本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及棉花中一個(gè)具有抗氧化作用的谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx8基因及其在基因工程中的具體應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物在整個(gè)生育期中，會遭受各種生物脅迫和非生物脅迫的環(huán)境，各種脅迫因素最終造成植物體內(nèi)過量活性氧的積累，從而影響植物的生長發(fā)育。已有研究認(rèn)為，活性氧是植物新陳代謝過程中的一個(gè)副產(chǎn)物，在細(xì)胞信號傳遞和氧化還原平衡等過程中起著重要的作用。低濃度的活性氧在植物體內(nèi)可作為信號分子起作用，而高濃度的活性氧會對植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，會氧化胞內(nèi)組分如dna、蛋白和質(zhì)膜等生物大分子，從而影響植物生長發(fā)育，進(jìn)而降低作物的產(chǎn)量。

植物體在進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)以消除由活性氧產(chǎn)生的氧化損傷，維持活性氧動(dòng)態(tài)平衡。其中酶促系統(tǒng)包括各種過氧化酶家族，研究這些抗氧化基因的功能可以為提高植物抗逆性提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

植物gpxs基因能清除由于脅迫環(huán)境產(chǎn)生的過量的活性氧，其通常以trx作為還原劑，而不是gsh，因此被認(rèn)為其具有硫氧還蛋白過氧化物酶活性。有些植物gpxs同時(shí)表現(xiàn)谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白過氧化物酶的活性，但以硫氧還蛋白為底物，其酶活性較以谷胱甘肽為底物的活性高。但總體而言，由于gpxs基因及其對應(yīng)蛋白類型較多，作用過程較為復(fù)雜，因而尚需進(jìn)一步加以研究，以便為基因的具體應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

我國對原棉的需求日益加劇，但依靠擴(kuò)大耕地面積提高總產(chǎn)量是不現(xiàn)實(shí)的，我國有1億多畝地產(chǎn)鹽堿地，3億畝鹽堿荒地，60%~80%棉田在干旱和半干旱地區(qū)。由于棉花比其它作物相對較強(qiáng)的抗旱性和耐鹽堿性，生長過程中容易受到多種脅迫因素影響，因而生物體內(nèi)易于積累大量活性氧，而gpx家族具有清除活性氧，進(jìn)而抵御外界環(huán)境脅迫的能力。因而通過對棉花中g(shù)px基因研究，可以更清楚的了解棉花在生物和非生物脅迫下gpx蛋白家族所起的作用。進(jìn)而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育能夠抵御外界脅迫條件的棉花品種，對于我國棉花生產(chǎn)的長期穩(wěn)定發(fā)展有著十分重要的意義，本申請即是在此理念基礎(chǔ)上對相關(guān)基因進(jìn)行了探索性研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一個(gè)具有抗氧化作用的谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx8基因，通過對基因的克隆、轉(zhuǎn)化，進(jìn)而對該基因功能及其可能開發(fā)應(yīng)用前景提供參考。

本申請的技術(shù)方案詳述如下。

棉花谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx8基因，包含1491bp堿基，其堿基序列如seqidno.1所示。

棉花谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx8的基因編碼序列（即，棉花谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx8基因中的編碼框），包括501bp堿基，其堿基序列如seqidno.2所示。

棉花谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx8蛋白質(zhì)的氨基酸序列，包括166個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.3所示。

利用所述棉花谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx8基因的編碼序列所構(gòu)建的重組載體，其中含有棉花谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx8編碼序列的501bp堿基，包括pyes2-ghgpx8載體和p1300gfp-ghgpx8載體；其中pyes2-ghgpx8載體用于在酵母中表達(dá)ghgpx8，p1300gfp-ghgpx8載體用于在植物中表達(dá)ghgpx8。

重組載體p1300gfp-ghgpx8在棉花培育中的應(yīng)用，用于培育具有抗逆特性的棉花新品種。

所述棉花谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx8基因在棉花中的應(yīng)用，用于調(diào)節(jié)棉花的抗逆環(huán)境能力；具體而言，通過調(diào)控ghgpx8基因在棉花植株中的表達(dá)（通過超表達(dá)）來提高棉花對逆環(huán)境的抗性，從而用于培育具有抗氧化性能的抗氧化品系棉花新品種。

