本發(fā)明涉及酶及其編碼的基因與應用，特別涉及一種皺紋盤鮑的基因工程表達，具體涉及一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶hdhcu/znsod及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
：超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)是一類廣泛存在動植物以及微生物體內(nèi)的酸性金屬酶。根據(jù)不同的金屬輔基又可分為銅鋅超氧化物歧化酶(cu/znsod)、錳超氧化物歧化酶(mnsod)、鐵超氧化物歧化酶(fesod)和鎳超氧化物歧化酶(nisod)。其在體內(nèi)的作用是清除外源性和內(nèi)源性物質(zhì)引起的自由基、抑制脂質(zhì)過氧化和延緩機體衰老等，起到保護生物體的效果。能催化h2o2形成水和氧氣，表現(xiàn)出一定的抗氧化能力來清除羥氧自由基等活性氧。其具有一定的清除體內(nèi)自由基的能力，可作為添加劑、營養(yǎng)強化劑以及保鮮劑等用途應用于化妝品、食品、醫(yī)藥等行業(yè)。皺紋盤鮑(h.discushannaiino)隸屬于軟體動物門(mollusca)、腹足綱(gastropoda)、前鰓亞綱(prosobranchia)、原始腹足目(archaeogastropoda)、鮑科(haliotidae)，以其豐富的營養(yǎng)價值在民間一直被認為是與魚翅、燕窩齊名的營養(yǎng)食品。目前，已有的對鮑藥用及食用價值的研究主要集中在多肽與多糖的提取制備及其生物活性研究。海洋生物因其特殊的生活環(huán)境和代謝方式，體內(nèi)存在許多具有藥用價值的特殊生理活性物質(zhì)，是開發(fā)新型海洋藥物和功能食品的重要資源。福建省皺紋盤鮑資源豐富、產(chǎn)量大，至2013年，鮑產(chǎn)量達到88470t，所占比例超過全國產(chǎn)量的80％。鮑產(chǎn)業(yè)已成為福建省海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一，也是水產(chǎn)業(yè)增長速度最快、經(jīng)濟效益最好的產(chǎn)業(yè)。如何充分高效地利用鮑資源，挖掘其中的生物活性物質(zhì)往保健食品和海洋藥物方向高值化利用，符合我省和我國當今新興的海洋戰(zhàn)略發(fā)展研究。由于生物體內(nèi)天然sod含量極低，直接分離提取工藝相對復雜；而化學合成成本過高且難以保持其天然結(jié)構(gòu)?；蚬こ桃约暗鞍踪|(zhì)工程的應用為獲得天然活性肽開辟了有效途徑?；蚬こ讨苽渖锘钚噪目朔酥苯訌膭?、植物原料中提取抗氧化肽篩選水解酶類的盲目性，純化工藝簡單，便于規(guī)?；a(chǎn)，具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供皺紋盤鮑超氧化物歧化酶hdhcu/znsod的制備方法以其在制備食品添加劑和化妝品等領(lǐng)域的應用。具體而言，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一方面，本發(fā)明提供了一種編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因，含有seqidno.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因：(a)由seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，用于所述基因擴增的引物如seqidno.3和seqidno.4所示。本發(fā)明還提供了一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶，含有以上所述的編碼超氧化物歧化酶的基因所編碼。本發(fā)明也提供了一種表達皺紋盤鮑超氧化物歧化酶基因的載體，所述載體為含有權(quán)利要求1所述的超氧化物歧化酶基因、aox1啟動子和終止子序列、多克隆位點以及篩選標志的畢赤酵母表達載體，所述畢赤酵母表達載體優(yōu)選為ppic9k。優(yōu)選的，以上所述的載體中，所述超氧化物歧化酶基因位于畢赤酵母表達載體ppic9k的多克隆位點處ecorⅰ和notⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點之間。優(yōu)選的，以上所述的載體中，所述篩選標志為6×his-tag標簽。本發(fā)明同時還提供了一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的制備方法，包括以下步驟：(1)構(gòu)建含有編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因的重組表達載體；(2)將步驟(1)所得重組表達載體導入宿主細胞，并將宿主細胞進行誘導表達，獲得可表達皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因工程菌菌株；(3)發(fā)酵培養(yǎng)已得到的基因工程菌菌株并進行誘導表達，獲得表達產(chǎn)物；(4)分離純化步驟(3)所得的表達產(chǎn)物，獲得重組蛋白，皺紋盤鮑超氧化物歧化酶；其中，步驟(1)中所述編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因，含有seqidno.