二次免疫免疫14天，所有羊的pprv中和抗體轉(zhuǎn)陽率即達(dá)到100％(10/10)，表明其具有良好的免疫效力。同時(shí)，gpv中和抗體效價(jià)轉(zhuǎn)陽率也達(dá)到100％，與之前報(bào)道的結(jié)果相似。綜合法國和我們的

綜上，本發(fā)明在世界范圍內(nèi)首先建立了無篩選標(biāo)簽的羊痘重組病毒構(gòu)建的方法，并在該方法的基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙表達(dá)pprvh和f蛋白的、無篩選標(biāo)簽的重組山羊痘病毒，研究結(jié)果表明，該無標(biāo)簽、雙表達(dá)的重組病毒能夠誘導(dǎo)比單抗原表達(dá)更全面的細(xì)胞和體液免疫，應(yīng)該具有對(duì)pprv強(qiáng)毒攻擊的完全免疫保護(hù)作用，可以同時(shí)預(yù)防ppr和羊痘兩種重大疫病，同時(shí)誘導(dǎo)的足夠高的中和抗體有利于免疫血清學(xué)監(jiān)測(cè)，因此該方法和重組疫苗都具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為ptk-na質(zhì)粒示意圖；

圖2為ptk-p7.5-4-5-double雙表達(dá)質(zhì)粒載體示意圖；

圖3為rgpv-na的鑒定；

a:rgpv-na感染lt細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，而gpv感染lt細(xì)胞顯示綠色熒光陰性(negativecontrol)；b:pcr鑒定外源基因插入，m為5000dnamarker，泳道1為以tk為引物、rgpv-na基因組為模板，泳道2為以tk為引物、gpv基因組為模板；c:泳道1為未酶切的rgpv-na基因組，泳道2為noti和apai雙酶切的rgpv-na基因組，m為lowrangepfgmarker；

圖4為rgpv-pprvh/f的pcr鑒定；

a：m為dnamarker，泳道1為pprvf基因特異引物鑒定gpv，泳道2為pprvf基因特異引物鑒定rgpv-pprvh/f，泳道3為pprvh基因特異引物鑒定gpv，泳道2為pprvh基因特異引物鑒定rgpv-pprvh/f；b：m為dnamarker，泳道5為tk特異引物鑒定gpv，泳道6為tk特異引物鑒定rgpv-pprvh/f；

圖5為免疫熒光檢測(cè)rgpv-pprv-h/f感染lt細(xì)胞表達(dá)pprvh蛋白和f蛋白。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1雙表達(dá)pprvh和f蛋白重組山羊痘病毒疫苗的構(gòu)建

1材料和方法

1.1病毒株與細(xì)胞

pprv弱毒疫苗株(nigeria/75/1)和gpv溫度敏感弱毒疫苗株(cvccav41)為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；原代羔羊睪丸細(xì)胞(lambtestis,lt)用1月齡公綿羊睪丸經(jīng)常規(guī)方法制備，采用含10％胎牛血清的mem培養(yǎng)；vero細(xì)胞用含有10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)。gpv或重組gpv的擴(kuò)增與滴定均采用含2％胎牛血清的mem和在lt細(xì)胞上進(jìn)行。pprv弱毒疫苗株(nigeria/75/1)的擴(kuò)增與滴定采用含2％胎牛血清的dmem在vero細(xì)胞上進(jìn)行。

1.2主要試劑與儀器

各種限制性內(nèi)切酶、phantadna聚合酶、同源重組酶購自vazyme公司，t4dna連接酶購自thermo公司；預(yù)染蛋白marker、dnamarker購自takara公司；ptk-gpt-ires-egfp質(zhì)粒[曲林茂,陳偉業(yè),胡倩倩,胡森,張倩,支海兵等.表達(dá)小反芻獸疫病毒f蛋白的重組山羊痘病毒疫苗的研究.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).2009；31:415-20.]由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；熒光倒置顯微鏡為zeiss公司產(chǎn)品，dmem、mem細(xì)胞培養(yǎng)基購自hyclone公司，胎牛血清購自excell公司,tritc和fitc分別標(biāo)記的羊抗鼠igg、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠igg都購自sigma公司；脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自invitrogen公司。