采用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，本申請創(chuàng)新性地對陸地棉（gossypiumhirsutum）中響應(yīng)逆境脅迫、參與抗氧化調(diào)節(jié)過程的谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，gpx）基因ghgpx8進(jìn)行了克隆。通過構(gòu)建含有ghgpx8基因的亞細(xì)胞定位載體p1300gfp-ghgpx8，再將該亞細(xì)胞定位載體轉(zhuǎn)化到擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)后，通過熒光定位，表明ghgpx8定位于擬南芥葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；進(jìn)一步通過構(gòu)建含有ghgpx8基因的酵母表達(dá)載體pyes2-ghgpx8，然后將該載體轉(zhuǎn)化缺陷型酵母δgpx3中，分析結(jié)果顯示ghgpx8酶具有清除酵母中活性氧的能力，可以增強(qiáng)缺陷型酵母在氧化環(huán)境中的生存能力，表明ghgpx8基因具有較好地抗氧化能力?；谶@些研究，再將ghgpx8基因超表達(dá)后，可為培育棉花抗氧化品種及提高棉花的抗逆境脅迫能力奠定較好地理論與應(yīng)用基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為采用dnaman軟件對ghgpx8蛋白與擬南芥atgpx6、水稻osgpx1和osgpx3、楊樹ptgpx3.1和ptgpx3.2蛋白進(jìn)行序列比對分析的示意圖；結(jié)果顯示ghgpx8具有g(shù)px酶的典型特征，含有g(shù)px酶保守的3個(gè)區(qū)域和保守的半胱氨酸催化位點(diǎn)；

圖2為ghgpx8系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；

圖3為qrt-pcr分析ghgpx8基因在棉花幼苗各組織和花中的表達(dá)模式；

圖4為對ghgpx8的亞細(xì)胞定位分析；

圖5為qrt-pcr分析ghgpx8基因在各種脅迫條件下的基因表達(dá)模式；其中ht-l和ht-r分別表示35℃處理棉花葉片和根系；fe-l和fe-r分別表示400mm的feso4處理棉花的葉片和根系；nacl-l和nacl-r分別表示400mm的nacl處理棉花的葉片和根系；aba-l和aba-r分別表示400μm的aba（脫落酸）處理棉花的葉片和根系；meja（茉莉酸甲酯）和sa（水楊酸）分別表示100μm的meja和500μm的sa處理棉花的葉片；

圖6為對ghgpx8的抗氧化功能分析；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將pyes2-ghgpx8轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母缺陷型突變體△gpx3中，增強(qiáng)了酵母對氧化環(huán)境的抗性，表明ghgpx8具有清除活性氧的能力，其中by4741為野生型酵母。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本申請做進(jìn)一步的解釋說明，在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中部分生物材料、實(shí)驗(yàn)試劑等問題簡要說明如下。

生物材料：

陸地棉（gossypiumhirsutum）為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供的陸地棉49野生型植株，培育方式為：棉花種子在28℃培養(yǎng)箱中避光催芽2天后，萌發(fā)的種子采用土培法（營養(yǎng)土：蛭石=2：1）于溫室中培養(yǎng)（28℃，16h光照/8h黑暗）；

pyes2載體購自invitrogen（英駿，美國）公司；

p1300gfp載體由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)郭巖教授實(shí)驗(yàn)室惠贈（也可采用其他商品化質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）；