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因：(a)由seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，以上所述的制備方法中，步驟(1)中，所述表達載體為畢赤酵母表達載體，優(yōu)選為ppic9k。優(yōu)選的，以上所述的制備方法中，步驟(2)中，所述宿主細胞為畢赤酵母gs115菌株。優(yōu)選的，以上所述的制備方法中，步驟(3)中，所述分離純化為先將表達產(chǎn)物進行離心，收集發(fā)酵上清液，透析后，再進行親和層析。優(yōu)選的，以上所述的制備方法中，步驟(4)中，所述分離純化為親和層析法純化。本發(fā)明另外還提供了以上所述的皺紋盤鮑超氧化物歧化酶在食品添加劑、藥物制備領(lǐng)域或者化妝品領(lǐng)域中的應用。優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的應用，所述食品添加劑為動物飼料添加劑，所述皺紋盤鮑超氧化物歧化酶和動物血液的溶血率小于6％。優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的應用，所述皺紋盤鮑超氧化物歧化酶相對于pbs溶液，對于正常細胞的存活率維持在80％-110％之間。優(yōu)選的，根據(jù)以上所述的應用，所述皺紋盤鮑超氧化物歧化酶能夠保護和修復過氧化氫引起的細胞損傷。本發(fā)明所取得的有益效果是：本發(fā)明借助基因工程技術(shù)，利用ppic9k畢赤酵母表達載體，成功高效得在體外表達了可溶的、易純化分離的、具有抗氧化活性的皺紋盤鮑hdhcu/znsod，該重組蛋白具有很強的清除超氧陰離子自由基、羥自由基等活性。皺紋盤鮑hdhcu/znsod的基因工程表達產(chǎn)品將在制備食品添加劑和化妝品等領(lǐng)域中發(fā)揮其應用價值。附圖說明圖1為pcr擴增hdhcu/znsod目的基因片段。m為dnamarkerdl2000，其中標號1為hdhcu/znsod基因pcr產(chǎn)物，bp為堿基。圖2為sds-page電泳分析ppic9k-hdhcu/znsod重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115菌株后，hdhcu/znsod蛋白的誘導表達圖，其中m為預染蛋白marker26616，標號1-7為重組表達載體ppic9k-hdhcu/znsod轉(zhuǎn)化畢赤酵母后，甲醇誘導0h，6h，12h，24h，48h，72h，96h蛋白表達產(chǎn)物。圖3為sds-page電泳分析不同甲醇濃度誘導下hdhcu/znsod蛋白的表達圖，其中m為預染蛋白marker26616，標號1-4分別為0.5％體積、1％體積、2％體積、3％體積甲醇濃度誘導下hdhcu/znsod蛋白的表達條帶。圖4為不同ph條件下hdhcu/znsod的表達圖，其中m為預染蛋白marker26616，標號1-5分別ph為4，5，6，7，8時hdhcu/znsod蛋白的表達條帶。圖5為sds-page電泳分析純化前后hdhcu/znsod的表達圖，其中m為預染蛋白marker26616，標號1-4分別為純化前hdhcu/znsod蛋白的表達條帶，標號5-8為純化后hdhcu/znsod蛋白的表達條帶。圖6為hdhcu/znsod蛋白在不同體積分數(shù)的cu離子濃度下的酶活圖。圖7為hdhcu/znsod蛋白在不同溫度下的熱穩(wěn)定性效果圖。圖8為不同濃度的hdhcu/znsod蛋白清除超氧陰離子自由基能力測定結(jié)果圖。圖9為不同濃度的維生素c(vc)清除超氧陰離子自由基能力測定結(jié)果圖。圖10為不同濃度的hdhcu/znsod清除羥自由基能力測定結(jié)果圖。圖11為不同濃度的維生素c(vc)清除超氧陰離子自由基能力測定結(jié)果圖。圖12為l929細胞在不同濃度的hdhcu/znsod蛋白處理下的細胞存活率圖。圖13為l02細胞在不同濃度的hdhcu/znsod蛋白處理下的細胞存活率圖。圖14為馬血在不同濃度的hdhcu/znsod蛋白處理下的溶血率圖。圖15為l929細胞在不同濃度的過氧化氫處理的hdhcu/znsod蛋白作用下的細胞存活率圖。圖16為l02細胞在不同濃度的過氧化氫處理的hdhcu/znsod蛋白作用下的細胞存活率圖。圖17為實施例1構(gòu)建的ppic9k-hdhcu/zn重組表達載體圖。具體實施方式如上所述，本發(fā)明的目的在于提供一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶，其可以在體外表達，而且易于分離純化，具有很強的清除超氧陰離子自由基、羥自由基等活性，而且具有細胞安全性和損傷修復和保護功能，可以用作食品添加劑、藥物制備以及化妝品或者保健品等領(lǐng)域。本發(fā)明通過借助基因工程技術(shù)，提供了一種編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因，含有seqidno.