一種測定類凝血酶活性的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蛇毒類凝血酶的測定方法，采用酶動(dòng)力學(xué)測定法，使用可控溫紫外分光光度計(jì)，經(jīng)過考察孵育時(shí)間、酶濃度、線性范圍以及該方法的精密度與酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)，最終確立了蛇毒類凝血酶活力的測定方法。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)檢測方法中存在的檢測所用血漿或纖維蛋白原等原料性能差異大、操作人員主觀影響大，以及只能專人負(fù)責(zé)測定等不利因素，具有步驟簡單、不需做標(biāo)準(zhǔn)曲線、試驗(yàn)數(shù)據(jù)清晰明了，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)，適用于各種來源的類凝血酶原液和制劑的活性測定、活性定義，以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制，包括天然及重組類凝血酶。
【專利說明】一種測定類凝血酶活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，本發(fā)明涉及一種測定類凝血酶活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自1936年奧地利學(xué)者Von Klobusitzky首次從巴西矛頭峻蛇(Bothropsatrox)毒液中分離得到一種絲氨酸蛋白水解酶(類凝血酶)，即巴曲酶，至今已發(fā)現(xiàn)30多種蛇毒中含有類凝血酶組分，并有20多種先后得到分離和純化。
[0003]我國目前臨床上應(yīng)用的蛇毒制劑大部分為類凝血酶，在臨床上有兩方面的用途。
[0004]一種為降纖作用，即巴曲克栓酶，如東菱迪芙，其作用是分解纖維蛋白原，抑制血栓形成；誘發(fā)組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑(t-PA)的釋放，減弱纖維蛋白溶解酶原激活劑的抑制因子的活性，促使纖維蛋白溶解；增加血液流動(dòng)性，防止血栓形成。主要用于缺血性腦血管病、急性心肌梗塞、突發(fā)性耳聾、急性腦梗塞、不穩(wěn)定心絞痛等，其療效確切，不良反應(yīng)輕微。
[0005]另一種為止血作用，即巴曲止血酶,如立止血、巴曲亭、邦亭、速樂涓等,可用于多種原因引起的出血，特別是應(yīng)用于傳統(tǒng)止血藥無效的出血病人，療效確切，未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。
[0006]迄今為止，巴曲酶活性測定主要有兩種方法:其中血漿凝固法最常用，根據(jù)血漿凝固的時(shí)間判定巴曲酶的效價(jià)。另外一種方法是纖維蛋白原凝集法，根據(jù)纖維蛋白凝塊生成的快慢判斷巴曲酶的效價(jià)。但這兩種方法，無論血漿還是纖維蛋白原都來源復(fù)雜，不同廠家差異較大，即使是同一廠家的產(chǎn)品，不同批次間差異也較大，并且二者的存放時(shí)間長短也會(huì)影響活性測定，更何況是以目測判斷結(jié)果，受檢測者主觀干擾較大。
[0007]合肥兆科藥業(yè)有限公司申請了巴曲酶活性測定方法，以降纖酶為標(biāo)準(zhǔn)品，測得巴曲酶也以降纖酶活力Bu為巴曲止血酶活力單位，測定方法采用傳統(tǒng)的酶固定時(shí)間測定法，這類方法不僅耗時(shí)長，而且很難保證反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)(反應(yīng)速度直接與被測酶活力成正比，而與底物濃度無關(guān))，因此其線性、靈敏度、準(zhǔn)確度較差。隨著實(shí)驗(yàn)分析技術(shù)的發(fā)展，酶固定時(shí)間測定法已逐步被酶動(dòng)力學(xué)測定法所取代。
[0008]鑒于上述方法的局限性，尋找一種科學(xué)、高效、客觀、經(jīng)濟(jì)的、精準(zhǔn)、批間差異小的活性測定方法成為巴曲酶等類凝血酶產(chǎn)品的應(yīng)用研究的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明建立了一種類凝血酶、例如蛇毒類凝血酶的酶動(dòng)力學(xué)測定方法。該法又稱速率法，即用紫外分光光度計(jì)監(jiān)測酶促反應(yīng)體系的初速度，間接計(jì)算樣品中被測酶活力。在酶促反應(yīng)中，真正能代表酶催化活性的只有酶促反應(yīng)初速度。因此該法不僅準(zhǔn)確，線性范圍大大提高、不需做標(biāo)準(zhǔn)曲線，節(jié)省試驗(yàn)步驟及時(shí)間。
