專利名稱:在酮酸存在下的酶促反應(yīng)的制作方法
在酮酸存在下的酶促反應(yīng)
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及在特定的反應(yīng)增強(qiáng)化合物的存在下X-Gly至χ-α -羥基-Gly或 X-NH2 (X是具有甘氨酸基團(tuán)可以與其共價(jià)附著的羰基的肽或任何化合物)的酶促轉(zhuǎn)化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這些反應(yīng)增強(qiáng)化合物是酮酸(或其鹽或酯)，它們可以有利地替代過氧化氫酶使用，所述過氧化氫酶是現(xiàn)有技術(shù)這些類型酶促反應(yīng)，例如酰胺化反應(yīng)的一般組分。
相關(guān)領(lǐng)域的描述
眾多人激素、生長因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)衍生的脂肪酸和其他重要的生物學(xué)化合物具有氨基酸或肽作為其分子結(jié)構(gòu)的基本部分。許多疾病對(duì)患者中的這些生物學(xué)化合物的水平升高呈陽性應(yīng)答?？梢砸远喾N方式給患者施用治療上有效量的此類生物學(xué)相關(guān)化合物。因此，關(guān)于此類化合物的有效的、劃算的制造方法是非常重要的。當(dāng)生物學(xué)化合物以適合于經(jīng)口遞送的劑量形式制備時(shí)，這是特別正確的，所述經(jīng)口遞送的劑量形式是通常優(yōu)選的施用方式，盡管相對(duì)于其他施用方式生物利用率較低。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞和其他真核生物可以執(zhí)行特定的翻譯后加工操作，而原核生物則不能。某些原核生物，例如大腸桿菌(E. coli)廣泛用作宿主用于經(jīng)由重組DNA (rDNA)技術(shù)生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，因?yàn)樗鼈兛梢院苋菀自诜峙l(fā)酵方法中生長，且因?yàn)樗鼈冊(cè)谶z傳上是充分表征的。然而，許多哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)需要一定類型的翻譯后加工。如果這些蛋白質(zhì)由例如大腸桿菌基因工程產(chǎn)生，那么翻譯后加工通常必須使用復(fù)雜的、體外化學(xué)操作來完成， 這對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用是成本高昂的。即使當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主重組生產(chǎn)肽時(shí)，通常也需要有效生產(chǎn)只在稍后對(duì)其實(shí)施進(jìn)一步修飾的前體。
一種類型的此類進(jìn)一步加工活性涉及肽或蛋白質(zhì)的羧基末端氨基酸的特異性酰胺化。許多天然存在的激素和肽包含此類修飾，如果蛋白質(zhì)將是生物學(xué)活性的，那么所述修飾通常是必需的。一個(gè)例子是降鈣素，其中用非酰胺化脯氨酸殘基替代天然形式的酰胺化脯氨酸導(dǎo)致生物學(xué)活性非常顯著的減少。為了完全活性需要翻譯后酰胺化的其他生物學(xué)肽包括但不限于生長激素釋放因子、其他降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽、促胰液素、肽YY等。
蛋白質(zhì)的羧基末端氨基酸的特異性酰胺化通常由α酰胺化酶催化。為了最大功效需要酰胺化的許多重要的生物學(xué)蛋白質(zhì)的多肽序列可以例如通過基因工程技術(shù)來制造。 然而，重要的和有時(shí)必需的羧基末端酰胺化通常必須在體外進(jìn)行。在這點(diǎn)上需要避免昂貴且繁瑣的化學(xué)酰胺化技術(shù)，并且因此需要采用酰胺化酶來執(zhí)行特異性的酰胺化。
肽基甘氨酸α -酰胺化單加氧酶(PAM)催化肽底物轉(zhuǎn)化為酰胺化的肽產(chǎn)物。該轉(zhuǎn)化是2步反應(yīng)。PAM具有2個(gè)催化結(jié)構(gòu)域肽基甘氨酸α _羥基化單加氧酶(PHM)催化步驟1(底物轉(zhuǎn)化為中間體)和肽基甘氨酸α-羥甘氨酸α-酰胺化裂合酶(PAL)催化步驟 2 (中間體轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物)。全長的PAM催化2個(gè)步驟。