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因：(a)由seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的皺紋盤鮑超氧化物歧化酶包括在seqidno.2所示的氨基酸基礎上，進行一個或者幾個，優(yōu)選10個以內(nèi)的氨基酸的取代、缺失或者增加，本領(lǐng)域技術(shù)人員應該知曉，幾個氨基酸的取代、缺失或者增加并不影響蛋白質(zhì)整體的功能。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述皺紋盤鮑超氧化物歧化酶，具有seqidno.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明借助基因工程手段，提供了一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的制備方法，具體通過借助畢赤酵母表達載體，將編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因構(gòu)建到該載體中，然后導入宿主細胞，篩選可以表達皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的工程菌菌株，然后進行發(fā)酵培養(yǎng)，并進行誘導表達，純化后得到該蛋白。其中，在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的制備方法，包括以下步驟：(1)：構(gòu)建皺紋盤鮑hdhcu/znsod的畢赤酵母表達載體；(2)：將步驟(1)所得畢赤酵母表達載體導入宿主細胞，并將宿主細胞進行誘導表達，獲得可表達hdhcu/znsod的基因工程菌菌株；(3)：發(fā)酵培養(yǎng)已得到的基因工程菌菌株并進行誘導表達，獲得表達產(chǎn)物；(4)：分離純化步驟(3)所得的表達產(chǎn)物，獲得重組蛋白，即hdhcu/znsod。以下通過實施例結(jié)合附圖詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該知曉的，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，而不應看做是對本發(fā)明保護范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎上，可以進行常規(guī)手段置換，或者在本發(fā)明所構(gòu)建的編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶基因的基礎上，進行基因的添加的取代、缺失或者添加等，并不影響或者基本不影響所表達的超氧化物歧化酶的蛋白活性。本發(fā)明實施例中所用到的試劑或者儀器，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的試劑或者儀器。本發(fā)明所用到的方法為分子生物學領(lǐng)域的常規(guī)方法。實施例1皺紋盤鮑hdhcu/znsod重組表達載體的構(gòu)建1)皺紋盤鮑hdhcu/znsod基因的獲得根據(jù)ppic9k載體多克隆位點，設計擴增編碼皺紋盤鮑hdhcu/znsod基因的特異性上游引物f1和下游引物r1。pcr擴增皺紋盤鮑hdhcu/znsod基因序列：在上游引物hdhcu/znsod-s的5`端加上ecoi酶切位點，在下游引物hdhcu/znsod-a的5`端添加noti酶切位點，終止密碼子和6×his組氨酸標簽：下游引物采用noti酶切位點：上游引物hdhcu/znsod-s序列如seqidno.3所示：5`ggggaattctctatcaaagcagtttgtg3`，其中seqidno.3序列中的第四個堿基到第九個堿基表示引入的ecoi酶切位點。下游引物hdhcu/znsod-a序列如seqidno.4所示：5`atgcggccgctcaatggtgatggtgatgatgcttggtgatgccgatca3`，其中，seqidno.4序列中的第三個堿基到第十個堿基表示引入的noti酶切位點，第十一個堿基到第十三個堿基表示終止密碼子，第十四個堿基到第三十一個堿基為6×his-tag序列。以皺紋盤鮑hdhcu/znsodcdna重組ppmd18-t陽性質(zhì)粒為擴增模板，分別以hdhcu/znsod-s和hdhcu/znsod-a為上、下游引物，以transstartfastpfudnapolymerase高保真酶(購自transgen公司)進行pcr，擴增目的基因片段，反應體系為：表1pcr反應體系無菌miliq水29μl5×buffer(含mg2+)10μldntps(2.5mmeach)4μlpmd18-t/hdhcu/znsod2μl上游引物hdhcu/znsod-s(10μm)2μl下游引物hdhcu/znsod-a(10μm)2μltransstartfastpfudnapolymerase(2.5u/μl)1μl總反應體積50μl混合均勻，在熱循環(huán)儀上按照以下程序進行pcr反應：皺紋盤鮑hdhcu/znsod基因pcr程序為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸40sec；進行30個循環(huán)后，72℃延伸5min。反應結(jié)束后，將所有反應液進行1.5％(w/v)瓊脂糖凝膠-tae電泳，用qiagen凝膠回收試劑盒回收特異性片段，得到皺紋盤鮑hdhcu/znsod基因pcr產(chǎn)物長度為499bp(參見圖1)。