專利名稱：一種ev71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種酶聯(lián)診斷試劑盒及其用途，具體說，是涉及一種EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒，屬于醫(yī)學、生物技術領域。
背景技術：
腸道病毒71型(英文名為Human enterovirus 71),簡稱EV71 :EV71病毒屬于小RNA病毒科，病毒顆粒為典型的正二十面體結構。由于EV71引起的手足口病(hand - footand mouth disease ;HFMD)影響范圍的廣泛性、危害的嚴重性,該病在中國已納入丙類傳染病管理。鑒于此，世界各國學者、生物公司正致力于EV71病毒疫苗的研究。EV71病毒屬于小RNA病毒科，病毒顆粒為典型的正二十面體結構。其基因組為單股正鏈RNA,長度約為7，408個核苷酸,編碼開放讀碼框(open-reading frame, 0RF)。EV71基因組編碼的多聚蛋白(polyprotein)約含2，193個氨基酸,該多聚蛋白可進一步被水解成Pl、P2、P3三個前體蛋白(圖I)。經(jīng)過進一步的剪切，Pl前體蛋白可以進一步成熟為VP1、VP2、VP3和VP4四個病毒結構蛋白，負責病毒顆粒的裝配和穩(wěn)定；P2前體蛋白則進一步成熟為非結構蛋白(non-structural protein, nsp)2A(特異性蛋白酶)、2B和2C ；P3前體蛋白則用以形成非結構蛋白3A、3B (VPg，5’末端結合蛋白)、3C (特異性蛋白酶)和 3D(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)。腸病毒的流行與季節(jié)轉(zhuǎn)換、環(huán)境變異有著極大的關聯(lián)性，腸病毒只在夏季及初秋流行，每年六 九月為高峰期，氣溫過低的地區(qū)并不利于腸病毒生存。根據(jù)流行病學調(diào)查，腸病毒之傳染途徑主為糞一口傳染(stool - oral)，感染腸病毒的患者會經(jīng)由糞便排出病毒，這些含有高濃度腸病毒的糞便會污染環(huán)境甚至地下水源，在公共衛(wèi)生條件不佳的地區(qū)，極易經(jīng)由污染的水源而散播該病毒。EV71對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)有極高的感染性，故臨床上出現(xiàn)之癥狀包括腦炎(encephalitis)、無菌性腦膜炎(aseptic meningitis)、急性無力肢體麻痹(acute flaccid paralysis)、手足口癥(hand - foot - mouth disease)、泡疫性咽峽炎(herpangina)、急性出血性結膜炎(acute hemorrhagic conjuctivitis)、肌肉僵直(myoclonic jerk)、頭痛(headache)、發(fā)燒(fever)及嘔吐(vomoting)等，而其中以手足口癥及泡疹性咽峽炎最為常見。一般而言，感染腸病毒多為無癥狀(約50 80%)或出現(xiàn)輕微類似感冒的癥狀，病人會自然痊愈而產(chǎn)生抗體，但因感染腸病毒且轉(zhuǎn)成重癥之患者卻有極高的機率死于心肺衰竭及廣泛性的腦干傷害，實不容小覷。加強對EV71型感染病患的防控工作，已成為我國病毒性傳染病管理工作的目標之一。而相關疫苗的研究開發(fā)和病毒抗原的快速檢測試劑盒是預防控制此傳染病的關鍵。在EV71病毒所編碼的四個結構蛋白中，VP1、VP2和VP3主要用來形成包裝病毒顆粒的衣殼(capsid)，而VP4則被包埋在病毒衣殼的內(nèi)部，負責與核心(core)相互作用，用以穩(wěn)定病毒的基因組，因此VP1、VP2和VP3形成了 EV71病毒的主要抗原決定簇，其中又以VPl的抗原性最強，而成為目前抗體研究與設計開發(fā)的主要靶點。同時，研究表明腸道病毒存在著眾多的型內(nèi)、型間的交叉反應性，并且存在著較高的重組性。其中EV71與Cox A16的相似性達到了 80%，擁有很多共同表位，許多克隆抗體EV71的單抗具有了與Cox A16的交叉反應性。成為EV71抗原檢測方法建立的一項制約。常規(guī)的針對EV71病毒的診斷方法主要通過分離病毒，中和抗體檢測和免疫組織化學法來進行。但這些方法費時、費力，無法滿足疾病流行期間同時大量處理大量標本的需要。同時，鑒于EV7·1病毒的危害性,有必要開發(fā)一種簡單快速易行的檢測EV71病毒抗原表位含量的檢測方法。該研究使用的特異性識別EV71病毒Vpl中保守區(qū)域基因的單克隆抗體具有高效的EV71病毒的中和效果，同時與Cox A16交叉反應性，有效避免了抗原檢測中與EV71 80%相似性的Cox A16的假陽性干擾。因此，所述方法的成功開發(fā)對于疫苗的研發(fā)中抗原表位這一有效組分的檢測有著重要的意義，同時該方法也為EV71疾病的防治、早期篩查、診斷工作提供了準確、簡便、有效的監(jiān)測手段，具有廣泛的應用范圍和社會需求。