在自然界中，大約50%的肽激素和神經(jīng)遞質(zhì)以前述方式由PAM酰胺化。PAM活性已在眾多不同物種中識(shí)別出來，并且在不同的物種如大鼠、母牛和青蛙中往往具有顯著的結(jié)構(gòu)同源性。還已知PAM的功能、底物和輔因子在物種之間是相似的(通常相同)。底物是具有含有游離羧基的甘氨酸殘基的化合物，通常是肽。PAM催化的酰胺化反應(yīng)是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，在美國專利6，103，495中詳細(xì)描述了一種反應(yīng)，其中使用肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶催化甘氨酸延伸型鮭魚降鈣素前體轉(zhuǎn)化為在其C末端酰胺化的真正的鮭魚降鈣素(即，具有替代前體C末端甘氨酸的氨基)。
由于酶的失活，PAM的活性在酰胺化反應(yīng)的過程中迅速減少。為了預(yù)防此類失活， 現(xiàn)有技術(shù)的酶促酰胺化反應(yīng)一般需要第二種酶(例如過氧化氫酶或辣根過氧化物酶)用于良好的轉(zhuǎn)化和反應(yīng)得率。然而，這消極影響了該方法的成本和效率，并且從調(diào)節(jié)立場上通常是不合需要的。例如，過氧化氫酶是大的蛋白質(zhì)，它難以純化，并且它可能被不需要的蛋白酶污染，所述蛋白酶在酰胺化反應(yīng)中可以攻擊任何產(chǎn)物、前體和/或酶。在藥物產(chǎn)物的情況下與過氧化氫酶共同純化的蛋白質(zhì)還可超過調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)地污染最終產(chǎn)物。此外，當(dāng)過氧化氫酶來自動(dòng)物來源時(shí)，或當(dāng)過氧化氫酶制造中使用動(dòng)物組分時(shí)，必須特別小心以避免傳染性海綿狀腦病。
發(fā)明概述
因此本發(fā)明的目的是提供有效、高得率、低成本的酶促酰胺化反應(yīng)，其中過氧化氫酶或其他酶促清除劑相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)可以大大減少，并且優(yōu)選完全消除。另一目的是提供根據(jù)前述反應(yīng)方法制造的酰胺化生物學(xué)化合物。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于體外生產(chǎn)酰胺化產(chǎn)物的方法，所述方法包括在(A) 肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶和(B)反應(yīng)增強(qiáng)化合物的存在下，所述反應(yīng)增強(qiáng)化合物是 α -酮酸，或其鹽或酯，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體反應(yīng)，其中所述α “酮酸具有分子結(jié)構(gòu)RC (0) C (0) 0Η，且其中R選自芳基、C1-C4烴部分、鹵化或羥基化的 C1-C4烴部分和C1-C4羧酸。
在另一方面，本發(fā)明提供了用于體外生產(chǎn)酰胺化產(chǎn)物的方法，所述方法包括通過在(i)肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶和(ii)反應(yīng)增強(qiáng)化合物的存在下，所述反應(yīng)增強(qiáng)化合物是α “酮酸，或其鹽或酯，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體反應(yīng)形成羥基化中間體，其中所述α-酮酸具有分子結(jié)構(gòu)RC(O)C(O)OH,且其中R選自芳基、 C1-C4烴部分、鹵化或羥基化的C1-C4烴部分和C1-C4羧酸；和同時(shí)或隨后在路易斯堿或肽酸α-羥甘氨酸α-酰胺化裂合酶的存在下使所述中間體反應(yīng)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)肽藥物試劑的生物利用率的方法，其中所述試劑在非天然酰胺化的位置處酰胺化，所述非天然酰胺化通過如下步驟完成，使具有游離酸形式的甘氨酸殘基的前體在(A)肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶和(B)反應(yīng)增強(qiáng)化合物的存在下，所述反應(yīng)增強(qiáng)化合物是α “酮酸，或其鹽或酯，在需要酰胺化的位置處反應(yīng)，其中所述α “酮酸具有分子結(jié)構(gòu)RC (0) C (0) 0Η，且其中R選自芳基、C1-C4烴部分、鹵化或羥基化的C1-C4烴部分和C1-C4羧酸。