從圖1可以看出，回收得到的皺紋盤鮑hdhcu/znsod基因pcr產(chǎn)物長度為500bp左右，與理論值相符。取2μg上述回收的皺紋盤鮑hdhcu/znsod目的基因片段，用ecorⅰ和notⅰ限制性酶雙酶切(takara公司)，其中酶切體系見表2。37℃孵育8h，反應結(jié)束后，用1.5％(w/v)瓊脂糖凝膠-tae電泳檢測酶切效率；核酸共沉劑(takara公司)回收酶切后的hdhcu/znsod目的基因片段。處理后的hdhcu/znsod目的基因片段具有ecorⅰ和notⅰ的粘性末端。表2含目的基因的酶切體系10×h酶反應緩沖液12μl0.1％bsa12μlecorⅰ限制性內(nèi)切酶(15u/μl)2μlnotⅰ限制性內(nèi)切酶(10u/μl)2μl回收目的基因片段25μl無菌miliq水67μl總反應體積120μl2)ppic9k載體的處理將ppic9k(購自invitrogen公司)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞，然后涂板于含50μg/ml的氨芐霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆菌落，接種于5ml含50μg/ml的氨芐霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm/min培養(yǎng)8h至對數(shù)生長期，離心收集菌體，小量提取ppic9k質(zhì)粒。取3μg上述純化的ppic9k載體，用ecorⅰ和notⅰ限制性酶雙酶切，37℃孵育8h，酶切體系如表3所示；反應結(jié)束后，用0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠-tae電泳檢測酶切結(jié)果。然后用核酸共沉劑(d605a，購自takara公司)回收酶切后的載體。表3重組載體酶切體系10×h酶反應緩沖液12μl0.1％bsa12μlecorⅰ限制性內(nèi)切酶(15u/μl)2μlnotⅰ限制性內(nèi)切酶(10u/μl)2μlppic9k載體質(zhì)粒40μl無菌miliq水52μl總反應體積120μl利用表3中的酶切體系處理后的ppic9k載體具有ecorⅰ和notⅰ的粘性末端。3)ppic9k-hdhcu/znsod載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和鑒定將經(jīng)過一系列處理后具有ecorⅰ和notⅰ的粘性末端的ppic9k載體與具有相同粘性末端hdhcu/znsod的基因片段進行連接，反應體系如下：表4目的基因與載體連接體系ppic9k載體質(zhì)粒1μl目的基因片段4μlligationsolutionⅰ5μl總反應體積10μl將反應液置于16℃連接過夜，次日，取5μl連接反應液轉(zhuǎn)化至50μle.colidh5α感受態(tài)細胞中，涂布于含有氨芐霉素(50μg/ml)的lb瓊脂平板上培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落，以hdhcu/znsod-s和hdhcu/znsod-a為上下游引物，如前所述用pcr法鑒定陽性克隆菌，交由上海生工公司進行dna核苷酸序列測定。結(jié)果顯示連接正確，核苷酸的開放閱讀框(orf)連續(xù)編碼，得到ppic9k-hdhcu/znsod重組表達載體。如圖17所示，真核重組表達載體ppic9k-hdhcu/znsod的特點是采用aox1啟動子，酵母信號肽α-factor因子引導目的蛋白hdhcu/znsod的分泌表達，并在c端帶有6×his-tag便于親和層析純化目的蛋白。實施例2ppic9k-hdhcu/znsod重組質(zhì)粒在畢赤酵母gs115中的誘導表達1)ppic9k-hdhcu/znsod的線性化測序正確的含表達載體的菌株劃線培養(yǎng)，挑取單克隆搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，10μg質(zhì)粒由sacⅰ限制性內(nèi)切酶線性化，反應體系如下：表5重組質(zhì)粒線性化反應體系用核酸共沉劑回收線性化后的ppic9k-hdhcu/znsod。再將其用電擊法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母gs115感受態(tài)細胞中，并誘導表達。2)ppic9k-hdhcu/znsod的表達條件的優(yōu)化以ppic9k-hdhcu/znsod重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母gs115為實驗組，挑取單克隆菌株在10ml起始ph分別為4、5、6、7、8的生長培養(yǎng)基(bmgy)中培養(yǎng)約24h至對數(shù)生長期，離心收集菌體，轉(zhuǎn)入表達培養(yǎng)基(bmmy)中(注意，表達培養(yǎng)基的ph值與相應的生長培養(yǎng)基的ph值相同)，分別在培養(yǎng)液中添加甲醇，使得甲醇在培養(yǎng)基中的體積分數(shù)為2％，于恒溫培養(yǎng)箱中28℃、230rpm條件下培養(yǎng)96h。同時以ppic9k空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母gs115為對照。