專利名稱：高活性凝血酶抑制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應用基因工程技術(shù)，涉及用DNA家族改組技術(shù)進行體外基因隨機重組，增加基因的多樣性，結(jié)合高效快捷的篩選系統(tǒng)，從中獲得具有更好生物學功能的表達產(chǎn)物，具體涉及一種高活性凝血酶抑制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
當今血栓性心腦血管疾病已成為威脅人類健康的大敵，探索和研究有效防治此病的藥物是一項十分緊迫的任務?？鼓涂寡“逯委熓钱斀裥难芗膊〉闹匾锍瘫?，傳統(tǒng)的抗凝藥，如非組分肝素(UFH)、低分子肝素、丙酮芐羥香豆素等，作為血漿凝血系統(tǒng)抑制劑已在臨床廣泛使用，但有一定的局限性，其作用依靠血小板抗凝血因子III活性，對已凝結(jié)的血塊沒有作用，能被血小板因子IV和肝素酶滅活等。此外，其狹窄的治療窗和誘發(fā)血小板減少癥(HIT)表明其存在安全性問題。尋找更有效的抗凝、抗栓制劑已成為當今心血管藥物研究領(lǐng)域的主要研究方向之一。
水蛭始載于《(神農(nóng)本草經(jīng)》，千百年來，水蛭一直是祖國醫(yī)學中重要的活血化瘀藥，具有破血、逐瘀、通經(jīng)作用。從水蛭及唾液腺中分離提純出的活性成分—水蛭素(hirudin)是由65-66個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)。水蛭素對凝血酶有極強的抑制作用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強的凝血酶天然特異抑制劑。動物試驗與臨床研究表明，水蛭素具有高效的抗凝血、抗血栓形成活性，以及防止凝血因子活化和血小板反應等發(fā)生的功能。與傳統(tǒng)的抗凝血酶分子相比，水蛭素具有專一性強，用量小，療效顯著以及無明顯毒副作用；不依賴于體內(nèi)抗凝血酶III，對因遺傳或后天原因缺乏抗凝血酶III的病人同樣有效；分子量小，不具有免疫原性等優(yōu)點，成為優(yōu)于肝素的理想抗凝抗血栓制劑，可用于各種血栓性疾病的預防和治療，在現(xiàn)代醫(yī)藥學中具有廣闊的應用前景。
DNA改組(DNA shuffling)技術(shù)是20世紀90年代中期發(fā)展起來的一種分子水平上的體外定向進化技術(shù)，它使得進化速度較常規(guī)的定向進化大大加快，同時比隨機誘變顯著地提高了良性突變的概率。通過基因在分子水平上的有性重組，改變基因或基因家族原有的核苷酸序列，增加基因的多樣性，并賦予表達產(chǎn)物以新功能。該技術(shù)已在基礎(chǔ)研究、生物制藥、工業(yè)酶改造等方面取得巨大成功，被譽為定向進化的技術(shù)革命。DNA改組最初采用單個基因進行，其缺點是改組文庫中有意義的重組體較少。自然界中存在許多物種來源不同、基因序列有所差異但功能相似的基因家族。采用這些基因家族進行改組事實上就是在體外模擬達爾文進化的過程，大大提高了體外進化的效率，DNA家族改組(DNA family shuffling)已逐漸成為DNA改組的主要方法。
DNA改組的效果必須由改組后的基因表達產(chǎn)物的功能來驗證。因此，靈敏可靠的選擇或篩選方法是DNA改組技術(shù)成功與否的關(guān)鍵。噬菌體表面展示(phage display)是一種用于篩選和改造功能性多肽的生物技術(shù)。其基本原理主要是利用某些單鏈絲狀噬菌體如M13、fd等感染的可分泌特性，以及將外源基因插入這些噬菌體外膜蛋白PIII的末端構(gòu)成融合蛋白時，既不影響噬菌體的感染特性，同時保留外源基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和生物學功能的性質(zhì)，使外源基因在噬菌體表面有效地表達，并可通過測定噬菌體單鏈DNA順序推導出所融合外源基因的氨基酸序列。該技術(shù)的最大優(yōu)點是實現(xiàn)了基因型和表型的轉(zhuǎn)換，利用其配體的特異性親和力，可對蛋白質(zhì)或多肽進行高效率的篩選。
天然水蛭素來源匱乏，產(chǎn)量有限，限制了其臨床應用；再加之水蛭素有多種變異體，以前的研究工作每次只能對某一種水蛭素變異體進行重組表達，無法實現(xiàn)對多個變異體同時進行快速進化，以進一步提高水蛭素編碼蛋白的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，應用基因工程技術(shù)，提供一種高活性凝血酶抑制劑的制備方法，該方法首先對改造對象進行DNA家族改組，獲得多樣性的改組基因，構(gòu)建噬菌體展示的改組文庫，經(jīng)凝血酶親和淘選及ELISA篩選，獲得高親和力的噬菌體克隆，對所得克隆的表達產(chǎn)物的活性進行檢測，由此獲得高活性的凝血酶抑制劑。