在另一方面，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)肽藥物試劑的生物利用率的方法，其中所述試劑在非天然酰胺化的位置處酰胺化，所述非天然酰胺化通過下列步驟完成(A)在(i)肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶和(ii)反應(yīng)增強(qiáng)化合物的存在下，所述反應(yīng)增強(qiáng)化合物是 α -酮酸，或其鹽或酯，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體在需要酰胺化的位置處反應(yīng)，其中所述α “酮酸具有分子結(jié)構(gòu)RC (0) C (0) 0Η，且其中R選自芳基、C1-C4烴部分、鹵化或羥基化的C1-C4烴部分和C1-C4羧酸，因此形成羥基化中間體；和
(B)同時(shí)或隨后使所述中間體與路易斯堿或肽基α -羥甘氨酸α _酰胺化裂合酶反應(yīng)。
在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)增強(qiáng)化合物是α-酮酸鹽。在另一實(shí)施方案中，反應(yīng)增強(qiáng)化合物是α-酮酸酯。在再一實(shí)施方案中，反應(yīng)增強(qiáng)化合物是α-酮酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，R(在反應(yīng)增強(qiáng)化合物的分子結(jié)構(gòu)中)是芳基(優(yōu)選苯基)。 在另一實(shí)施方案中，R是C1-C4烴，優(yōu)選C1-C4烷基。直鏈R基團(tuán)可能比相應(yīng)的支鏈R基團(tuán)略微更加有效。
本發(fā)明還提供了已根據(jù)本文提及的任何一種方法制備的酰胺化產(chǎn)物。
發(fā)明詳述
本發(fā)明應(yīng)用于制造需要具有酰胺基的任何化合物。因?yàn)楸疚挠懻摰拿缸R(shí)別具有甘氨酸殘基的肽，所以本發(fā)明對(duì)于此類結(jié)構(gòu)的酰胺化有用，即使當(dāng)它們是較大分子的部分時(shí)， 所述較大分子在其他位置上包括非天然的或修飾的氨基酸，或氨基酸衍生物例如保護(hù)基團(tuán)等。即使具有作為其分子結(jié)構(gòu)部分的非肽區(qū)域的化合物也應(yīng)從本發(fā)明受益，只要存在由本文使用的酶識(shí)別的甘氨酸。
催化本文反應(yīng)的酶被認(rèn)為識(shí)別具有游離酸形式(即具有游離的羧基)且附著至羰基的甘氨酸殘基的任何前體底物。參見，例如，Merkler等人，Archives of Biochemistry and Biophysics, 1966，第330卷，No. 2，430-434(甘氨酸延伸型脂肪酸底物)；和美國專利 6，103，495 (在天然鮭魚降鈣素的酰胺形成的氨基位置上具有C末端甘氨酸的鮭魚降鈣素， 用作鮭魚降鈣素酰胺化的底物)。因此，預(yù)期使用本文討論的酰胺化酶的任何底物的任何酶促酰胺化都可以從本發(fā)明受益，它增強(qiáng)替代現(xiàn)有技術(shù)過氧化氫酶(或其他現(xiàn)有技術(shù)的反應(yīng)增強(qiáng)化合物例如清除劑酶(scavenging enzyme))的酶促酰胺化。對(duì)于PHM催化的反應(yīng)同樣應(yīng)該是正確的，PHM是PAM的功能性結(jié)構(gòu)域之一。
存在眾多的藥物試劑，不僅包括天然的激素和神經(jīng)遞質(zhì)，還包括藥物活性截短物及其修飾，或衍生的脂肪酸，當(dāng)酰胺化時(shí)所述藥物試劑更具有生物學(xué)活性。即使當(dāng)生物學(xué)活性不必增加時(shí)，藥物試劑的酰胺化也可能令人滿意地增加相對(duì)于使用游離酸形式的試劑的經(jīng)口生物利用率。參見2004年10月7日公開的美國專利公開號(hào)20040197323 (Mehta等人的美國專利申請(qǐng)序號(hào)10/761,481的公開)，其公開內(nèi)容引入本文作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解如本文所教導(dǎo)的酰胺化肽或其他化合物的其他原因。本發(fā)明被認(rèn)為增強(qiáng)PAM催化和PHM催化的反應(yīng)，不管所選擇的產(chǎn)物或底物，只要底物是由PAM或PHM識(shí)別的底物。