實用新型內(nèi)容針對現(xiàn)有技術存在的上述問題，本實用新型的目的是提供一種EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒。為實現(xiàn)上述實用新型目的，本實用新型采用的技術方案如下一種EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)置有7個下凹瓶位，7瓶設有密封蓋的試劑瓶、一塊多孔酶聯(lián)板及一張封板膜，其中所述的7個下凹瓶位內(nèi)分別相應放置裝有陽性參考品、陰性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個底面封閉且頂面敞口的微反應孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體。作為一種優(yōu)選方案，所述的抗EV71抗體為特異性識別EV71病毒Vpl中保守區(qū)域基因的單克隆抗體或其保守性突變體或活性片段，且可被生物標記或化學標記的；所述陽性對照品為EV71抗原對照品；所述陰性對照品為陰性血清；所述的標記是辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶、堿性磷酸酶標記或葡萄糖氧化酶標記或是熒光素、生物素、膠體金離子標記的。作為進一步優(yōu)選方案，所述下凹瓶位可由塑料或紙板制成。作為進一步優(yōu)選方案，所述多孔酶聯(lián)板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板相鄰；且所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板的大小一致。作為進一步優(yōu)選方案，所述多孔酶聯(lián)板包括支撐架，及放置在支撐架之上的數(shù)條可拆卸的微孔反應板條，每條微孔反應條上設有數(shù)個可拆卸的微反應孔。作為進一步優(yōu)選方案，所述多孔酶聯(lián)板上共設有96個微反應孔，且所述多孔酶聯(lián)板外設有封套。作為更進一步優(yōu)選方案，所述樣品稀釋液通過在牛血潰白蛋白IOg加入0.01 MPBS IOOOml和混合生物素防腐劑O. 5ml即得；所述濃縮洗液為取NaH2PO4. 2H20 2. 96g、Na2HPO4. 12H20 29. 0g、NaCl 234g 和 Tween-20 20ml 加純化水至 1000ml 即得；所述終止液為取濃硫酸112ml加入純化水888ml即得；所述顯色液A為取醋酸鈉27. 2g、檸檬酸3.2g、30%H2020. 6ml加入雙蒸水至IOOOml即得；所述顯色液B為取ΤΜΒ0. 4g,EDTA-Na2O. 4g、檸檬酸I. 9g、甘油IOOml加入雙蒸水至IOOOmlo[0020]本實用新型提供的EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒具有較好的特異性，尤其是對于Cox A16無交叉反應性；雙人對于EV71純化前、后的樣品進行抗原含量重復檢測，兩人的變異系數(shù)〈10%，重復性良好；3次的線牲相關系數(shù)均>0. 99，線性較好；對于EV71病毒純化前后的樣品、鋁佐劑吸附EV71樣品均能較好的檢測。采用本實用新型提供的試劑盒，可快速、準確有效地的對手足口病感染患者進行EV71檢測，從而為EV71病毒感染診斷和預防提供了一種新的途徑，因此具有十分廣闊的應用前景。

圖I為本實用新型提供的EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒的結構示意圖；圖2為本實用新型提供的EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒中的96孔酶聯(lián)版的結構示意圖。
具體實施方式
以下結合具體實施例，進一步闡明本實用新型。應理解，下述實施例僅用于說明本·實用新型而不用于限制本實用新型的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。
以下結合附圖及其實施例對本實用新型進一步詳細說明
實施例如圖I和圖2所示，本實用新型提供的一種EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒，包括盒體(1)，盒體內(nèi)置有7個下凹瓶位(2)，7瓶設有密封蓋的試劑瓶組(3)、一塊多孔酶聯(lián)板
(4)及一張封板膜(5)，其中所述的7個下凹瓶位內(nèi)分別相應放置裝有陽性參考品(31)、陰性參考品(32)、樣品稀釋液(33)、濃縮洗液(34)、顯色液A (35),顯色液B (36)和終止液