引物合成及測序，由上海生工完成；

實(shí)驗(yàn)試劑：

pcr回收試劑盒，天根，北京；

dna提取試劑盒，吉賽爾，鄭州

dnasei，普洛麥格公司，美國；

rna提取試劑盒，天根，北京；

revertraaceqpcrrt試劑盒，東洋紡公司，日本；

pcr反應(yīng)使用高效taq酶easytaqdnapolymerase，全式金，中國；

實(shí)時(shí)熒光定量rcp反應(yīng)試劑盒，普洛麥格公司，美國；

質(zhì)粒小提試劑盒dp103，天根，中國；

solutioni連接酶，takara，日本；

卡那霉素，西格瑪，美國；

200ml的10×sc/u（腺嘌呤、精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸各0.2g；天冬氨酸、組氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸和纈氨酸各0.1g）；

sc/u固體培養(yǎng)基（100ml）：吸取sc/u（10×）溶液10ml、瓊脂粉2g、difconitrogen（n源）0.67g、葡萄糖2g（單獨(dú)滅菌），定容積至100ml；

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

紫外-可見光分光光度計(jì)nanodrop2000c，賽默飛公司，美國；

qrt-pcr使用的儀器為abi7000，愛普拜斯，美國；

激光共聚焦掃描顯微鏡fv1000，奧林巴斯，日本。

實(shí)施例1

本實(shí)施例主要介紹一下對棉花谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx8基因的克隆及對其堿基序列的分析過程，具體如下。

根據(jù)陸地棉tm-1轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物，采用pcr技術(shù)對目標(biāo)基因ghgpx8全長序列進(jìn)行克隆，引物序列設(shè)計(jì)如下：

8-f：5'-cccggtaccatggcttctcaatcttcta-3'，

8-r：5'-cccggatccagccagcagtttcttaa-3'；

利用提取棉花的dna和rna的試劑盒，分別提取陸地棉的dna和rna，將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna，以陸地棉的dna和cdna為模板，進(jìn)行ghgpx8序列的擴(kuò)增；

pcr反應(yīng)條件為：95℃、5min；95℃、40s，55℃、40s，72℃、30s，32個(gè)循環(huán)；72℃、5min。

對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收（采用pcr回收試劑盒），并進(jìn)行測序，確定結(jié)果。

結(jié)果表明，以陸地棉的dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，獲得ghgpx8基因全長序列，其共包含1491bp堿基，堿基序列如seqidno.1所示；其在染色體上的位置信息為at_chr1093484710-93486200(+)；

以陸地棉的cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，獲得ghgpx8基因全長序列的編碼序列，其包括501bp堿基，堿基序列如seqidno.2所示；其共編碼166個(gè)氨基酸，氨基酸序列如seqidno.3所示。

對ghgpx8的氨基酸序列進(jìn)行blastx（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）分析表明，該基因與擬南芥atgpx6、水稻osgpx1和osgpx3、楊樹ptgpx3.1和ptgpx3.2蛋白的堿基序列相似性比較高，高度的序列同源性表明ghgpx8序列進(jìn)化的保守性，暗示它們在不同物種中可能有類似的功能。

進(jìn)一步地，利用dnaman軟件對ghgpx8的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了分析（與擬南芥atgpx6、水稻osgpx1和osgpx3、楊樹ptgpx3.1和ptgpx3.2蛋白進(jìn)行比對），確定ghgpx8酶具有谷胱甘肽過氧化物酶的典型結(jié)構(gòu)特征，即3個(gè)保守的gpx特征區(qū)域（churinetal.,1999），分別為gpx保守區(qū)域1，gpx保守區(qū)域2和含有wnf(s/t)kf序列的區(qū)域（比對結(jié)果如圖1所示）。

利用mega4.0軟件，采用鄰接法（neighbor-joining）對ghgpx8基因及其他物種的gpx家族的成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，設(shè)置1000次bootstraps進(jìn)行評估（如圖2所示），發(fā)現(xiàn)該基因被歸類為gpx家族的成員。