實現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)解決方案是一種高活性凝血酶抑制劑的制備方法，按下述步驟進行1)根據(jù)凝血酶抑制劑的基因序列，選擇水蛭素HV1、HV2、HV3作為改造對象，采用分段合成寡核苷酸片段，互補寡核苷酸片段退火配對后，經(jīng)PCR擴增而獲得目的基因。
2)取等量的上述3種純化后的PCR產(chǎn)物，用DNaseI消化，回收50bp左右片段，經(jīng)無引物PCR進行隨機組裝，有引物PCR擴增，回收目的片段，獲得水蛭素的DNA家族改組基因。
3)將DNA家族改組基因定向克隆入經(jīng)SfiI和NotI雙酶切的噬菌體表達載體pCANTAB5E中，轉(zhuǎn)化E.coli TG1細胞，加入M13KO7輔助噬菌體進行超感染，獲得水蛭素的噬菌體改組文庫。
4)以凝血酶為包被抗原，對噬菌體改組庫進行3輪“吸附、洗脫、擴增”的篩選，隨著包被抗原濃度的不斷降低，洗滌次數(shù)及洗滌力度的不斷加強，改組文庫中凝血酶特異的水蛭素突變體得到了有效富集。
5)擴增第3輪篩選所得的噬菌體克隆，用ELISA鑒定各噬菌體單克隆與凝血酶的結(jié)合活性，獲得能與凝血酶產(chǎn)生高親和力結(jié)合的陽性克隆。
6)將ELISA篩選出的陽性噬菌體感染HB2151，加入IPTG誘導表達，提取菌體的周質(zhì)提取液，經(jīng)HiTrap Anti-E Tag親和純化柱進行純化，ChromozymTH為發(fā)色底物，測定其水蛭素變異體抑制凝血酶的活性，得到高活性的凝血酶抑制劑。
采用本發(fā)明所制備的高活性凝血酶抑制劑具有以下優(yōu)點1)抗凝血酶活性更強，療效顯著；2)分子量小，不具有免疫原性；3)安全，無明顯毒副作用。
本發(fā)明可望為各種血栓性疾病的預防和治療提供一種更為有效的新型制劑。


圖1是本發(fā)明的高活性凝血酶抑制劑的制備流程圖。
圖2是表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和western blot鑒定。
具體實施例方式
1.目的基因的合成(1)水蛭素基因及PCR引物的設(shè)計根據(jù)水蛭素HV1、HV2、HV3的氨基酸序列，設(shè)計3個基因的編碼序列及PCR引物序列，水蛭素基因均分為8個單鏈核苷酸片段，DNA合成由上海生工生物工程公司完成。各基因及相應PCR引物的序列如下①HV1基因序列1tatgcggcccagccggccgttgtttacactgactgtactgaatctggtcaaaacttgtgt61 ttgtgtgaaggttctaacgtttgtggtcaaggtaacaagtgtatcttgggttctgacggt121 gaaaagaaccaatgtgttactggtgaaggtactccaaagccacaatctcacaacgacggt181 gacttcgaagaaattccagaagaatacttgcaagcggccgcaggtPCR正向引物5′-tag cgg ccc agc cgg ccg ttg ttt aca ct(SfiI)PCR反向引物5′-actgcg gcc gct tgc aag ta(NotI)PCR正向引物及反向引物的5’端分別帶有SfiI和NotI酶切位點。
②HV2基因序列1tatgcggcccagccggccattacttacactgattgtacagaatcgggtcaaaatttgtgc61 ctctgcgagggaagcaatgtttgcggtaaaggcaataagtgcatattgggttctaatgga121 aagggcaaccaatgtgtcactggcgaaggtacaccgaaccctgaaagccataataacggc181 gatttcgaagaaattccagaagaatatttacaagcggccgcaggtPCR正向引物5′-tag cgg ccc agc cgg cca tta ctt aca ct(SfiI)PCR反向引物5′-actgcg gcc gct tgt aaa ta(NotI)PCR正向引物及反向引物的5’端分別帶有SfiI和NotI酶切位點。
③HV3基因序列1tatgcggcccagccggccatcacctacactgactgtaccgaatctggtcaaaacttgtgt61 ttgtgtgaaggttctaacgtttgtggtaagggtaacaagtgtatcttgggttctcaaggt121 aaggacaaccaatgtgttactggtgaaggtactccaaagccacaatctcacaaccaaggt