肽基甘氨酸α -酰胺化單加氧酶(PAM)及其2個(gè)催化結(jié)構(gòu)域肽基甘氨酸α -羥基化單加氧酶(PHM)和肽基甘氨酸α-羥甘氨酸α-酰胺化裂合酶(PAL)在文獻(xiàn)中得到報(bào)告。本領(lǐng)域還已報(bào)告了優(yōu)選的反應(yīng)條件，輔因子等。本文報(bào)告了酰胺化和酰胺化產(chǎn)物純化的一個(gè)具體例子。本發(fā)明的主要改進(jìn)是現(xiàn)在可以用某些α-酮酸(或其鹽或酯)替代現(xiàn)有技術(shù)酰胺化中通常使用的過氧化氫酶。
不希望被理論束縛，認(rèn)為本文討論的酶促反應(yīng)不合需要地生產(chǎn)過氧化氫作為副產(chǎn)物，所述過氧化氫對(duì)酶促反應(yīng)和/或可回收的產(chǎn)物得率有負(fù)面影響。在現(xiàn)有技術(shù)中認(rèn)為過氧化氫酶可能已充當(dāng)過氧化物清除劑以使形成的任何過氧化氫的負(fù)面影響最小化。
再次不希望被理論束縛，認(rèn)為本發(fā)明的α _酮酸(或其鹽或酯)有效地執(zhí)行過氧化物清除劑的作用而無需過氧化氫酶或其他清除劑酶。認(rèn)為例如α-酮酸可以以下列方式與過氧化反應(yīng)[0027]R-C (0) -C (0) -0Η+Η202 — RC (0) 0H+C02+H20
當(dāng)使用丙酮酸作為α-酮酸時(shí)，假定它與過氧化氫反應(yīng)以產(chǎn)生乙酸、水和二氧化碳。
因?yàn)镽基團(tuán)在這個(gè)反應(yīng)中沒有變化，所以大量的R部分是可能的。申請(qǐng)人已測試了許多酮酸(或其相應(yīng)的酯或鹽)，并且在下表1中已報(bào)告了其用于酰胺化重組人甲狀旁腺激素截短物(PTH的前31個(gè)氨基酸，隨后為C末端甘氨酸)的效率。在表1的腳注里還報(bào)告了使用過氧化氫酶的酰胺化。在表1中酰胺化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化不是可直接比較的，因?yàn)槭褂昧瞬煌瑵舛鹊姆磻?yīng)增強(qiáng)酮酸(或其鹽或酯)。選擇適合于每種化合物的優(yōu)選濃度。同樣，因此關(guān)于表1中測試的每種化合物使用單獨(dú)的對(duì)照，從而使得每種化合物的表現(xiàn)可以與其對(duì)應(yīng)的對(duì)照進(jìn)行比較。如所表明的，3種測試化合物并不優(yōu)于對(duì)應(yīng)的對(duì)照。表1中列出的對(duì)照值是在本發(fā)明的反應(yīng)增強(qiáng)化合物不存在下酰胺化rhPTH(l-31)Gly32-0H觀察到的一般值。
用α -酮酸/酯的酰胺化反應(yīng)
下文列出了執(zhí)行以測試各種酮酸(或其鹽或酯)的功效的一些反應(yīng)細(xì)節(jié)。
為了確定下表1中的信息，在水中制備所有試劑的貯存液。在下列條件下進(jìn)行酰胺化:4mg/mL rhPTH(l-31)Gly32_0H、30mM 2-嗎啉代乙磺酸(MES)pH[6. 3-6. 5]、0· 5 μ M硫酸銅、5mM碘化鉀、2mM抗壞血酸、[0-1%]乙醇和15，000U/mL PAM。所有反應(yīng)均于37°C溫育 4小時(shí)。以下列順序加入試劑rhPTH(l-31)Gly32-0H、水、MES、碘化鉀、乙醇、硫酸銅、α -酮酸或酯、抗壞血酸和ΡΑΜ。所有反應(yīng)均用6%三氟乙酸酸化至ρΗ 2. 0并通過CEX-HPLC (面積％ )分析，以檢測所需產(chǎn)物rhPTH(l-31)NH2的形成。結(jié)果如下表1。
表 1
在α -酮酸/酯的存在下 rhPTH(l、0.5 μΜ硫酸銅、5mM碘化鉀、2 mM抗壞血酸、[0如表1中所示，α -酮酸的鹽和酯傾向于與相應(yīng)的α -酮酸類似地表現(xiàn)。較大的 R基團(tuán)傾向于不能如較小的R基團(tuán)(優(yōu)選C1-C4) 一樣表現(xiàn)良好，除了芳族基團(tuán)當(dāng)位于吸電子位時(shí)傾向于表現(xiàn)良好。直鏈化合物傾向于比相應(yīng)的支鏈化合物表現(xiàn)得稍好一些。預(yù)期烴部分可以是鹵化或羥基化的而不明顯損害功能。如所顯示的，有效的化合物表現(xiàn)相當(dāng)良好并且因此是現(xiàn)有技術(shù)過氧化氫酶的適當(dāng)?shù)奶娲?，因此避免了上文討論的過氧化氫酶的缺點(diǎn)ο
下文列出了根據(jù)本發(fā)明酰胺化底物并純化所得產(chǎn)物的一些詳細(xì)的方法步驟。