1.3質(zhì)粒構(gòu)建

以na-f和na-r為引物(表1)和質(zhì)粒ptk-gpt-ires-egfp為模板，采用高保真phantadna聚合酶擴(kuò)增gpt-ires-egfp序列，在兩端分別引入noti和apai酶切位點(diǎn)。以ptk-f和ptk-r為引物(表1)和ptk-gpt-ires-egfp為模板，采用高保真phantadna聚合酶擴(kuò)增包含質(zhì)粒和tk基因pcr片段，命名為ptk。用一步克隆試劑盒(onestepcloningkit，vazyme)將含有noti和apai酶切位點(diǎn)的gpt-ires-egfppcr片段和ptkpcr片段連接，獲得ptk-na質(zhì)粒(圖1)。

以tk-f和tk-r為引物(表1)，以血液/細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)提取的gpv基因組為模板，擴(kuò)增tk基因，并克隆至xhoi和ecori雙酶切的psp72質(zhì)粒，命名為psp72-tk。以p7.5-4-f和p7.5-4-r為引物(表1)、質(zhì)粒ptk-gpt-ires-egfp為模板pcr擴(kuò)增p7.5啟動(dòng)子片段，命名為p7.5-4；同時(shí)以psp72-tk-f和psp72-tk-r為引物(表1)，以psp72-tk質(zhì)粒為模板，pcr擴(kuò)增出psp72-tk片段；將psp72-tk片段和p7.5-4片段分別用nhei和saci雙酶切并連接，獲得質(zhì)粒psp72-tk-p7.5-4；以p7.5-interval-f和p7.5-interval-r為引物(表1)，以pprv基因組全長cdna克隆[huq,chenw,huangk,baronmd,buz.rescueofrecombinantpestedespetitsruminantsvirus:creationofagfp-expressingvirusandapplicationinrapidvirusneutralizationtest.vetres.2012；43:48.，申請(qǐng)?zhí)枮?01010559545.8，發(fā)明名稱為“小反芻獸疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用”的中國專利申請(qǐng)]為模板，擴(kuò)增用于隔開兩個(gè)p7.5啟動(dòng)子的間隔序列p7.5-interval(由于經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)嘗試，兩個(gè)p7.5啟動(dòng)子直接背靠背連接得不到穩(wěn)定的質(zhì)粒，因此插入間隔序列提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，數(shù)據(jù)未顯示)；以p7.5-5-f和p7.5-5-r為引物(表1)，質(zhì)粒ptk-gpt-ires-egfp為模板，pcr擴(kuò)增p7.5啟動(dòng)子片段，命名為p7.5-5；以psp72-tk-p7.5-4-f和psp72-tk-p7.5-4-r為引物，以質(zhì)粒psp72-tk-p7.5-4為模板，pcr擴(kuò)增出psp72-tk-p7.5-4片段；采用一步克隆法試劑盒(onestepcloningkit，vazyme)將以上p7.5-interval、p7.5-5和psp72-tk-p7.5-4連接到一起，獲得ptk-p7.5-4-5-double質(zhì)粒(圖2)；最后分別以f-double-f/f-double-r和h-double-f/h-double-r為引物，以pprv感染性克隆為模板，擴(kuò)增出的pprvf和pprvh片段分別以xbai/spei(其中spei需平滑化)和pmei/hindiii雙酶切，依次克隆至ptk-p7.5-4-5-double質(zhì)粒的xbai/saci(其中saci需平滑化)和smai/hindiii位點(diǎn)(其中spei和saci的平滑化采用takara公司的dnabluntingkit進(jìn)行處理)，最終獲得質(zhì)粒ptk-p7.5-double-pprv-h/f。

