專利名稱:用于將選擇的分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的載體的制作方法
本發(fā)明涉及用于將選擇的分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的載體，其包含SAINT分子，所述分子通過(guò)靜電作用，更特別地通過(guò)非共價(jià)結(jié)合，例如通過(guò)氫鍵結(jié)合至所述選擇的分子。此外，本發(fā)明涉及用于將選擇的分子靶向轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的SAINT分子的用途。
以這樣的方式，即以選擇的分子必須在身體的優(yōu)選的細(xì)胞中或其附近發(fā)揮其作用的方式施用選擇的分子在現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域：
的知識(shí)水平之內(nèi)。遞送這些分子至身體的一種可能性是給身體施用相當(dāng)大的量的選擇的分子，由此，通過(guò)擴(kuò)散，可在被靶向的細(xì)胞中獲得所需濃度的所述選擇的分子。該方法的問(wèn)題在于選擇的分子在身體的其他部位可能產(chǎn)生不想要的位置效應(yīng)(site effects)。
因此已發(fā)展了遞送選擇的分子例如藥物至位于身體的特定部位的特定細(xì)胞。使用的第一種方法包括將選擇的化合物偶聯(lián)至抗體。該偶聯(lián)是共價(jià)偶聯(lián)。作為結(jié)果，選擇的化合物的活性，和游離的分子的活性相比，顯著降低。此外，目前使用的方法是將選擇的分子包裝在脂質(zhì)體中。可將抗體偶聯(lián)至其中包裝有所述分子的脂質(zhì)體的外側(cè)。該抗體至脂質(zhì)體的偶聯(lián)大部分發(fā)生在將選擇的分子包入脂質(zhì)體之后。在抗體的偶聯(lián)發(fā)生在選擇的分子被包入之前的情況下，所述抗體可能位于脂質(zhì)體的內(nèi)膜，這樣可能導(dǎo)致脂質(zhì)體的功效減少。將選擇的分子例如藥物化合物包裝入脂質(zhì)體的公知的不利方面是藥物將緩慢地從脂質(zhì)體滲漏出來(lái)。第二個(gè)不利方面是包裝(脂質(zhì)內(nèi)部包含選擇的化合物)的形成必需在包含所述選擇的化合物的溶液中進(jìn)行。在包裝期間，不超過(guò)5％的選擇的化合物被包裝入脂質(zhì)體中。這意味著95％的選擇的化合物未被包裝入脂質(zhì)體內(nèi)。因此，該方法的效率非常低。
本發(fā)明的目的在于提供強(qiáng)力地提高選擇的化合物至細(xì)胞的遞送的載體。
此外，本發(fā)明的目的在于提供使得能夠?qū)x擇的分子進(jìn)行長(zhǎng)效和穩(wěn)定的結(jié)合的載體。
為達(dá)到上述目標(biāo)中的至少一個(gè)目標(biāo)，本發(fā)明提供了前文中提到的載體，所述載體特征在于權(quán)利要求
1的方案(measures)。通過(guò)這種方式，提供了遞送選擇的分子至細(xì)胞的非常穩(wěn)定的方法。
盡管通常提到下面的氫相互作用和氫鍵，但相互作用不限于該單一形式。在所有情況下，是指任何類型的靜電作用。
在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”以其一般意思使用。然而，說(shuō)到此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚地理解，“特定的細(xì)胞”是指選擇的化合物待被轉(zhuǎn)運(yùn)至的細(xì)胞。
優(yōu)選的實(shí)施方案描述于權(quán)利要求
2、3和4。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及Saint分子以被靶向的方式將選擇的分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的用途。Saint分子是公知的，也被描述為轉(zhuǎn)運(yùn)載體，且詳細(xì)描述于歐洲專利公開(kāi)號(hào)BP-0755924 B1和具有公開(kāi)號(hào)US5,853,694和US 6,726,894的美國(guó)專利，所述專利由本申請(qǐng)者注冊(cè)。這些專利-申請(qǐng)的描述在本申請(qǐng)中引用作為參考。根據(jù)廣義描述，Saint分子被當(dāng)作合成的兩親性分子。