實(shí)施例1 使用肽基甘氨酸α -酰胺化單加氧酶將甘氨酸延伸型甲狀旁腺激素片段轉(zhuǎn)化為酰胺化的對(duì)應(yīng)物
使用丙酮酸鹽的rhPTH(l-34)Gly35-0H的酰胺化
表2中顯示了用于酰胺化rhPTH(l-34)Gly35-0H的組分和最終濃度。隨后為酰胺化的概述。
8表2 rhPTH(l 將在 l，900mL 25mM MES、200mM NaCl pH 6. 0 中的大約 12. 4 克 rhPTH(l_34) Gly35-0H裝進(jìn)配有攪拌器和氣體噴霧器的玻璃容器中。
向這種溶液中以列出的順序加入下列組分3，025mL水、74lmL250mM MES pH6. 3、1. 03mL 3mM硫酸銅、124mL碘化鉀、62mL 190標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度乙醇、124mL 400mM丙酮酸鈉和124mL100mM抗壞血酸鈉。
將反應(yīng)容器置于水浴中并將反應(yīng)混合物攪拌加熱至25-27°C。
用21mL 2M HCl將反應(yīng)混合物的pH調(diào)整至5. 8。啟動(dòng)氧噴射；調(diào)整噴射速率以避免反應(yīng)混合物的過量發(fā)泡。
加入47mL PAM并將反應(yīng)混合物于25_27°C溫育4小時(shí)35分鐘(在溫育時(shí)間段自始至終執(zhí)行氧噴射)。
用74mL 2M HCl將反應(yīng)混合物酸化至pH2. 4。
如Miller 等人 ABB 298 :380_388 (1992)美國專利號(hào) 4，708，934、歐洲公開 0308067和0382403、以及Biotechnology第II卷(1993)第64-70頁中所描述的可以獲得 PAM酶，其公開內(nèi)容引入本文作為參考。PAM酶還可由內(nèi)部命名為UGL 73-26/M MWCB 00的 PAM表達(dá)細(xì)胞系獲得，所述細(xì)胞系根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約 (Budapest Treaty on the International Recognition of Deposits of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure)作為ATCC編號(hào)PTA-6784保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas Virginia, 20110-2209, U. S. Α.。 對(duì)保藏的細(xì)胞系實(shí)施在這個(gè)條約下公布的規(guī)程，并且樣品將在條約要求的時(shí)間和在條約要求的條件下，并符合條約簽名人的專利法和規(guī)程時(shí)可用。例如，在基于本申請(qǐng)的美國專利或要求其優(yōu)先權(quán)或參考其的任何其他美國申請(qǐng)授權(quán)后，對(duì)保藏材料的可用性的所有限制將不能取消地去除至布達(dá)佩斯條約或35U. S. C. § 112所要求的程度。
甘氨酸延伸型前體可以通過類似于美國專利6，103，495，實(shí)施例1_2中所描述的方式發(fā)酵產(chǎn)生，并如美國專利6，103，495，實(shí)施例3中所描述的在酰胺化之前進(jìn)行純化.它還可根據(jù)美國專利公開U. S. 2005/0221442 (美國申請(qǐng)?zhí)?1/076,260)產(chǎn)生。前述的公開內(nèi)容引入本文作為參考。
在其中用于酰胺化的酶是肽基甘氨酸α -羥基化單加氧酶(PHM)的情況下，使用與如上所述相同的反應(yīng)混合物，其中用PHM替代ΡΑΜ。此外，在4-6小時(shí)的溫育時(shí)間段結(jié)束時(shí)，通過添加堿使反應(yīng)混合物的PH增至8-9。在終止反應(yīng)之前將反應(yīng)混合物再攪動(dòng)4-8小時(shí)。通過只表達(dá)PAM的N末端部分(約前40dKa)可以獲得ΡΗΜ。參見例如Mizuno等人， BBRC第148卷，No. 2，第546-52頁(1987)，其公開內(nèi)容(因?yàn)樗婕癕izuno' s" AEl" 引入本文作為參考。已知青蛙皮膚天然地表達(dá)PHM。
實(shí)施例2 酰胺化后的純化
陽離子交換(CEX)層析