1.4插入na酶切位點(diǎn)的重組gpv的篩選和鑒定

lt細(xì)胞生長于6孔板中，至細(xì)胞長至密度80％左右，按0.1感染復(fù)數(shù)(moi)值接種gpv病毒液，37℃感作1h后，再根據(jù)脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑盒(invitrogen)的操作說明書轉(zhuǎn)染穿梭質(zhì)粒ptk-na。聯(lián)合gpt、gfp和噬斑克隆等篩選方法[chenw,hus,qul,huq,zhangq,zhih,etal.agoatpoxvirus-vectoredpeste-des-petits-ruminantsvaccineinduceslong-lastingneutralizationantibodytohighlevelsingoatsandsheep.vaccine.2010；28:4742-50.]，最終獲得純化的含有noti和apai的重組gpv，命名為rgpv-na。將rgpv-na在細(xì)胞工廠(鼎昊源dhs)中大量擴(kuò)增，收獲的細(xì)胞和培養(yǎng)上清液反復(fù)凍融3次；3000g高速離心20min后，棄沉淀，收獲的上清液經(jīng)90000g超速離心2h后，取沉淀并已發(fā)表參考文獻(xiàn)的方法[liuj,chenp,jiangy,wul,zengx,tiang,etal.aduckenteritisvirus-vectoredbivalentlivevaccineprovidesfastandcompleteprotectionagainsth5n1avianinfluenzavirusinfectioninducks.jvirol.2011；85:10989-98.]提取完整的病毒基因組。之后，以rgpv-na的基因組為模板，以tk-f和tk-r為引物[表1]為引物，進(jìn)行pcr鑒定外源基因的插入，同時(shí)設(shè)gpv為陰性對(duì)照。接著用noti和apai雙酶切上述純化的基因組，并純化酶切的病毒基因組，最后進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳電泳分析。

表1.引物設(shè)計(jì)

1.5rgpv-pprv-h/f病毒的拯救

lt細(xì)胞生長于6孔板中，至細(xì)胞長至密度80％左右，按感染復(fù)數(shù)(moi)為1值接種禽痘病毒，37℃感作1h后，根據(jù)脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑盒(invitrogen)的說明書轉(zhuǎn)染ptk-p7.5-double-pprv-h/f質(zhì)粒(1μg)及noti/apai酶切后的rgpv-na基因組(3μg)，同時(shí)設(shè)未酶切的rgpv-na基因組作為陽性對(duì)照，設(shè)酶切后的rgpv-na基因組作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后觀察綠色熒光蛋白表達(dá)及細(xì)胞病變(cytopathiceffect,cpe)。待試驗(yàn)孔出現(xiàn)cpe及綠色熒光噬斑時(shí)，同時(shí)陰性對(duì)照孔沒有綠色熒光噬斑時(shí)，收獲細(xì)胞及其培養(yǎng)上清，反復(fù)凍融3次，于-80℃保存，獲得的重組病毒命名為rgpv-pprv-h/f。

1.6重組病毒pcr鑒定

用血液/細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒提取rgpv-pprv-h/f基因組，分別用pprv-h引物和pprv-f引物通過pcr鑒定h及f基因的插入，以tk-f和tk-r為引物[表1]，通過pcr和測(cè)序鑒定插入序列，同時(shí)設(shè)親本毒為陰性對(duì)照。

1.7間接免疫熒光試驗(yàn)

參考之前發(fā)表文獻(xiàn)[chenw,hus,qul,huq,zhangq,zhih,etal.agoatpoxvirus-vectoredpeste-des-petits-ruminantsvaccineinduceslong-lastingneutralizationantibodytohighlevelsingoatsandsheep.vaccine.2010；28:4742-50.]中的方法進(jìn)行操作，即將rgpv-pprv-h/f感染lt細(xì)胞后，待cpe達(dá)到約20％時(shí)，分別以pprvh單抗[huq,chenw,huangk,baronmd,buz.rescueofrecombinantpestedespetitsruminantsvirus:creationofagfp-expressingvirusandapplicationinrapidvirusneutralizationtest.vetres.2012；43:48.]和鼠源pprvf多抗為一抗[曲林茂,陳偉業(yè),胡倩倩,胡森,張倩,支海兵,etal.表達(dá)小反芻獸疫病毒f蛋白的重組山羊痘病毒疫苗的研究.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).2009；31:415-20.]，綠色熒光素(fitc)標(biāo)記的山羊抗鼠igg為二抗進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，最后在熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8動(dòng)物免疫試驗(yàn)

選用15只6個(gè)月到1周歲綿羊，其小反芻獸疫和山羊痘病毒中和抗體都為陰性，隨機(jī)分為2組，其中第一組(1-10號(hào))經(jīng)皮內(nèi)注射途徑接種10⁴tcid50的rgpv-pprv-h/f，，第二組(11-15號(hào))接種gpv為陰性對(duì)照。首次免疫后第21天以相同劑量和相同免疫途徑進(jìn)行二次加強(qiáng)免疫。分別于免疫前及二次免疫后兩周采集靜脈血并分離血清，于56℃30min滅活后，進(jìn)行pprv和gpv中和抗體效價(jià)檢測(cè)。