(36)各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個底面封閉且頂面敞口的微反應孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體；所述多孔酶聯(lián)板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板相鄰；且所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板的大小一致；所述多孔酶聯(lián)板包括支撐架(41)，及放置在支撐架之上的數(shù)條可拆卸的微孔反應板條(42 )，每條微孔反應條上設有數(shù)個可拆卸的微反應孔(43);所述多孔酶聯(lián)板上共設有96個微反應孔，且所述多孔酶聯(lián)板外設有封套(6)。試劑盒中的多孔酶聯(lián)板及試劑的制備(I)抗原參考品的制備；(2)單克隆抗體的制備；(3)抗EV71單抗包被板的制備；(4)酶標抗體的制備；(5)樣品稀釋液、濃縮洗液、終止液的配置；(6)顯色液的配置；其中，所述的EV71抗原檢測方法是雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法；(I)所述的抗原參考品制備方法如下將通過基因工程方法制備的EV71病毒Vpl純化液配制為含有抗原的溶液，然后向該溶液添加牛血清白蛋白作為保護劑。對其進行分裝，即制得EV71抗原參考品；(2)所述的單克隆抗體制備方法如下①采用制備的EV71純化液免疫小鼠.效價測定后，采用效價最高的小鼠取脾臟細胞與骨髓瘤細胞按比例進行融合，在培養(yǎng)液上培養(yǎng)融合雜交的瘤細胞；②進行三次亞克隆，每次亞克隆時，檢測各細胞孔的效價，對于OD值大于O. 6的孔的細胞進行克隆化，獲得高效價的針對不同位點的單克隆抗體的細胞株；③通過對獲得的細胞株進行大規(guī)模培養(yǎng)，并將培養(yǎng)后的細胞注射到小鼠腹腔，制備抗EV71單克隆抗體腹水，即得所述的單克隆抗體；(3)所述的抗EV71單抗包被板的制備方法如下 使用制備的純化的抗EV71克單隆抗體作為包被抗體，以最佳包被抗體濃度加于酶標板反應孔內(nèi)，并于低溫下放置。棄去包被液，用洗液洗板多次，拍干；加入封閉液于孔中，封閉，棄去封閉液，拍干，干燥，真空封裝，最后將封裝后的包被板于低溫下保存；(4)所述的酶標抗體的制備方法如下；將獲得的純化抗EV71單克隆抗體BE2采用過碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化物酶(HRP )，標記后加等體積甘油分裝，-20 V放置。其中所述的酶標抗體使用前采用方陣滴定法確定最適工作濃度；(5)所述的樣品稀釋液、濃縮洗液、終止液配置方法如下I)樣品稀釋液取牛血潰白蛋白10g，加入O. 01 M PBS 1000ml，混合生物素防腐劑O. 5ml即得樣
品稀釋液。2)濃縮洗液取NaH2PO4. 2H20 2. 96g,Na2HPO4. 12H20 29. 0g,NaCl 234g 和 Tween-20 20ml 加純化水至1000ml即得。3)終止液取濃硫酸112ml加入純化水888ml即得。(6)所述的顯色液配置方法如下I)顯色液A取醋酸鈉27. 2g、檸檬酸3. 2g、30%H2020. 6ml加入雙蒸水至IOOOml即得。2)顯色液B取ΤΜΒ0. 4g、EDTA-Na2O. 4g、檸檬酸 I. 9g、甘油 IOOml 加入雙蒸水至 1000ml。實施例2 EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒的使用本發(fā)明所述的檢測方法是通過ELISA方法來實現(xiàn)的；本發(fā)明的試劑盒或?qū)嶋H是通過ELISA進行對EV71抗原進行定量的。EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒的檢測操作程序如下A.定性檢測(I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做高倍數(shù)稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，加檢樣品、陽性對照；(3)恒溫水浴箱避光孵育，用洗液洗滌，拍干；(4)將標記抗體用加入各反應孔；[0065]( 5 )恒溫水浴箱避光孵育；(6)用洗滌液洗滌，拍干；(7)加入顯色液A于孔中，再加入顯色液B，震蕩將其混勻；(8)恒溫水浴箱避光孵育；(9)滴加終止液于孔中，震蕩混勻；(10)用酶標儀于450nm波長下讀數(shù)；(11)結果判定；Cut off值=2 · I X N (N為陰性對照平均A值) a陰性對照平均A值應小于O. 3，否則實驗不成立。b標本A值小于Cut off值為陰性，大于等于Cut off值為陽性。定量檢測( I)將濃縮洗滌液用蒸餾水做高倍數(shù)稀釋；(2)取出包被有抗EV71抗體的微孔板孔板，平衡至室溫，將抗原標準品稀釋為不同年度，每稀釋度各加一孔；(3)加待檢樣品、標準品、樣品；(4)恒溫水浴箱避光孵育，用洗液洗滌，拍干；( 5 )將標記抗體用加入各反應孔；(6)恒溫水浴箱避光孵育；(7)用洗滌液洗滌，拍干；(8)加入顯色液A、顯色液B，震蕩將其混勻；(9)恒溫水浴箱避光孵育；(10)滴加終止液，震蕩混勻；(11)用酶標儀于450nm波長下讀數(shù)；(12)結果判定；Cut off值=2 . I X N (N為陰性對照平均A值)a陰性對照平均A值應小于O. 3，否則實驗不成立。b采用直線回歸法計算樣品抗原滴度，R2值應大于O. 97。組裝所得的EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒的特異性及靈敏度、線性和線性范圍檢測采用現(xiàn)有技術的常規(guī)方法，具體結果如下A.特異性特異性評價組裝的EV71病毒ELISA檢測試劑盒用于檢測腸道病毒以及其它病毒，結果表明該試劑盒的特異性很高。結果表明該檢測試劑盒的特異性高，與HSV、腺病毒、RSV、麻疹病毒、HAV等多種病毒沒有交叉。、靈敏度、線性、線性范圍靈敏度檢測的Vpl范圍5ng 1000ng/ml。病毒定量檢測(原液TCID50=107/100ul)培養(yǎng)的EV71病毒原液檢測的TCID50為107/100ul，可以檢測100倍稀釋的培養(yǎng)病