[0010]具體而言，本發(fā)明的檢測方法包括以下步驟:[0011]本發(fā)明提供一種測定類凝血酶活性的方法，該方法包括以下步驟:
[0012](I)用去離子水配制濃度為l_2mM的生色底物水溶液，所述生色底物為S2238、S2288、S2251、S2366、S2403 或 S2765 ；
[0013](2)用20-150mmol/L pH7.0-8.0的Tris鹽酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液稀釋待測類凝血酶樣品，得到樣品濃度為18nmol/L-100nmol/L的稀釋液；
[0014](3)吸取步驟(2)制得的待測類凝血酶樣品稀釋液置于比色皿中，加入50μ I的步驟(I)制得的生色底物水溶液，然后補(bǔ)充所述Tris鹽酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液至終體積為lmL，混勻，使得待測類凝血酶樣品的終濃度為l-25nmol/L，于37°C靜置2_25分鐘，然后在波長405nm處檢測吸光度0_20分鐘，每30秒讀數(shù)一次；
[0015](4)利用公式I計(jì)算所述待測類凝血酶樣品的活力(U):
【權(quán)利要求】
1.一種測定類凝血酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)用去離子水配制濃度為l-2mM的生色底物水溶液，所述生色底物為S2238、S2288、S2251、S2366、S2403 或 S2765 ；
(2)用20-150mmol/L ρΗ7.0-8.0 的 Tris 鹽酸緩沖液或 20-150mmol/L ρΗ7.0-8.0 的磷酸鹽緩沖液稀釋待測類凝血酶樣品，得到樣品濃度為ISnmol/L-lOOnmol/L的稀釋液； (3)吸取步驟(2)制得的待測類凝血酶樣品稀釋液置于比色皿中，加入50μ I的步驟(I)制得的生色底物水溶液，然后補(bǔ)充所述Tris鹽酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液至終體積為ImL,混勻，使得待測類凝血酶樣品的終濃度為l-25nmol/L，于37°C靜置2_25分鐘，然后在波長405nm處檢測吸光度0_20分鐘，每30秒讀數(shù)一次； (4)利用公式I計(jì)算所述待測類凝血酶樣品的活力(U): 公式 1: U = ΔAXVX10-9/1XtXξ 式中:U—活力單位，即產(chǎn)物生成速度(nmol/min) ；Δ A一樣品在反應(yīng)時(shí)間中A405吸光度的變化值—反應(yīng)體積(L) ;1 一光程(cm) ;t—反應(yīng)時(shí)間(min) ; ξ—摩爾吸光系數(shù)，為10500 (L/moI.cm)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述生色底物為S2238;所述水溶液的濃度為2mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述Tris鹽酸緩沖液為20-100mmol/L 的 pH7.0-8.0Tris 鹽酸緩沖液，優(yōu)選為 20-100mmol/L 的 pH7.2-8.0Tris 鹽酸緩沖液，更優(yōu)選為50mmol/L的pH7.4Tris鹽酸緩沖液；所述磷酸鹽緩沖液為20-100mmol/L的pH7.0-8.0磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選為20-100mmol/L的pH7.2-8.0磷酸鹽緩沖液，更優(yōu)選為50mmol/L的ρΗ7.4磷酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，待測類凝血酶樣品的終濃度為l_28nmol/L，優(yōu)選為l_17nmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，在37°C下靜置時(shí)間為5分鐘；檢測時(shí)間為IO分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述類凝血酶為蛇毒類凝血酶，包括白眉蝮蛇來源的降纖酶、矛頭蝮蛇來源的巴曲酶、尖吻蝮蛇來源的血凝酶等，重組以及重組突變的蛇毒類凝血酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述類凝血酶為重組定點(diǎn)突變巴曲酶或天然巴曲酶，其中所述重組定點(diǎn)突變巴曲酶的氨基酸序列相對于天然巴曲酶氨基酸序列的第45位的Arg突變?yōu)長ys。
【文檔編號(hào)】G01N1/28GK103884662SQ201410066734
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】徐梅, 李娜, 李秀娜, 石皎, 薛雁, 王宏英, 薛百忠 申請人:遼寧諾康生物制藥有限責(zé)任公司