使用CEX 層析實(shí)現(xiàn)從殘留的 rhPTH(l-34)Gly35-0H 純化 rhPTH(l_34) _NH2。下文描述了 CEX層析法的概述。將酸化的酰胺化輸出物裝載到9cmX19cm、用25mM MES pH 6.5 平衡的Toyopearl SP650M(Tosoh Bioscience LLC)柱上。柱以180cm/小時(shí)操作并且在 280nm監(jiān)控柱流出物的UV吸光度。用25mM MES pH 6. 5洗滌柱直至柱流出物的pH回到 6.5。用25mM MES,80mM NaCl pH6. 5洗滌柱直至洗滌峰完全洗脫并且達(dá)到穩(wěn)定的UV基線。 用25mMMES，200mM NaCl pH 6. 5從柱洗脫產(chǎn)物rPTH(l_34) _NH2。收集整個(gè)UV峰；并通過 RP-HPLC篩選級(jí)分以確定匯集的標(biāo)準(zhǔn)。反相(RP)層析
使用RP層析將鹽形式的肽從氯化物交換為乙酸鹽；RP層析提供了肽的邊緣純化。 用3體積的333mM乙酸鈉稀釋CEX層析輸出物并充分混合。在裝載前允許混合物在室溫下放置75分鐘。將乙酸鹽稀釋的樣品裝載到6cmX17cm、用250mM乙酸鈉pH 7. 5平衡的 Amberchrom CG300M(Tosoh Bioscience LLC)柱上。柱以 180cm/小時(shí)操作并且在 280nm監(jiān)控柱流出物的UV吸光度。用250mM乙酸鈉pH 7. 5將柱洗滌60分鐘。用0. 乙酸平衡柱。用0. 乙酸、40%乙醇從柱中洗脫出產(chǎn)物rhPTH(l-34)-NH2。收集整個(gè)UV峰。
rhPTH (1-34) -NH2 的表征
將RP層析輸出物通過凍干法濃縮為白色絮狀粉末，從而得到11.8克(來自酰胺化的95 %總得率)rhPTH (1-34) _NH2。通過電霧化電離質(zhì)譜法(ESI-MS)確定 rhPTH(1-34)-NH2分子量為4，116. 9Da，這與計(jì)算出的平均分子量4，116. 8Da相一致。
盡管本發(fā)明已關(guān)于其具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但許多其他變化和修飾及其他用途對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。本發(fā)明因此不限制于本文的具體公開內(nèi)容，而僅限制于附加的權(quán)利要求
。
權(quán)利要求
1.用于體外生產(chǎn)酰胺化產(chǎn)物的方法，所述方法包括在(A)肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶和(B)反應(yīng)增強(qiáng)化合物的存在下，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體反應(yīng)，其中，所述的反應(yīng)增強(qiáng)化合物選自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其鹽、丙酮酸甲酯、苯甲酰甲酸或其鹽、2- 丁酮酸或其鹽、3-甲基-2-氧代丁酸或其鹽和2-酮戊二酸或其鹽。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中所述反應(yīng)增強(qiáng)化合物選自丙酮酸或其鹽。
3.權(quán)利要求
2的方法，其中所述反應(yīng)增強(qiáng)化合物是丙酮酸鈉。
4.用于體外生產(chǎn)酰胺化產(chǎn)物的方法，所述方法包括(A)通過在(i)肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶和(ii)反應(yīng)增強(qiáng)化合物的存在下，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體反應(yīng)形成羥基化中間體，其中，所述的反應(yīng)增強(qiáng)化合物選自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其鹽、丙酮酸甲酯、苯甲酰甲酸或其鹽、2-丁酮酸或其鹽、3-甲基-2-氧代丁酸或其鹽和2-酮戊二酸或其鹽；和(B)同時(shí)或隨后使所述中間體與路易斯堿或肽基α-羥甘氨酸α _酰胺化裂合酶反應(yīng)。
5.權(quán)利要求
4的方法，其中所述反應(yīng)增強(qiáng)化合物選自丙酮酸或其鹽。
6.權(quán)利要求
5的方法，其中所述反應(yīng)增強(qiáng)化合物是丙酮酸鈉。
7.權(quán)利要求
1的方法，其中所述產(chǎn)物是非天然酰胺化的肽。
8.權(quán)利要求
4的方法，其中所述產(chǎn)物是非天然酰胺化的肽。
9.權(quán)利要求