毒上清。[0099]本實用新型提供的EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒具有較好的特異性，尤其是對于Cox A16無交叉反應性；雙人對于EV71純化前、后的樣品進行抗原含量重復檢測，兩人的變異系數(shù)〈10%，重復性良好；3次的線牲相關系數(shù)均>0. 99，線性較好；對于EV71病毒純化前后的樣品、鋁佐劑吸附EV71樣品均能較好的檢測。最后有必要在此說明的是以上實施例只用于對本實用新型的技術方案作進一步詳細地說明，不能理解為對本實用新型保護范圍的限制，本領域的技術人員根據(jù)本實用新型的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整均屬于本實用新型的保護范圍。
權利要求1.一種EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒，其特征在于它包括盒體，盒體內(nèi)置有7個下凹瓶位，7瓶設有密封蓋的試劑瓶、一塊多孔酶聯(lián)板及一張封板膜，其中所述的7個下凹瓶位內(nèi)分別相應放置裝有陽性參考品、陰性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個底面封閉且頂面敞口的微反應孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體。
2.根據(jù)權利要求I所述的EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒，其特征在于所述的抗EV71抗體為特異性識別EV71病毒Vpl中保守區(qū)域基因的單克隆抗體或其保守性突變體或活性片段，且可被生物標記或化學標記的； 所述陽性對照品為EV71抗原對照品； 所述陰性對照品為陰性血清； 所述的標記是辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶、堿性磷酸酶標記或葡萄糖氧化酶標記或是熒光素、生物素、膠體金離子標記的。
3.根據(jù)權利要求I所述的EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒，其特征在于所述下凹瓶位可由塑料或紙板制成。
4.根據(jù)權利要求I所述的EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒，其特征在于所述多孔酶聯(lián)板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板相鄰；且所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板的大小一致。
5.根據(jù)權利要求4所述的EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒，其特征在于所述多孔酶聯(lián)板包括支撐架，及放置在支撐架之上的數(shù)條可拆卸的微孔反應板條，每條微孔反應條上設有數(shù)個可拆卸的微反應孔。
6.根據(jù)權利要求4所述的EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒，其特征在于所述多孔酶聯(lián)板上共設有96個微反應孔，且所述多孔酶聯(lián)板外設有封套。
專利摘要本實用新型公開了一種EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)置有7個下凹瓶位，7瓶設有密封蓋的試劑瓶、一塊多孔酶聯(lián)板及一張封板膜，其中所述的7個下凹瓶位內(nèi)分別相應放置裝有陽性參考品、陰性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個底面封閉且頂面敞口的微反應孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體。本實用新型提供的EV71抗原酶聯(lián)反應檢測試劑盒具有較好的特異性，尤其是對于CoxA16無交叉反應性；雙人對于EV71純化前、后的樣品進行抗原含量重復檢測，重復性良好，線性較好；對于EV71病毒純化前后的樣品、鋁佐劑吸附EV71樣品均能較好的檢測。
文檔編號G01N33/543GK202735348SQ20122037619
公開日2013年2月13日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權日2012年7月31日
發(fā)明者史晉, 吳克, 劉昊智, 鮑路偉, 王文灝, 程超, 張愛暉 申請人:上海博沃生物科技有限公司