本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體地涉及一種體外酶反應(yīng)生產(chǎn)l(+)-乙偶姻的方法。

背景技術(shù)：

乙偶姻，化學(xué)名為3-羥基-2-丁酮，又叫甲基乙酰甲醇，是一種無色或淡黃色液體，單體為無色或淡黃色液體，呈奶香氣，二聚體為白色結(jié)晶粉末，能自燃，易溶于水，溶于乙醇、丙二醇、微溶于乙醚，幾乎不溶于植物油。乙偶姻是常用的食品級香料，添加到食物中，提升食物中的奶香味。作為美國能源部優(yōu)先開發(fā)的平臺化合物之一，乙偶姻廣泛應(yīng)用于功能材料，醫(yī)藥生產(chǎn)和化學(xué)合成等領(lǐng)域。

目前，乙偶姻工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法是化學(xué)合成法，包括2,3-丁二醇的氧化、丁酮的氯化水解法和丁二酮的部分加氫等方法。這些生產(chǎn)工藝操作較簡便，但是能耗大，得率低且對環(huán)境有一定的污染。關(guān)鍵的問題是化學(xué)法制得的乙偶姻多為兩種手性異構(gòu)體的混合物。

近年來發(fā)展起來的利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)化學(xué)品成為熱點，尤其是結(jié)合合成生物學(xué)、代謝工程、進化工程等方法，乙偶姻也不例外。目前有許多研究者將目光轉(zhuǎn)向既經(jīng)濟又環(huán)保的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)手性乙偶姻。目前生產(chǎn)乙偶姻的菌株有大腸桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、谷氨酸棒桿菌等。利用微生物法合成乙偶姻的報道很多，產(chǎn)量較高，但微生物代謝復(fù)雜，體內(nèi)合成不易調(diào)控。xiao等^[1]利用新的全細(xì)胞催化技術(shù)，在大腸桿菌中共表達2，3-丁二醇脫氫酶和水合nadh(還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，又作還原型輔酶ⅰ)氧化酶，以2,3-丁二醇為底物，在實現(xiàn)nad⁺(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，又稱輔酶ⅰ)再生的情況下，實現(xiàn)手性乙偶姻的生產(chǎn)，最終，43g/l的meso-2,3丁二醇生成36.7g/ll(+)-乙偶姻，但此體系存在嚴(yán)重的底物抑制，meso-2,3-丁二醇濃度大于43g/l時，轉(zhuǎn)化率和乙偶姻產(chǎn)量迅速下降。

相比之下，體外酶反應(yīng)法可控，轉(zhuǎn)移性強，且對反應(yīng)條件的要求低，使此方法在重要化學(xué)品合成領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用潛力。通過無細(xì)胞的體外反應(yīng)，可以控制反應(yīng)體系各組分用量，精確的控制反應(yīng)。所以，一部分研究者將目光轉(zhuǎn)向?qū)⒓?xì)胞生長和代謝生產(chǎn)分來的無細(xì)胞體外酶反應(yīng)上。rieckenberg等^[2]利用甘油脫氫酶、丙二醇氧化還原同工酶、氫化酶ⅰ，成功的將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-丙二醇，轉(zhuǎn)化率幾乎接近于1，在3g/l的底物濃度下1,3-丙二醇的產(chǎn)量為0.24mmol，雖然轉(zhuǎn)化率很高，但存在底物抑制效應(yīng)，酶穩(wěn)定性低等問題，產(chǎn)率低。中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所發(fā)明了一種體外酶生產(chǎn)1,2,4-丁三醇，發(fā)明利用d-木糖酸脫水酶，2-丙酸脫羧酶和醇脫氫酶，以d-木糖酸為底物，生產(chǎn)1,2,4-丁三醇，體系放大到100ml,30℃，反應(yīng)24h后，產(chǎn)量達到了5.98g/l，但此發(fā)明利用粗酶液催化反應(yīng)，副產(chǎn)物多(咸漠，蔣昱東，劉煒等，一種體外酶反應(yīng)生成1，2，4-丁三醇的方法，申請?zhí)枺?01410682463.o)。jennifere.kay^[3]等在大腸桿菌中引入合成2,3-丁二醇的外源途徑，將工程菌株的細(xì)胞提取物中加入底物，atp和nad⁺，30h的補料分批培養(yǎng)，最終2,3-丁二醇的產(chǎn)率達到11.3gl^-1h^-1。這個研究首次引進外源途徑并證明了細(xì)胞提取物有輔因子再生的能力，進一步證明了細(xì)胞提取物即無細(xì)胞代謝工程能夠高效實現(xiàn)小分子轉(zhuǎn)化，克服生物轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)量低，細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì)限制工業(yè)生產(chǎn)等困難。但是此反應(yīng)的副產(chǎn)物多，影響下游的分離。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種體外酶反應(yīng)生產(chǎn)l(+)-乙偶姻的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種體外酶反應(yīng)生產(chǎn)l(+)-乙偶姻的方法，包括如下步驟：