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)檢測不同起始ph下hdhcu/znsod蛋白的表達。sds-page電泳分析結(jié)果見圖4。以ppic9k-hdhcu/znsod重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母gs115為實驗組，挑取單克隆菌株在10ml起始ph為6的生長培養(yǎng)基(bmgy)中培養(yǎng)約24h至對數(shù)生長期，離心收集菌體，轉(zhuǎn)入表達培養(yǎng)基(bmmy)中，分別在培養(yǎng)液中添加甲醇，使得甲醇在培養(yǎng)基中的體積分數(shù)為0.5％體積、1％體積、2％體積、3％體積，于恒溫培養(yǎng)箱中28℃、230rpm條件下培養(yǎng)96h。同時以ppic9k空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母gs115為對照。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)檢測不同起始ph下hdhcu/znsod蛋白的表達。sds-page電泳分析結(jié)果見圖3。以ppic9k-hdhcu/znsod重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母gs115為實驗組，挑取單克隆菌株在10ml起始ph為6生長培養(yǎng)基(bmgy)中培養(yǎng)約24h至對數(shù)生長期，離心收集菌體，轉(zhuǎn)入表達培養(yǎng)基(bmmy)中，分別在培養(yǎng)液中添加甲醇，使得甲醇在培養(yǎng)基中的體積分數(shù)為2％，于恒溫培養(yǎng)箱中28℃、230rpm條件下培養(yǎng)0h、6h、12h、24h、48h、72h和96h。同時以ppic9k空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母gs115為對照。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)檢測不同起始ph下hdhcu/znsod蛋白的表達。sds-page電泳分析結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：通過誘導表達條件的優(yōu)化，在ph為6的條件下，利用0.5％甲醇在28℃、230rpm條件下誘導表達24h，在16kda位置出現(xiàn)2條蛋白質(zhì)條帶，與表達的目的蛋白hdhcu/znsod分子量相當。目的蛋白的表達量隨著時間的延長并沒有顯著變化，通過凝膠掃描計算得知，表達量達62mg/l。其中，生長培養(yǎng)基(bmgy)組成為：以重量百分數(shù)計，酵母提取物1％，蛋白胨2％,無氨基酵母氮源(ynb)1.34％,生物素(4×10-5)％和甘油1％，以及磷酸鉀緩沖液(ph6.0)100mmol/l。其中，表達培養(yǎng)基(bmmy)組成為：以重量百分數(shù)計，酵母提取物1％，蛋白胨2％，無氨基酵母氮源(ynb)1.34％,生物素(4×10-5)％和甲醇1％，以及磷酸鉀緩沖液(ph6.0)100mmol/l。實施例3親和層析法純化目的蛋白hdhcu/znsod1)上柱前樣品的制備重組畢赤酵母誘導表達24h后，離心去沉淀，收集發(fā)酵上清液。4℃，用pbs透析液(50mm磷酸緩沖液+50mmnacl，ph9.0)透析畢赤酵母誘導表達上清液2-3次，離心，收集上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，待上柱純化。2)親和層析純化目的蛋白hdhcu/znsod用鎳離子螯合親和層析柱親和純化，層析試劑為：溶液a：20mm磷酸緩沖液+50mmnacl+10mm咪唑，ph8.5；溶液b：20mm磷酸緩沖液+500mmnacl+1m咪唑，ph8.5；用5～10個柱體積milliq水清洗預裝柱(histraptmffcrude5ml)，5～10個柱體積溶液a平衡histrap層析柱(ge公司)，將過濾后的上清液以2ml/min全部上柱，同時收集流出組分；含40mm咪唑的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白；用50％溶液b(含500mm咪唑)洗脫目的蛋白hdhcu/znsod收集洗脫峰，取少量進行sds-page電泳鑒定(參見圖5)。將目的蛋白洗脫液裝入處理好的透析袋中，在磷酸鹽緩沖液中透析，最后透析入超純水中。結(jié)果顯示，分子量大小約16kda的hdhcu/znsod蛋白能夠特異性的與鎳離子螯合親和層析柱結(jié)合，在較高濃度的咪唑溶液(500mm)競爭洗滌后，融合表達產(chǎn)物被洗脫，純度較高。實施例4重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod活性的測定1)應用bradford法測定重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod的濃度取bsa儲液用1×pbs稀釋10倍，終濃度為0.5mg/ml；將0.5mg/mlbsa標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μl梯度加到96孔細胞培養(yǎng)板中，用1×pbs分別補足至20μl，每個濃度梯度設置3個平行樣；每孔加入200μlg250染色液，室溫放置3min；用酶標儀測定595nm波長處的吸光度；得到蛋白濃度標準曲線。