將選擇的分子例如一般為大分子或藥物制劑封裝在Saint分子中的方法詳盡地描述于前述的歐洲專利EP 0755924 B1和美國(guó)專利US5,853,694和US 6,726,894。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，將Saint分子共價(jià)地連接至連接體分子。通過(guò)該共價(jià)偶聯(lián)，確保其為穩(wěn)定的載體的整合的和牢固的部分?？紤]到R5和R5′可以相同或不同，所述連接體可在位置R1、R2、R3、R4、R5和R5′上結(jié)合至Saint分子。關(guān)于這些類型的Saint分子的更詳細(xì)的描述，參考US 6,726,894。連接體的實(shí)例是例如下列1-N’-甲基--4-(氨基丁基，順-9-油烯基)-甲基氯化嘧啶(methylpyrimidiniumchloride)(SAINT-氨基-連接體)和1-N′-甲基-4-(N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰硫代乙酸，順-9-油烯基)-甲基氯化吡啶(Saint-SATA-連接體)。在這兩種情況下，乙酰硫代乙酸(acetylthioacetate)和SATA基團(tuán)用作連接體(部分)。然而等同的化合物也可用作連接體-部分，包括可共價(jià)地連接至Saint分子的每一種化合物。盡管一般只有一個(gè)連接體分子與Saint分子結(jié)合，但位置的組合可能被連接體分子占據(jù)，例如單獨(dú)的R1、R2、R3、R4、R5或R5′或這些位置的組合，最多所有5個(gè)連接體位置都被占據(jù)。
根據(jù)其他優(yōu)選的實(shí)施方案，細(xì)胞特異性配體選自抗體或其衍生物、蛋白、肽、具有作為細(xì)胞表面的靶的特定用途的化合物和具有想要的細(xì)胞特異性的其他化合物。
抗體或其衍生物可通過(guò)合成產(chǎn)生或可以是天然發(fā)生的變體。
在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，我們將能夠結(jié)合細(xì)胞的受體或蛋白的每一種化合物都當(dāng)作配體。配體的前提條件是其具有對(duì)于受體和/或細(xì)胞類型的特異性。這些類型配體的實(shí)例是L-多巴或腎上腺素衍生物。該第一類型的配體特異性地結(jié)合黑質(zhì)中的多巴胺受體；第二類型的配體特異性地結(jié)合身體的腎上腺素能受體。當(dāng)然，本發(fā)明不限于該實(shí)例。
更特別地，優(yōu)選地，被封裝的分子結(jié)合在Saint分子的活性表面。不受該實(shí)施方案的限制，此處使用帶正電荷的吡啶(pyridinium)基團(tuán)。該基團(tuán)結(jié)合至被封裝的帶負(fù)電荷的大分子。此外，所述Saint分子可能以間接的方式結(jié)合大分子，在所述大分子帶正電荷的情況下，通過(guò)和圍繞所述大分子的水層相互作用結(jié)合大分子。因此，所述Saint分子將通過(guò)靜電作用例如通過(guò)形成氫鍵結(jié)合所述大分子，從而阻止選擇的分子從Saint分子滲漏。
此外，來(lái)自例如吡啶環(huán)的碳原子或鄰位電子的靜電作用可能用于結(jié)合。
本發(fā)明產(chǎn)生了將選擇的分子例如藥物遞送至身體的特定部位的特定細(xì)胞的可能性。因此產(chǎn)生了有利方面，即必須給身體施用的藥物的量可和需要治療的細(xì)胞的量精確地配合。通過(guò)選擇Saint分子和被封裝的化合物之間的恰當(dāng)?shù)呐渲?，可防止所述化合物的滲漏，且在遞送至細(xì)胞膜、和其融合或被其吸收后將其釋放，所述細(xì)胞膜也包含和連接體偶聯(lián)的配體互補(bǔ)的受體配體。通過(guò)該方式，防止了所述選擇的分子在身體的其他位置釋放。在此處，其仍包含在saint分子-載體中。
上面描述本發(fā)明的基本內(nèi)容?；谏厦娴拿枋龊退降?b>權(quán)利要求
，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地產(chǎn)生都將落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的其他實(shí)施方案。
實(shí)施例人胚腎細(xì)胞難以被轉(zhuǎn)染。當(dāng)使用這些細(xì)胞時(shí)，主要的競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)染法(competing transfection method)(其他廠商的)需要幾微克的質(zhì)粒DNA以進(jìn)行成功的轉(zhuǎn)染。在和SAINT-18組合的情況下，1□g(每12個(gè)孔)通常導(dǎo)致高于90％的轉(zhuǎn)染率。為了能夠體現(xiàn)靶向部分SAINT-18-RGD的增強(qiáng)效應(yīng)，在該方案中，我們使用少量的質(zhì)粒DNA(每12個(gè)孔500ng)。Saint-連接體-RGD的結(jié)構(gòu)式描述于下面的