1的方法，其中所述產(chǎn)物是酰胺化的肽，其中所述的肽在非天然酰胺化的位置處酰胺化。
10.權(quán)利要求
4的方法，其中所述產(chǎn)物是酰胺化的肽，其中所述肽在非天然酰胺化的位置處酰胺化。
11.用于增強(qiáng)肽藥物試劑的生物利用率的方法，其中所述試劑在非天然酰胺化的位置處酰胺化，所述非天然酰胺化通過如下步驟完成，使具有游離酸形式的甘氨酸殘基的前體在(A)肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶和(B)反應(yīng)增強(qiáng)化合物的存在下，在需要酰胺化的位置處反應(yīng)，其中，所述的反應(yīng)增強(qiáng)化合物選自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其鹽、丙酮酸甲酯、苯甲酰甲酸或其鹽、2- 丁酮酸或其鹽、3-甲基-2-氧代丁酸或其鹽和2-酮戊二酸或其鹽。
12.用于增強(qiáng)肽藥物試劑的生物利用率的方法，其中所述試劑在非天然酰胺化的位置處酰胺化，所述非天然酰胺化通過下列步驟完成(A)在(i)肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶和(ii)反應(yīng)增強(qiáng)化合物的存在下，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體在需要酰胺化的位置反應(yīng)，因此形成羥基化中間體，其中，所述的反應(yīng)增強(qiáng)化合物選自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其鹽、丙酮酸甲酯、苯甲酰甲酸或其鹽、2-丁酮酸或其鹽、3-甲基-2-氧代丁酸或其鹽和2-酮戊二酸或其鹽；和(B)同時(shí)或隨后使所述中間體與路易斯堿或肽基α -羥甘氨酸α _酰胺化裂合酶反應(yīng)。
13.權(quán)利要求
1的方法，其中所述產(chǎn)物是肽。
14.權(quán)利要求
4的方法，其中所述產(chǎn)物是肽。
15.用于體外生產(chǎn)α-羥基-甘氨酸的方法，所述方法包括在(i)肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶和(ii)反應(yīng)增強(qiáng)化合物的存在下，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體反應(yīng)，其中，所述的反應(yīng)增強(qiáng)化合物選自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其鹽、丙酮酸甲酯、苯甲酰甲酸或其鹽、2- 丁酮酸或其鹽、3-甲基-2-氧代丁酸或其鹽和2-酮戊二酸或其鹽。
16.權(quán)利要求
15的方法，其中所述反應(yīng)增強(qiáng)化合物選自丙酮酸或其鹽。
17.權(quán)利要求
16的方法，其中所述反應(yīng)增強(qiáng)化合物是丙酮酸鈉。
專利摘要
在酮酸或其鹽或酯的存在下酶促實(shí)現(xiàn)X-Gly至X-α-羥基-Gly或X-NH2(X是具有能夠與甘氨酸形成共價(jià)鍵的羰基的肽或任何其他化合物)的體外轉(zhuǎn)化，以提供良好的得率而無需過氧化氫酶或類似的酶促反應(yīng)增強(qiáng)劑。肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶(PAM)是用于催化該轉(zhuǎn)化的優(yōu)選酶?？商娲?，使用肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶(PHM)將X-Gly轉(zhuǎn)化為可以回收的X-α-羥基-Gly，或任選地可以同時(shí)或順次通過路易斯堿或酶肽基α-羥甘氨酸A-酰胺化裂合酶(PAL)的作用轉(zhuǎn)化為酰胺。PHM和PAL都是PAM的功能性結(jié)構(gòu)域。
文檔編號(hào)C12P21/06GKCN101065493 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200580040163
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2005年11月23日
發(fā)明者A·P·康薩爾沃, J·P·吉利甘, N·M·梅塔, W·斯特恩 申請(qǐng)人:尤尼基因?qū)嶒?yàn)室公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),