應用bradford法測定bsa標準品得到的蛋白濃度標準曲線，根據(jù)公式可計算出重組表達蛋白的濃度。經(jīng)過計算，用bradford法計算純品的產(chǎn)量為17mg/l。2)重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod活性的測定①按照超氧化物歧化酶測試盒(貨號：a001-1羥胺法，廠家：南京建成生物科技有限公司)說明書中的描述測定重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod酶活。酶活力單位定義為：每毫克蛋白在1ml反應液中sod抑制率達50％時所對應的sod量為一個sod活力單位(u)。酶活力計算：分別在上述誘導表達培養(yǎng)基中加入cuso4，使得硫酸銅在培養(yǎng)基中的體積分數(shù)分別為0、0.2％、0.5％與1％，培養(yǎng)24h，比較純化后的重組蛋白hdhcu/znsod酶活。結(jié)果顯示：添加1％cuso4的培養(yǎng)基中sod酶活最強，達6471u/mg。②重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod的熱穩(wěn)定性測定將純化后的重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod分別置于不同溫度條件下(30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃)保溫10min，將其迅速冷卻置冰上，然后測定剩余酶活性。將最好的酶活力定義為100％，分別計算不同溫度條件下重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod的剩余酶活性與最高酶活性的比值。結(jié)果顯示：重組hdhcu/znsod蛋白在40℃左右酶活性最高，隨著溫度繼續(xù)升高，酶活性降低。3)重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod對超氧陰離子自由基的清除作用按照抗超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基測試盒(貨號：a052，廠家：南京建成生物科技有限公司)說明書中的描述測定重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod清除超氧陰離子能力，用vc做陽性對照。結(jié)果見圖8和圖9所示。結(jié)果表明，重組hdhcu/znsod具有很強的清除羥自由基能力，其清除羥自由基ic50約為0.0056mg/ml，對照vc清除羥自由基的ic50為0.09mg/ml。測定結(jié)果表明，本發(fā)明制備得到的超氧化物歧化酶蛋白具有很強的超氧陰離子自由基清除能力，其相當于陽性對照維生素c的16倍。4)重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod對羥自由基的清除作用按照羥自由基測定試劑盒(貨號：a018，廠家：南京建成生物科技有限公司)說明書中的描述測定重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod清除羥自由基能力，用維生素c(vc)做陽性對照。測定結(jié)果見圖10和圖11所示。圖10和圖11的結(jié)果表明，重組hdhcu/znsod具有很強的清除羥自由基能力，其清除羥自由基ic50約為0.079mg/ml，對照vc清除羥自由基的ic50為0.25mg/ml。測定結(jié)果表明，本發(fā)明制備得到的超氧化物歧化酶蛋白具有很強的羥自由基清除能力，其相當于陽性對照維生素c的3倍。本發(fā)明根據(jù)皺紋盤鮑hdhcu/znsod的cdna序列特征，構(gòu)建真核重組表達載體ppic9k-hdhcu/znsod，sacⅰ線性化后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115菌株，誘導表達并純化獲得hdhcu/znsod的重組蛋白，鑒定重組蛋白抗氧化活性，研究發(fā)現(xiàn)hdhcu/znsod蛋白具有清除超氧陰離子和羥自由基的活性。本發(fā)明旨在獲得皺紋盤鮑hdhcu/znsod的基因工程表達產(chǎn)品，并對其抗氧化活性進行測定，以期開發(fā)抗病原微生物的新藥物或作為動物飼料添加劑使用。本發(fā)明獲得了皺紋盤鮑hdhcu/znsod的畢赤酵母表達重組子ppic9k-hdhcu/znsod，并在畢赤酵母中成功重組表達獲得皺紋盤鮑hdhcu/znsod基因工程產(chǎn)品，確認了hdhcu/znsod的抗氧化活性，為其作為抗病原微生物新藥物和動物飼料添加劑的開發(fā)奠定了基礎。本發(fā)明進一步研究了通過本發(fā)明記載的方法得到的皺紋盤鮑hdhcu/znsod的安全性評價以及對h2o2引起的細胞過氧化損傷的修復功能評價。通過細胞水平的安全性評價結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員有理由相信，通過本發(fā)明得到的超氧化物歧化酶可以用作制備藥物，通過對細胞過氧化損傷的修復評價，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將本發(fā)明制備得到的超氧化物歧化酶用作動物飼料添加劑，并為后續(xù)的應用奠定良好的基礎。