1.9病毒中和試驗(yàn)

pprv中和試驗(yàn)和gpv中和試驗(yàn)分別參照之前發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行，中和抗體效價(jià)≥10判斷為陽性。

2.結(jié)果

2.1rgpv-na的鑒定

rgpv-na接種lt細(xì)胞5-8天后，顯示綠色熒光陽性，而只接種gpv的細(xì)胞，顯示綠色熒光陰性(圖3a)，表明rgpv-na能夠正確表達(dá)egfp。同時(shí)，采用針對(duì)tk同源臂的引物進(jìn)行pcr鑒定，結(jié)果顯示rgpv-na擴(kuò)增出的目的條帶為約3000bp，為tk同源臂與插入片段的總和，與預(yù)期相符(圖3b)，而gpv擴(kuò)增片段僅為tk基因序列(736bp)，無插入序列。同時(shí)測(cè)序結(jié)果也證明插入序列正確(數(shù)據(jù)未顯示)。rgpv-na基因組以noti和apai進(jìn)行雙酶切后的脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果顯示，未酶切的基因組大小為152kb(圖3c，泳道1)，雙酶切的基因組出現(xiàn)93kb和56kb兩條條帶(圖3c，泳道2)，與預(yù)期結(jié)果相符。綜上，成功構(gòu)建引入noti和apai兩個(gè)酶切位點(diǎn)的重組gpv。

2.2rgpv-pprvh/f的pcr鑒定

提取rgpv-pprvh/f和親病毒gpv的基因組dna，用特異擴(kuò)增pprv-h基因和f基因的引物鑒定插入的目的基因，同時(shí)以親本毒gpv作為對(duì)照。結(jié)果表明，rgpv-pprvh/f分別擴(kuò)出了1650bp(f基因，圖4a泳道2)和1839bp(h基因，圖4a泳道4)的條帶，而親本毒gpv都未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶(圖4a泳道1和3)。另外，為了鑒定h和f基因是否正確地插入tk基因中間，用tk-f和tk-r為引物進(jìn)行pcr，同時(shí)以親本毒gpv作為對(duì)照。結(jié)果顯示，rgpv-pprvh/f擴(kuò)增出5955bp(圖4b泳道6)的條帶，而親本毒gpv僅擴(kuò)增出736bp的tk基因序列(圖4b泳道5)，表明已經(jīng)成功構(gòu)建了插入pprvh和f基因的重組gpv，命名為rgpv-pprv-h/f。

2.3間接免疫熒光試驗(yàn)

為了驗(yàn)證rgpv-pprv-h/f是否能夠成功表達(dá)h和f蛋白，分別以鼠源pprvh單抗和鼠源pprvf多抗為一抗，以綠色熒光素(fitc)標(biāo)記的山羊抗鼠igg為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果表明，rgpv-pprv-h/f感染細(xì)胞分別與h單抗和f多抗發(fā)生綠色熒光陽性反應(yīng)，而親本毒gpv感染細(xì)胞和空白對(duì)照細(xì)胞則顯示綠色熒光陰性(圖5)，表明重組病毒能夠同時(shí)表達(dá)pprvh和f蛋白。

2.4病毒中和試驗(yàn)

以10⁴tcid50rgpv-pprv-h/f和gpv分別免疫綿羊。二免14天，rgpv-pprv-h/f免疫組所有的免疫綿羊的pprv中和抗體效價(jià)均轉(zhuǎn)陽(≥10)(表2)，所有免疫羊的gpv中和抗體也轉(zhuǎn)為陽性(≥10)(表2)。

表2重組病毒免疫后pprv特異性中和抗體檢測(cè)結(jié)果

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

<120>無需噬斑克隆和篩選標(biāo)簽的山羊痘病毒重組系統(tǒng)及雙表達(dá)pprvh/f蛋白疫苗的構(gòu)建

<130>klpi170047

<160>20

<170>patentin3.5

<210>1

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<210>2

<211>60

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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