綜合上述分析結(jié)果，發(fā)明人認(rèn)為所克隆的ghgpx8基因?qū)儆趃px家族，并最終以ghgpx8基因進(jìn)行了命名。

實(shí)施例2

初步研究結(jié)果表明，在多種脅迫處理時(shí)，棉花植株內(nèi)的ghgpx8基因的表達(dá)量都表現(xiàn)出上調(diào)現(xiàn)象，尤其是當(dāng)高溫、茉莉酸或水楊酸處理時(shí)，ghgpx8基因受到明顯的誘導(dǎo)表達(dá)，即該基因可能參與了棉花的響應(yīng)高溫和植物激素的抗氧化調(diào)節(jié)。為進(jìn)一步確定在面臨不同處理時(shí)，棉花應(yīng)答模式及應(yīng)答情況，利用實(shí)時(shí)定量pcr技術(shù)，發(fā)明人進(jìn)行了一步的實(shí)驗(yàn)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)簡要介紹如下。

棉花樣品：

棉花在含有霍格蘭營養(yǎng)液的石英砂中生長至兩葉一心時(shí)期（自然生長或逆境處理后）分別取根、莖、真葉、子葉四個(gè)組織的材料；

種植于大田的花期中的棉花取整朵花；

相關(guān)棉花樣品均用于目標(biāo)基因在陸地棉中組織表達(dá)模式的分析。

逆境處理方式：

高溫處理，將有三片真葉的生長中的棉花置于35℃的培養(yǎng)箱中，根據(jù)需要處理不同的時(shí)間，然后分別取第一片真葉和根；

鹽脅迫處理，將種植于石英砂中的棉花（兩葉一心期）分別浸泡于400mm的nacl和400mm的feso4中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在不同的時(shí)間點(diǎn)分別取第一片真葉和根；

aba處理，將種植于石英砂中的棉花（兩葉一心期）浸泡于400μm的aba中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在不同的時(shí)間點(diǎn)分別取第一片真葉和根；

茉莉酸（meja）和水楊酸（sa）處理，種植于石英砂中的棉花（兩葉一心期），分別單獨(dú)噴施100μm的meja或500μm的sa于棉花葉片，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在不同的時(shí)間點(diǎn)取第一片真葉。

棉花樣品rna和cdna制備：

從棉花中提取和純化總rna的方法是采用試劑盒提取，其原理為異硫氰酸胍法（zhuetal.2005），rna提取完成后用dnasei處理，rna完整性通過1.2%（w/v）瓊脂糖膠電泳檢測；

利用分光光度計(jì)測定核酸濃度，將rna260/280比值在1.9到2.1之間的rna保存?zhèn)溆?，以便進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。

利用revertraaceqpcrrt試劑盒，以所提取的總rna為模版，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cdna，具體過程為：

取1μg總rna，65℃溫浴5min，冰浴5min；

加入5×rtbuffer2μl、rtenzymemix0.5μl、primermix0.5μl、nuclease-freewater補(bǔ)充至10μl；

37℃溫浴15min合成第一鏈；

95℃，5min停止反應(yīng)；

每份反轉(zhuǎn)錄cdna產(chǎn)物稀釋20倍，-20℃保存待用。

定量pcr反應(yīng)：

以棉花ubq7（genbank登陸號：dq116441）基因?yàn)閮?nèi)參基因，以上述所制備cdna為模板，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行半定量pcr分析，引物序列設(shè)計(jì)如下：

gpx8-f：5'-cttctcttatactgagttccaagca-3'，

gpx8-r：5'-cctcttgcatccttaacagtga-3'；

ubq7-f：5'-gaaggcattccacctgaccaac-3'，

ubq7-r：5'-cttgaccttcttcttcttgtgcttg-3'；

先以pcr檢測各樣品cdna的質(zhì)量，20μl的pcr的反應(yīng)體系設(shè)計(jì)如下：

cdna模板，1μl；

10×taqbuffer，2μl；

dntpmix，0.4μl（10mm）；

ubq7-f/rprimer，0.2/0.2μl（濃度均為10μm）；

taqpolymerase，0.2μl（5u/μl）；

ddh2o補(bǔ)足至20μl；

反應(yīng)條件為：95℃、5min；95℃、30s，60℃、30s，72℃30s，27個(gè)循環(huán)；72℃、7min；

pcr產(chǎn)物用0.8%（w/v）瓊脂糖膠電泳檢測。

qrt-pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系（20μl）包括：

1μl稀釋后的cdna，

10μl2×sybrgreenpcrmastermix（普洛麥格公司，美國），

ubq7-f/rprimer0.2/0.2μl（濃度均為10μm）或gpx8-f/rprimer（10μm）0.2/0.2μl；

pcr程序?yàn)椋?5℃變性2min；95℃變性5s，60℃復(fù)性延伸45s，40個(gè)循環(huán)；40循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性用溶解曲線分析檢測。