(1)將蛋白質(zhì)表達載體pet28a與2,3-丁二醇脫氫酶編碼基因bdha連接得到質(zhì)粒pet28a-bdha，將所述質(zhì)粒pet28a-bdha導(dǎo)入大腸桿菌escherichiacolibl21(de3)中得到菌株bl21-1，對菌株bl21-1培養(yǎng)發(fā)酵表達2,3-丁二醇脫氫酶，純化，濃縮，得到2,3-丁二醇脫氫酶濃縮液；將蛋白質(zhì)表達載體pet28a與nadh氧化酶編碼基因yodc連接得到質(zhì)粒pet28a-yodc，將所述質(zhì)粒pet28a-yodc導(dǎo)入大腸桿菌escherichiacolibl21(de3)中得到菌株bl21-2，對菌株bl21-2培養(yǎng)發(fā)酵表達nadh氧化酶，純化，濃縮，得到nadh氧化酶濃縮液；

(2)將2,3-丁二醇脫氫酶濃縮液、nadh氧化酶濃縮液、meso-2,3丁二醇、nad⁺和fad⁺混合均勻，反應(yīng)，得到l(+)-乙偶姻。

本發(fā)明的方法，能夠以較為廉價的meso-2,3-丁二醇為底物，實現(xiàn)附加值較高的l(+)-乙偶姻的體外生產(chǎn)，產(chǎn)量為6.35g/l，且手性純度達95％。雙酶體系的核心成分為2，3-丁二醇脫氫酶和nadh氧化酶，通過兩種酶的合理搭配，實現(xiàn)了輔因子nad⁺的有效再生以及l(fā)(+)-乙偶姻的生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為構(gòu)建的pet28a-bdha質(zhì)粒載體的圖譜。

圖2為構(gòu)建的pet28a-yodc質(zhì)粒載體的圖譜。

圖3為2,3-丁二醇脫氫酶和nadh氧化酶的sds-page電泳膠圖。

圖4為手性乙偶姻的氣相色譜檢測，其中，a為兩種手性乙偶姻的混合物在氣相色譜中的峰圖；b為反應(yīng)樣在氣相色譜中的峰圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施實例對本發(fā)明做進一步說明，下述實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好的理解本發(fā)明，但對本發(fā)明不作任何限制。

本發(fā)明所選用的2,3-丁二醇脫氫酶編碼基因bdha，genebank登陸號為939490。由其編碼的2,3-丁二醇脫氫酶，可催化meso-2,3-丁二醇生成l(+)-乙偶姻同時有輔因子nad⁺的參與，其反應(yīng)式為：

本發(fā)明所選用的nadh氧化酶編碼基因yodc，genebank登陸號939506。由其編碼的水合nadh氧化酶，可催化氧氣生成水，同時有輔因子nadh的參與，其反應(yīng)式為：

原始質(zhì)粒pet28a來源為biovector(http://www.biovector.net/)；

原始菌株b.subtilis168來源為bgsc(bacillusgeneticstockcenter，http://www.bgsc.org/)；

e.colibl21(de3)感受態(tài)來源為neb(http://www.neb-china.com/)；

所用meso-2,3-丁二醇和乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品從sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)購買。

所用限制性內(nèi)切酶、去磷酸化酶、dna連接酶等、分子生物學(xué)試劑從thermo公司購買(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。

所用其他生化試劑(如胰蛋白胨，酵母抽提物，nacl，hepes，tris，咪唑、nad⁺、fad⁺等)從生工生物工程(上海)股份有限公司購買(http://www.sangon.com/)。

實施例1使用商業(yè)化蛋白質(zhì)表達載體pet28a過表達2,3-丁二醇脫氫酶(bdha)

以枯草芽孢桿菌b.subtilis168基因組為模板，以引物p-bdha1和p-bdha2用于擴增基因bdha片段(約1.0kp)。將bdha片段和pet28a質(zhì)粒使用thermofastdigestnhei/bamhi雙酶切，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后得到bdha基因的表達載體pet28a-bdha(見圖1),測序檢測無誤。將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒通過傳統(tǒng)氯化鈣法轉(zhuǎn)入商業(yè)化感受態(tài)大腸桿菌e.colibl21(de3)，得到2,3-丁二醇脫氫酶(bdha)過表達的bl21-1。