181 gacttcgaaccaatcccagaagacgcttacgatgaagcggccgcaggtPCR正向引物5′-tag cgg ccc agc cgg cca tca cct aca ct(SfiI)PCR反向引物5′-actgcg gcc gct tca tcg ta(NotI)PCR正向引物及反向引物的5’端分別帶有SfiI和NotI酶切位點。
(2)寡核苷酸片段的5’羥基磷酸化對化學合成的核苷酸片段進行磷酸化反應，20μL反應體系組成如下寡核苷酸200pmol，10×反應緩沖液2μL，ATP(1mmol/L)1μL，T4多聚核苷酸酸激酶2μL。37℃水浴60min，70℃保溫10min中止反應。
(3)互補寡核苷酸片段的退火配對將等摩爾的磷酸化的互補寡核苷酸片段在80μL終體積退火緩沖液中混合，95℃水浴保溫5min，70℃保溫10min，然后緩慢冷卻至室溫，將此退火混合物用乙醇沉淀備用。
(4)PCR擴增目的基因退火產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接后作為模板，以相應的PCR引物按如下參數(shù)進行PCR擴增94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸50s，共進行30個循環(huán)。擴增的PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中進行電泳，回收的目的基因克隆入pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒送北京三博遠志生物技術(shù)公司測序。所得的水蛭素基因HV1、HV2、HV3與射擊序列一致。
2.水蛭素基因的DNA家族改組(1)DNaseI消化在100μl體系中(40mmol/L Tris-HCl pH7.5，8mmol/L MgCl2，5mmol/LDTT)，加入純化后的3種基因PCR產(chǎn)物各約1μg，0.5U DNaseI，15℃反應30min，95℃10min終止。產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下50bp左右片段，用DNA小片斷回收試劑盒回收。
(2)DNA改組①無引物PCR隨機組裝于50μL PCR體系中加入約1μg DNaseI消化后的回收片段，2.5U Taq酶，94℃預變性3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，45個循環(huán)，72℃延伸5min。
②有引物PCR擴增將無引物PCR產(chǎn)物1∶50稀釋進行有引物PCR，100μL PCR體系加入引物(HF、HR)至0.5mmol/L，2.5U Taq，2.5μL無引物PCR產(chǎn)物，94℃預變性3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s，35個循環(huán)，72℃延伸5min。從第2輪PCR產(chǎn)物中電泳回收目的片段，獲得水蛭素的DNA家族改組基因。
HF引物5′-cct ttc tatgcg gcc cag ccg gcc(SfiI)HR引物5′-acc ggc gca cctgcg gcc gc(NotI)3.水蛭素噬菌體改組庫的構(gòu)建用SfiI和NotI酶切改組基因片段，與經(jīng)同樣雙酶切的pCANTAB5E載體在T4 DNA連接酶作用下進行連接。純化的連接產(chǎn)物經(jīng)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliTG1。取少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化菌梯度稀釋后鋪板，計數(shù)菌落，測定庫容。其余的菌液涂于SOBAG平板，30℃培養(yǎng)24h。用2×YT培養(yǎng)基收集細菌集落，取一部分懸于10mL 2×YTAG培養(yǎng)基中，調(diào)整至A600約為0.3，37℃，250r/min振蕩培養(yǎng)1h。加入5×1010pfu的M13KO7輔助噬菌體進行超感染，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1h，離心，菌體重懸于2×YTAK培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，次日離心收集上清，加入1/5體積的PEG/NaCl溶液沉淀噬菌體，冰浴1h，離心棄上清，以2×YT溶解沉淀，瞬時離心，上清即為噬菌體改組庫，0.45μm濾膜過濾后于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.噬菌體改組庫的親和淘選(1)凝血酶的包被PBS稀釋凝血酶(Sigma產(chǎn)品，T-4648)為20mg/L，將凝血酶溶液加到90mm塑培養(yǎng)皿中，置濕盒中于4℃包被過夜。棄包被液，加入5g/L BSA室溫封閉2h。