結(jié)果表明：ghgpx8基因在棉花幼苗各個(gè)組織和花中均有表達(dá)，以花中的表達(dá)量最高；在棉花根系和花中ghgpx8還受高溫、鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，而且ghgpx8還應(yīng)答于meja和sa信號，并受其誘導(dǎo)表達(dá)，尤其是meja處理棉花后，ghgpx8的表達(dá)量上升超過20倍（圖3，圖5）。這些結(jié)果暗示ghgpx8應(yīng)答多種非生物脅迫，可能對維持這些脅迫過程植物體內(nèi)的氧化還原平衡起作用。

實(shí)施例3

在前述實(shí)施例2結(jié)果分析基礎(chǔ)上，發(fā)明人認(rèn)為有必要對ghgpx8基因在細(xì)胞內(nèi)的定位情況進(jìn)一步進(jìn)行分析，因而構(gòu)建了含有ghgpx8的cdna序列（seqidno.2）的超表達(dá)p1300gfp-ghgpx8重組載體，具體過程簡要介紹如下。

首先，設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切酶kpni和bamhi酶切位點(diǎn)的引物序列如下：

1300gfp-gpx8-f：5'-cccggtaccatggcttctcaatcttcta-3'，

1300gfp-gpx8-r：5'–cccggatccagccagcagtttcttaa-3'；

然后，以實(shí)施例2中所制備cdna樣品為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并回收擴(kuò)增產(chǎn)物；

第三，對所回收pcr擴(kuò)增產(chǎn)物及p1300gfp載體分別采用bamhi和kpni進(jìn)行雙酶切，酶切體系參照takara使用手冊（takara，日本）；對酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，并回收酶切片段；

第四，將所回收酶切片段采用solutioni連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建超表達(dá)p1300gfp-ghgpx8載體；

第五，采用熱激轉(zhuǎn)化法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，進(jìn)行kana（卡那霉素，50μg/ml）抗性篩選，選擇陽性菌落進(jìn)行pcr檢測，對pcr檢測鑒定正確菌落進(jìn)行擴(kuò)增，并提取質(zhì)粒備用。

將所提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中，具體方法分為兩步：

首先是制備擬南芥原生質(zhì)體，然后以peg介導(dǎo)的葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法，將提取的p1300gfp-ghgpx8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入原生質(zhì)體，于23℃，弱光的培養(yǎng)箱孵育6~18h左右（但不超過18h）（具體操作可參考lietal.，aik1，amitogen-activatedproteinkinase,modulatesabscisicacidresponsesthroughthemkk5-mpk6kinasecascade；plantphysiol.2017，173:1391-1408）。

將轉(zhuǎn)化完畢的原生質(zhì)體溶液于100rpm離心1min，棄上清液（預(yù)留100μl溶液），輕柔地混勻后，在激光共聚焦掃描顯微鏡的60×物鏡下觀察轉(zhuǎn)化成功的原生質(zhì)體的gfp熒光，gfp熒光的掃描參數(shù)設(shè)置為：ex=488nm，em=500-535nm，power40%，軟件為olympusfluoviewver1.7。

通過激光共聚焦掃描顯微鏡檢測熒光（結(jié)果如圖4所示）。熒光觀測結(jié)果表明，gpx8-gfp定位于細(xì)胞質(zhì)中。由于p1300gfp-ghgpx8載體是以35s強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gpx8-gfp融合蛋白表達(dá)，因此該載體可用于農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化植物，獲得過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。