實施例2使用商業(yè)化蛋白質(zhì)表達載體pet28a過表達nadh氧化酶(yodc)

以枯草芽孢桿菌b.subtilis168基因組為模板，以引物p-yodc1和p-yodc2用于擴增基因yodc片段(609bp)。然后將yodc片段和pet28a質(zhì)粒使用thermofastdigestndei/xhoi雙酶切，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后得到y(tǒng)odc基因的表達載體pet28a-yodc(見圖2),測序檢測無誤。將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒通過傳統(tǒng)氯化鈣法轉(zhuǎn)入商業(yè)化感受態(tài)大腸桿菌e.colibl21(de3)中，得到nadh氧化酶(yodc)過表達的bl21-2。

表1菌株構(gòu)建所用引物序列

實施例32,3-丁二醇脫氫酶和nadh氧化酶的純化濃縮

1、2,3-丁二醇脫氫酶的純化濃縮具體步驟為：

1)將大腸桿菌bl21-1接種到400mllb培養(yǎng)基中，搖床37℃，220rpm培養(yǎng)至od600為0.6，加入誘導(dǎo)劑iptg至終濃度為0.5mm，16℃培養(yǎng)12h，4℃，4200rpm離心20min收集菌體，并用20mlbuffera懸浮。

2)收集步驟1)得到的bl21-1的懸浮液，在高壓細(xì)胞破碎機的作用下破碎細(xì)胞，在4℃，1200bar，油壓18kg/cm³條件下處理3次，破碎后4℃，8000rpm離心30min，收集上清得到粗酶液。

3)將步驟2)中得到的粗酶液，利用重力鎳柱純化方法，純化蛋白。在4℃條件下，將粗酶液全部流穿裝有鎳填料的柱子，再用buffera和bufferb配制的不同的咪唑濃度(20mm，50mm，100mm，150mm，200mm，250mm，500mm)的洗脫液洗脫，收集流出液，得到高純度的2,3-丁二醇脫氫酶溶液。

4)收集步驟3)得到的目的蛋白溶液，利用孔徑10kd的超濾管濃縮蛋白。將收集的流出液，在4800rpm，4℃離心。最后用5mlhepes-nacl緩沖液洗滌2次，繼續(xù)離心至剩余量為2ml，分裝。得到高濃度的2，3-丁二醇脫氫酶溶液。再利用bradford法^[4]測定2,3-丁二醇脫氫酶濃度，其終濃度為：18.6mg/ml。

5)將步驟4)得到的2,3-丁二醇脫氫酶溶液進行sds-page電泳，確認(rèn)2,3-丁二醇脫氫酶大小正確(見圖3，泳道1，m:marker；1:2,3-丁二醇脫氫酶(40.6kda))

2、nadh氧化酶的純化濃縮具體步驟為：

1)將大腸桿菌bl21-2接種到400mllb培養(yǎng)基中，搖床37℃，220rpm培養(yǎng)至od600為0.6，加入誘導(dǎo)劑iptg至終濃度為0.5mm，16℃培養(yǎng)12h，4℃，4200rpm離心20min收集菌體，并用20mlbuffera懸浮。

2)收集步驟1)得到的bl21-2懸浮液，在高壓細(xì)胞破碎機的作用下破碎細(xì)胞，在4℃，1200bar，油壓18kg/cm³條件下處理3次，破碎后4℃，8000rpm離心30min，收集上清得到粗酶液。

3)將步驟2)中得到的粗酶液，利用重力鎳柱純化方法，純化蛋白。在4℃條件下，將粗酶液全部流穿裝有鎳填料的柱子，再用buffera和bufferb配置的不同的咪唑濃度(20mm，50mm，100mm，150mm，200mm，250mm，500mm)的洗脫液洗脫，收集流出液，得到高純度的nadh氧化酶溶液。

4)收集步驟3)得到的目的蛋白溶液，利用超濾管濃縮蛋白。將收集的流出液，在4800rpm，4℃離心。最后用5mlhepes-nacl緩沖液洗滌2次，繼續(xù)離心至剩余量為2ml，分裝，得到高濃度的2，3-丁二醇脫氫酶溶液。再利用bradford法測定nadh氧化酶濃度，其終濃度為：13.6mg/ml。