(2)噬菌體親和淘選封閉的培養(yǎng)皿經(jīng)PBS/Tween 20洗滌3次，加入改組噬菌體庫于室溫輕搖吸附2h。經(jīng)Tween 20濃度為1mL/L的PBST洗板10次，加洗脫緩沖液(0.2mol/L HCl/Gly，pH2.2)室溫解離15min，再加入中和緩沖液(1mol/LTris·HCl，pH9.1)中和。加入當日培養(yǎng)的E.coli TG1菌液10mL，37℃緩搖吸附30min進行感染，取10μl測定cfu，其余菌液繼續(xù)培養(yǎng)至1h，離心，菌體重懸至2×YTAK中。37℃ 250r/min振蕩培養(yǎng)12-16h，PEG/NaCl溶液沉淀噬菌體，溶于PBS緩沖液中，并經(jīng)0.45μm的濾膜過濾除菌。取1μL重組噬菌體溶液測定擴增后的滴度，進行下一輪淘選。
第2輪淘選將10mg/L的凝血酶包被在培養(yǎng)皿中，加入經(jīng)PBSM封閉的噬菌體抗體庫，于室溫下反應2h，倒出噬菌體溶液，用Tween 20濃度為3mL/L的PBST洗板15次，再用PBS洗滌酶標板20次。加入洗脫緩沖液以洗脫噬菌體抗體，經(jīng)中和緩沖液溶液中和，測定回收率并擴增噬菌體。
第3輪分別重復第2輪。但為了富集特異結(jié)合的噬菌體，適當降低凝血酶的濃度(5mg/L)和所投入的噬菌體庫的量，將PBST中Tween 20的濃度加大為5mL/L，洗板20次，第3輪淘選得到的噬菌體測定滴度，保留菌落。
經(jīng)3輪噬菌體親和淘選，噬菌體回收率呈一個增加的趨勢，第3輪比第1輪增加了約57.2倍(表1)，表明特異結(jié)合的噬菌體得到有效富集。
表1噬菌體改組庫的富集

5.用ELISA法篩選陽性噬菌體取PBS稀釋凝血酶0.25mg/L 100μL/孔包被酶標板，4℃靜置過夜。棄包被液，20g/L脫脂奶粉的PBSM 200μl室溫封閉1h。洗滌包被板，將親和淘選所得到的單克隆噬菌體與PBSM等體積含混合，室溫孵育30min，96孔板中每孔加入100μL，37℃孵育2h。PBST洗滌6遍，加入稀釋后的HRP-M13mAb，37℃孵育1h，PBST洗滌6遍后，加入OPD顯色，測定A492值，篩選陽性噬菌體(表2)。將ELISA測定值較高的陽性克隆，送交北京三博遠志生物技術(shù)有限公司進行測序。
表2噬菌體克隆的ELISA測定值(A492)

6.水蛭素變異體的表達、純化挑選ELISA測定值較高的克隆噬菌體感染HB2151，鋪板后，挑取單克隆接種到2×YTAG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心，菌體重懸于2×YT培養(yǎng)基中，加人IPTG至1mmol/L誘導表達4h，收集菌體，重懸于100uL的周質(zhì)提取液(1g/L溶菌酶，200g/L蔗糖，1mmol/L EDTA，30mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，冰上放置10min，離心，棄沉淀，上清為周質(zhì)蛋白混合液，經(jīng)HiTrapAnti-E Tag親和純化柱進行純化。
7.水蛭素變異體蛋白水平的檢測將純化的表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色后，在相對分子量約10kD處出現(xiàn)了一條表達帶，為PIII signal-hirudin-E tag融合蛋白。表達蛋白用HRP-anti E-tag抗體作Western blot分析，發(fā)現(xiàn)在相對分子量10kD處有一條清晰的顯色條帶(附圖2)，說明水蛭素在E.coli HB2151中實現(xiàn)了可溶性表達。
8.水蛭素抗凝血酶活性分析從第3輪淘選得到的變異體中挑選ELISA測定值較高的1號、3號、8號、10號和13號克隆經(jīng)DNA測序，確定變異體的突變位點，并在大腸桿菌HB2151中誘導表達，表達產(chǎn)物純化后，以Chromozym TH為發(fā)色底物，于405nm波長下測定其水蛭素變異體抑制凝血酶的活性，計算各水蛭素變異體的相對活性(表3)。
表3水蛭素變異體及其抗凝血酶活性

*ΔA405＝A405(pCANTAB 5E-HV)-A405(pCANTAB 5E).