結(jié)果如下：實施例5重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod安全性評價(1)hdhcu/zn-sod對l929和l02細胞活性的影響1)hdhcu/zn-sod對l929細胞活性的影響利用l929細胞(小鼠成纖維細胞)檢測重組蛋白對于正常細胞的毒性作用。l929細胞是小鼠成纖維細胞，該成纖維細胞是疏松結(jié)締組織的主要細胞成分，細胞成梭形或者扁的星狀，具有突起，可作為皮膚細胞研究模型通過檢測重組蛋白對于l929細胞的毒性，評價對于皮膚細胞的毒性和保護作用。實驗過程中，分別制備不同濃度的hdhcu/zn-sod蛋白溶液，然后分別加入到培養(yǎng)好l929細胞(其中l(wèi)929細胞購自于上海微蒙酶聯(lián)試劑公司)在37℃，5％的co2細胞培養(yǎng)箱中孵育，使得孵育溶液中蛋白濃度分別為0，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml以及100μg/ml。共同孵育24h后測定細胞成活率，測定結(jié)果見圖13。圖12結(jié)果表明，不同濃度的hdhcu/zn-sod蛋白加入l929細胞共孵24h后，hdhcu/zn-sod蛋白對于l929細胞活性沒有影響。各濃度下細胞存活率維持在100％左右，經(jīng)統(tǒng)計學分析與對照組間均無顯著性差異；隨著孵育溶液中hdhcu/zn-sod蛋白濃度的增大，對于l929細胞沒有毒害作用。2)hdhcu/zn-sod對l02細胞活性的影響利用l02細胞(人正常肝臟細胞)檢測重組蛋白對于正常細胞的毒性作用。l02細胞是人體正常的肝臟細胞。通過檢測重組蛋白對于l02細胞的毒性，可以用來評價重組蛋白的肝臟毒性。實驗過程中，分別制備不同濃度的hdhcu/zn-sod蛋白溶液，然后分別加入到培養(yǎng)好的l02細胞(其中l(wèi)02細胞購自于中山大學)在37℃，5％的co2細胞培養(yǎng)箱中孵育，使得孵育溶液中蛋白濃度分別為0，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml以及100μg/ml。共同孵育24h后測定細胞成活率，測定結(jié)果見圖13。圖13結(jié)果表明，不同濃度的hdhcu/zn-sod蛋白加入到l02細胞共孵24h后，hdhcu/zn-sod蛋白對于l02細胞活性沒有影響。各濃度下細胞存活率維持在100％左右，經(jīng)統(tǒng)計學分析與對照組間均無顯著性差異；隨著孵育溶液中hdhcu-zn-sod蛋白濃度的增大對于l02細胞的活性基本沒有影響，對l02細胞沒有毒害作用。(2)hdhcu-zn-sod蛋白的溶血性實驗為了驗證通過本發(fā)明制備得到的hdhcu-zn-sod蛋白在動物飼料添加劑領(lǐng)域中的應用。將本發(fā)明制備得到的hdhcu-zn-sod蛋白與馬血進行溶血實驗。實驗過程如下：利用pbs溶液配制不同濃度的hdhcu/zn-sod蛋白，然后將等量的hdhcu/zn-sod蛋白與等量的4％的馬血(購自索萊寶)混合，使得hdhcu/zn-sod蛋白在復合溶液中的濃度分別為7.5μg/ml，15μg/ml，30μg/ml，60μg/ml，120μg/ml，240μg/ml，480μg/ml，以及960μg/ml。37℃靜止2h，之后用900g離心5min。取出200μl于96孔板上，用500nm的波長檢測。分別用1％tritonx-100和pbs作為陽性對照和陰性對照。每個樣品平行測定3次，經(jīng)統(tǒng)計學分析與對照組間均無顯著性差異，溶血率計算公式如下，實驗結(jié)果見圖14。溶血率(％)＝(樣品吸收-陰性對照吸收)/(陽性對照吸收-陰性對照吸收)×100％。圖14的結(jié)果表明，隨著hdhcu-zn-sod蛋白濃度的增大，該蛋白均未與馬血發(fā)生溶血現(xiàn)象，即便是在濃度為960μg/ml時，該蛋白對馬血的溶血率也低于6％。實施例6重組表達產(chǎn)物hdhcu/znsod對h2o2引起的細胞損傷的修復(1)hdhcu/zn-sod對h2o2引起的l929細胞損傷的保護作用分別用150μm的h2o2溶液配制不同濃度的hdhcu/zn-sod蛋白加入l929細胞共孵3h，使得孵育溶液中hdhcu/zn-sod蛋白的濃度分別為0，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，和100μg/ml，然后孵育3h，以等量的pbs作為陽性對照品，通過mts/pms法評價各濃度下細胞活性。結(jié)果見圖15所示。圖15研究結(jié)果顯示，用h2o2稀釋不同濃度的hdhcu/zn-sod蛋白加入l929細胞共孵3h后，與陽性對照組比較，隨著hdhcu/zn-sod蛋白濃度的增大，細胞存活率遞增，對h2o2引起的細胞損傷起到保護和修復作用，經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，在hdhcu/zn-sod蛋白濃度為25μg/ml、50μg/ml和50μg/ml時，與蛋白濃度為0μg/ml時相比，均表現(xiàn)出顯著性差異(p<0.05)。