5)將步驟4)得到的nadh氧化酶溶液進行sds-page電泳，確認(rèn)nadh氧化酶大小正確(見圖3，泳道2，m:marker；2:nadh氧化酶(24.4kda))

lb培養(yǎng)基配方為：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母抽提物，10g/lnacl，調(diào)節(jié)ph至7.5。0.1mpa壓力下滅菌20min。

hepes-naclbuffer配方為：20mmhepes(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)，50mmnacl，調(diào)節(jié)ph至7.5。

buffera配方為：25mmtris，150mmnacl，20mm咪唑，調(diào)節(jié)ph至7.5。

bufferb配方為：25mmtris，150mmnacl，500mm咪唑，調(diào)節(jié)ph至7.5。

實施例42,3-丁二醇脫氫酶和nadh氧化酶比酶活的測定

1.2,3-丁二醇脫氫酶的比酶活測定，具體步驟為：2，3丁二醇的脫氫反應(yīng)在37℃下進行，通過測定340nm下nadh的增加量，即nad⁺的還原量，來表征2，3丁二醇脫氫酶的酶活。反應(yīng)體系組分：0.5mmeso-2,3-丁二醇，10mmnad⁺，0.1mg/ml2,3-丁二醇脫氫酶,hepes-naclbuffer補齊至200μl。1u2,3-丁二醇脫氫酶定義為每分鐘1μmolnad⁺轉(zhuǎn)化為nadh所需的酶量。結(jié)果測得2,3-丁二醇脫氫酶的比酶活為0.312u/mg。

2.nadh氧化酶的比酶活測定，具體步驟為：nadh的氧化反應(yīng)在37℃下進行，通過測定340nm下nadh的減少量，來表征nadh氧化酶的酶活。反應(yīng)體系組分：10mmnad⁺，0.1mg/mlnadh氧化酶,hepes-naclbuffer補齊至200μl。1unadh氧化酶定義為每分鐘1μmolnadh轉(zhuǎn)化為nad⁺所需的酶量。結(jié)果測得nadh氧化酶的比酶活為0.415u/mg。

實施例5體外雙酶體系生產(chǎn)手性乙偶姻

利用2,3-丁二醇脫氫酶和nadh氧化酶所催化的兩個反應(yīng)的耦合，設(shè)計出體外酶反應(yīng)體系生產(chǎn)l(+)-乙偶姻。其具體參數(shù)如表2所示,在30℃、500rpm條件下反應(yīng)12h后終止反應(yīng)。

表2.反應(yīng)體系

注：hepes-naclbufferph＝8.5配方為：100mmhepes，50mmnacl，調(diào)節(jié)ph至8.5。

使用gc-fid檢測乙偶姻的手性純度，使用手性柱hp-chiral20bcolumn(agilenttechnologies)。手性l(+)-乙偶姻的色譜檢測見圖4，其中，a圖為兩種手性乙偶姻的混合物的峰圖(依次為d-(-)-乙偶姻，l-(+)-乙偶姻)；b圖為反應(yīng)樣的檢測峰圖。

從發(fā)酵結(jié)果可以看出，乙偶姻的總產(chǎn)量為6.35g/l，手性l(+)-乙偶姻純度為95％，本發(fā)明所構(gòu)建的體外雙酶反應(yīng)體系能夠?qū)崿F(xiàn)體外手性乙偶姻的生產(chǎn)和輔因子的再生，手性純度較高，具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻：

[1]xiao,z.,etal.,anovelwhole-cellbiocatalystwithnad⁺regenerationforproductionofchiralchemicals.plosone,2010.5(1):p.e8860.

[2]rieckenberg,f.,etal.,cell-freesynthesisof1,3-propanediolfromglycerolwithahighyield.engineeringinlifesciences,2014.14(4):p.380-386.

[3]kay,j.e.andm.c.jewett,lysateofengineeredescherichiacolisupportshigh-levelconversionofglucoseto2,3-butanediol.metabolicengineering,2015.32:p.133-142.

[4]bradford,m.m.,arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.analyticalbiochemistry,1976.72(1-2):p.248-254.

sequencelisting

<110>天津大學(xué)

<120>一種體外酶反應(yīng)生產(chǎn)l（+）-乙偶姻的方法

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

cgcggatccttagttaggtctaacaagg28

<210>2

<211>36

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

ctacgggctagcatgaaggcagcaagatggcataac36

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

tatccatatgatgacgaatactctggatg29

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

ccgctcgagttacagccaagttgatac27