水蛭素抗凝血酶活性分析結(jié)果顯示，10號克隆相對活性高于野生型水蛭素HV2，3號活性略有下降，1、8、13號的相對活性下降較明顯，表明經(jīng)DNA家族改組可獲得較野生型抗凝血酶活性更強的水蛭素變異體HV2-N47K，其相應的DNA及氨基酸序列如下1attacttacactgattgtacagaatcgggtcaaaatttgtgcctctgcgagggaagcaatI T Y T D C T E S G Q N L C L C E G S N61 gtttgcggtaaaggcaataagtgcatattgggttctaatggaaagggcaaccaatgtgtcV C G K G N K C I L G S N G K G N Q C V121 actggcgaaggtacaccgaaacctgaaagccataataacggcgatttcgaagaaattccaT G E G T P K P E S H N N G D F E E I P181 gaagaatatttacaaE E Y L Q凝血酶抑制劑改造對象還可采用水蛭素變異體HV1、HV2、HV3、HM1及HM2中的任意一種基因，或者水蛭素變異體HV1、HV2、HV3與HM1或HM2中任意一種基因或兩種基因的混合物，或者山蛭素、theromin或haemadin之一，或水蛭素與上述3種分子之一、之二或全部的混合物，均可按照上述方法制備高活性的凝血酶抑制劑。
權(quán)利要求
1.一種高活性凝血酶抑制劑的制備方法，其特征在于按下述步驟進行1)根據(jù)凝血酶抑制劑的基因序列，選擇水蛭素HV1、HV2、HV3作為改造對象，采用分段合成寡核苷酸片段，互補寡核苷酸片段退火配對后，經(jīng)PCR擴增而獲得目的基因。2)取等量的上述3種純化后的PCR產(chǎn)物，用DNaseI消化，回收50bp左右片段，經(jīng)無引物PCR進行隨機組裝，有引物PCR擴增，回收目的片段，獲得水蛭素的DNA家族改組基因。3)將DNA家族改組基因定向克隆入經(jīng)SfiI和NotI雙酶切的噬菌體表達載體pCANTAB5E中，轉(zhuǎn)化E.coli TG1細胞，加入M13K07輔助噬菌體進行超感染，獲得水蛭素的噬菌體改組文庫。4)以凝血酶為包被抗原，對噬菌體改組庫進行3輪“吸附、洗脫、擴增”的篩選，隨著包被抗原濃度的不斷降低，洗滌次數(shù)及洗滌力度的不斷加強，改組文庫中凝血酶特異的水蛭素突變體得到了有效富集。5)擴增第3輪篩選所得的噬菌體克隆，用ELISA鑒定各噬菌體單克隆與凝血酶的結(jié)合活性，獲得能與凝血酶產(chǎn)生高親和力結(jié)合的陽性克隆。6)將ELISA篩選出的陽性噬菌體感染HB2151，加入IPTG誘導表達，提取菌體的周質(zhì)提取液，經(jīng)HiTrap Anti-E Tag親和純化柱進行純化，ChromozymTH為發(fā)色底物，測定其水蛭素變異體抑制凝血酶的活性，得到高活性的凝血酶抑制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的高活性凝血酶抑制劑的制備方法，其特征在于，所述凝血酶抑制劑改造對象可采用水蛭素變異體HV1、HV2、HV3、HM1及HM2中的任意一種基因。
3.如權(quán)利要求1所述的高活性凝血酶抑制劑的制備方法，其特征在于，所述凝血酶抑制劑改造對象可采用水蛭素變異體HV1、HV2、HV3與HM1或HM2中任意一種基因或兩種基因的混合物。
4.如權(quán)利要求1所述的高活性凝血酶抑制劑的制備方法，其特征在于，所述凝血酶抑制劑改造對象可采用山蛭素、theromin或haemadin之一，或水蛭素與上述3種分子之一、之二或全部的混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高活性凝血酶抑制劑的制備方法，以凝血酶的天然特異抑制劑水蛭素為改造對象，應用DNA家族改組技術(shù)，將水蛭素HV1、HV2、HV3基因進行改組，構(gòu)建水蛭素噬菌體展示的改組文庫，以凝血酶為包被抗原，對噬菌體改組庫進行3輪“吸附、洗脫、擴增”的富集淘選，再經(jīng)ELISA篩選得到多個與凝血酶具有高親和力的噬菌體單克隆。對這些克隆進行原核誘導表達，檢測純化表達產(chǎn)物的抗凝血酶活性，獲得抗凝血酶活性較天然的水蛭素更強的水蛭素蛋白。采用本發(fā)明所制備的高活性凝血酶抑制劑具有以下優(yōu)點1)抗凝血酶活性更強，療效顯著；2)分子量小，不具有免疫原性；3)安全，無明顯毒副作用。
文檔編號A61P7/00GK1840187SQ20061004172
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月25日
發(fā)明者龍銦, 劉家云, 劉莉, 王宗仁 申請人:龍銦, 劉家云