需要解釋的是，相關(guān)操作參考現(xiàn)行常規(guī)轉(zhuǎn)基因操作或相關(guān)試劑盒說明書即可，不再贅述。

實(shí)施例4

為了進(jìn)一步分析ghgpx8基因的抗氧化功能，發(fā)明人構(gòu)建了含有ghgpx8的cdna序列（seqidno.2）的重組表達(dá)載體pyes2-ghgpx8，具體過程簡要介紹如下。

首先，設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切酶hindiii和bamhi酶切位點(diǎn)的引物序列如下：

pyes2-gpx8-f：5'-cc5caagcttatgtccgcttctcaatcttcta-3'，

pyes2-gpx8-r：5'-cccggatcctcaagccagcagtttctta-3'；

然后，以實(shí)施例2中所制備cdna樣品為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并回收擴(kuò)增產(chǎn)物；

第三，對所回收pcr擴(kuò)增產(chǎn)物及pyes2載體分別采用hindiii和bamhi進(jìn)行雙酶切，酶切體系參照takara使用手冊（takara，日本）；對酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，并回收酶切片段；

第四，將所回收酶切片段采用solutioni連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建超表達(dá)pyes2-ghgpx8載體；

第五，采用熱激轉(zhuǎn)化法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，進(jìn)行kana（卡那霉素，50μg/ml）抗性篩選，選擇陽性菌落進(jìn)行pcr檢測，對pcr檢測鑒定正確菌落進(jìn)行擴(kuò)增，并提取質(zhì)粒備用。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將pyes2-ghgpx8轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母缺陷型突變體δgpx3中，具體轉(zhuǎn)化步驟如下：

(1)將轉(zhuǎn)化用酵母突變體δgpx3和野生型酵母by4741的單菌落接種于6ml的ypd液體培養(yǎng)基中，30℃、230rpm過夜培養(yǎng)，然后按1:100的體積比例接種于100ml的ypd培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至od600達(dá)到1.5左右；

(2)將δgpx3和by4741置于冰上放置28min，4℃、4500rpm離心5min收集酵母；棄上清液，加入4℃、20ml的超純水洗滌酵母菌一次；為了增加細(xì)胞對電擊的感受性，可重復(fù)此操作步驟一次；

(3)5000rpm離心5min收集菌體，用15ml、1mol/l的山梨醇重復(fù)洗滌細(xì)胞2~3次，然后用100ml的集菌管于4℃、4500rpm離心5min收集酵母細(xì)胞，再以1ml、1mol/l的山梨醇懸浮細(xì)胞，取200μl的細(xì)胞懸浮液至1.5ml離心管中備用；

(4)在制得的酵母感受態(tài)中加入20μl（≤5μg）待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，輕輕混勻后冰浴10min，再轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，1500v電擊5ms；然后加入800μl的1mol/l山梨醇，將電轉(zhuǎn)后的菌懸液從電轉(zhuǎn)杯中吸出，30℃靜置培養(yǎng)1.5~2h，取200μl涂布于sc/u篩選板；

(5)選取30℃培養(yǎng)3天的酵母，加入5ml的ypd培養(yǎng)基中，30℃、220rpm培養(yǎng)2天左右，再用酵母提取試劑盒提取酵母質(zhì)粒，并克隆基因驗(yàn)證是否為陽性克?。?/p>

然后以ypd培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定的陽性克隆酵母，于不同的od值點(diǎn)種于ypd培養(yǎng)基或含h2o2的ypd培養(yǎng)基中（具體操作可參考英駿公司pyes2說明書）。

測定結(jié)果表明（如圖6所示），含有h2o2的培養(yǎng)基中的δgpx3和野生型酵母by4741的生長明顯受到抑制，而轉(zhuǎn)基因ghgpx8的δgpx3對h2o2有明顯抗性，生長速度較δgpx3和野生型酵母by4741快，表明ghgpx8有清除h2o2的能力，能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因提高植物的抗氧化性。

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<110>河南大學(xué)

<120>棉花谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx8及應(yīng)用

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