(2)hdhcu/zn-sod對h2o2引起的l02細胞損傷的保護作用分別用150μm的h2o2配制不同濃度的hdhcu/zn-sod蛋白加入l02細胞共孵3h，使得孵育溶液中hdhcu-zn-sod蛋白的濃度分別為0，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，和100μg/ml，然后孵育3h，以等量的pbs作為陽性對照品，通過mts/pms法評價各濃度下細胞活性。結(jié)果見圖16所示。圖16研究結(jié)果顯示，用h2o2稀釋不同濃度的hdhcu/zn-sod蛋白加入l02細胞共孵3h后，與陽性對照組比較，隨著hdhcu/zn-sod蛋白濃度的增大，細胞存活率遞增，對h2o2引起的細胞損傷能夠起到保護和修復作用。通過本發(fā)明的方法制備得到的hdhcu/zn-sod蛋白在濃度為0-100μg/ml范圍內(nèi)，對于l929細胞和l02細胞均未表現(xiàn)出細胞毒性，其中對于l929細胞存活率，相對于pbs溶液，經(jīng)統(tǒng)計學分析細胞存活率無顯著性差異；對于l02細胞存活率，相對于pbs溶液，經(jīng)統(tǒng)計學分析細胞存活率無顯著性差異。通過本發(fā)明的方法制備得到的hdhcu/zn-sod蛋白在濃度為0-960μg/ml范圍內(nèi)，未與馬血發(fā)生溶血現(xiàn)象，溶血率均小于6％。通過本發(fā)明的方法制備得到的hdhcu/zn-sod蛋白在濃度為0-100μg/ml范圍內(nèi)，對于過氧化氫引起的細胞損傷起到保護和修復作用?？傊?，通過本發(fā)明制備得到的hdhcu/zn-sod蛋白不僅表現(xiàn)出良好的酶活特性，而且在細胞水平表現(xiàn)出良好的安全性，同時未表現(xiàn)出溶血現(xiàn)象，可以將其作為動物飼料添加劑使用。而且能夠?qū)τ趆2o2引起的細胞損傷起到保護和修復作用，具有優(yōu)良的生物學活性。以上所述，僅是本發(fā)明實施的較佳實施例，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的修改、等同替換和改進等，均需要包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>福建省水產(chǎn)研究所<120>皺紋盤鮑超氧化物歧化酶及其制備方法和應用<130>oicn160108電<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>459<212>dna<213>皺紋盤鮑（haliotisdiscushannai）<400>1tctatcaaagcagtttgtgtgctgagaggtgattcggaagtcaagggaacagtattcttc60tcacagggagatgcagacagtccagtgaaagtgacgggctccatcacgggcctgacggag120ggcaaacatggcttccacgttcatcagttcggggacaacaccaatggctgtaccagtgca180gggtcccacttcaaccctttcggcaagacccatggagcgccagaagacgaaaacagacat240gctggtgaccttggcaacgttactgctgacgcatcaggagtagcaaacatcgacatcgag300gacaagatcataagtttgactggggacaaatcaatcattggcagaactattgttgtccat360gctggagtggatgacctgggcaagggaggcaatgaagaaagcctgaagacagggaacgct420ggtggtcgacaggcctgtggggtgatcggcatcaccaag459<210>2<211>153<212>prt<213>皺紋盤鮑（haliotisdiscushannai）<400>2serilelysalavalcysvalleuargglyaspsergluvallysgly151015thrvalphepheserglnglyaspalaaspserprovallysvalthr202530glyserilethrglyleuthrgluglylyshisglyphehisvalhis354045glnpheglyaspasnthrasnglycysthrseralaglyserhisphe505560asnpropheglylysthrhisglyalaprogluaspgluasnarghis65707580alaglyaspleuglyasnvalthralaaspalaserglyvalalaasn859095ileaspilegluasplysileileserleuthrglyasplysserile100105110ileglyargthrilevalvalhisalaglyvalaspaspleuglylys115120125glyglyasnglugluserleulysthrglyasnalaglyglyarggln130135140alacysglyvalileglyilethrlys145150<210>3<211>28<212>dna<213>人工序列<400>3ggggaattctctatcaaagcagtttgtg28<210>4<211>48<212>dna<213>人工序列<400>3atgcggccgctcaatggtgatggtgatgatgcttggtgatgccgatca48當前第1頁12