圖1中。此外，如本發(fā)明中所描述的，將RGD-肽偶聯(lián)至SAINT-連接體的SATA基團(tuán)。RGD基團(tuán)是整聯(lián)蛋白受體家族的靶向部分且被認(rèn)為可增加轉(zhuǎn)染的功效。將人胚腎細(xì)胞品系293A培養(yǎng)在12孔板中并用4種組合的Saint分子(即Saint-18、偶聯(lián)至RGD的Saint-18、Saint-18和偶聯(lián)至RGD的Saint-18的混合物和只有作為參照的連接體分子)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將500ng CMV-GFP質(zhì)粒和3.75nm SAINT分子或連接體(每孔)混合。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過(guò)FACS分析測(cè)量GFP的表達(dá)。GFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分比示于下面的圖中。
分子式＝C58H91ClN8O10S分子量＝1103.88734
Saint-連接體-RGD的結(jié)構(gòu)式描述于圖1的結(jié)果清楚地顯示1.S18-連接體(參照)作為轉(zhuǎn)染劑的功能很差(第4柱)。
2.S18/RGD能夠轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
3.S18∶S18RGD比例500∶1增加轉(zhuǎn)染率大約33％。
單獨(dú)的S18-連接體不具有顯著的轉(zhuǎn)染能力。我們預(yù)測(cè)，100％的S18-RGD具有由于RGD基團(tuán)產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)導(dǎo)致的減少的轉(zhuǎn)染功效。然而，當(dāng)將S18RGD和S18以500∶1的比例混合時(shí)，轉(zhuǎn)染效率大大增加。將確定更佳的比例。
使用除了RGD外的靶向部分(例如細(xì)胞特異性配體)獲得了類似的結(jié)果。然而，在所有情況下，需要最優(yōu)化以獲得最優(yōu)的效果。該實(shí)驗(yàn)極好地表明Saint分子的轉(zhuǎn)染增強(qiáng)特征。
(按照條約第19條的修改)1.用于轉(zhuǎn)運(yùn)選擇的分子至細(xì)胞的載體，其包含與Saint-連接體分子混合的脂質(zhì)、親水脂分子或其它類型的藥物遞送實(shí)施方案，其特征在于所述Saint分子共價(jià)結(jié)合至連接體分子，且所述連接體分子共價(jià)結(jié)合至抗體或其衍生物、蛋白、肽、具有其靶向細(xì)胞表面的特定用途的化合物和具有想要的細(xì)胞特異性的其他化合物。
2.Saint分子在將選擇的分子靶向轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中的用途，其中所述Saint分子通過(guò)靜電作用結(jié)合至所述選擇的分子，且其中所述Saint分子偶聯(lián)至所述連接體分子，且所述連接體分子偶聯(lián)至細(xì)胞特異性配體。
3.權(quán)利要求
2的用途，使用權(quán)利要求
1的載體。
權(quán)利要求
1.用于轉(zhuǎn)運(yùn)選擇的分子至細(xì)胞的載體，其包含通過(guò)靜電作用結(jié)合至所述選擇的分子的Saint分子，其特征在于所述Saint分子結(jié)合至連接體分子，且所述連接體分子偶聯(lián)至細(xì)胞特異性配體。
2.權(quán)利要求
1的載體，其特征在于所述Saint分子共價(jià)地結(jié)合至所述連接體分子。
3.權(quán)利要求
1或2的載體，其特征在于所述細(xì)胞特異性配體選自抗體或其衍生物、蛋白、肽、具有其靶向細(xì)胞表面的特定用途的化合物和具有想要的細(xì)胞特異性的其他化合物。
4.權(quán)利要求
1、2或3的載體，其特征在于所述共價(jià)結(jié)合的分子啟動(dòng)和細(xì)胞的融合。
5.Saint分子在將選擇的分子靶向轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中的用途，其中所述Saint分子通過(guò)靜電作用結(jié)合至所述選擇的分子，且其中所述Saint分子偶聯(lián)至所述連接體分子，且所述連接體分子偶聯(lián)至所述細(xì)胞特異性配體。
6.權(quán)利要求
5的用途，使用權(quán)利要求
2、3或4中任一項(xiàng)的載體。
專利摘要
用于將選擇的分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的載體，其由通過(guò)靜電作用結(jié)合至選擇的分子的Saint分子構(gòu)成，其中所述Saint分子偶聯(lián)至連接體分子且所述連接體分子偶聯(lián)至細(xì)胞特異性配體，其中所述Saint分子共價(jià)地結(jié)合至所述連接體分子。
文檔編號(hào)C12N15/88GKCN101044241SQ200580035812
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年10月20日
發(fā)明者M·H·J·勒伊特斯 申請(qǐng)人:辛沃魯克斯Ip有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan