新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶gpx突變體及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體及其制備方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及序列SEQ?ID?No:1～38。其是先用基因突變或合成法獲得突變體基因，再通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)或營(yíng)養(yǎng)缺陷型和SPP低溫聯(lián)合表達(dá)系統(tǒng)，將GPX的催化基團(tuán)SeCys引入到突變體的底物結(jié)合部位，賦予其高的GPX的活性；或者先將靶基因連同SeCys插入序列組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上，再將SeCys插入序列結(jié)合蛋白2組裝到胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上，將兩種載體共轉(zhuǎn)染同一哺乳細(xì)胞株，在亞硒酸鈉存在下用哺乳細(xì)胞合成GPX。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，突變體活力和產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好，從而解決天然GPX來(lái)源有限和性質(zhì)不穩(wěn)定問(wèn)題。
【專(zhuān)利說(shuō)明】新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]含硒的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基團(tuán)是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物體內(nèi)，GPX同超氧化物歧化酶(S0D)、過(guò)氧化氫酶(CAT)—起構(gòu)成了機(jī)體抗氧化防御體系。GPX在該體系中發(fā)揮著重要的作用，它以底物GSH為還原劑，分解體內(nèi)的過(guò)氧化氫和各類(lèi)氫過(guò)氧化物，因而能清除體內(nèi)活性氧(R0S)，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，治療由活性氧引起的各種疾病，如衰老、紫外線(xiàn)輻射、心腦血管疾病、白內(nèi)障、腫瘤等。與其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，還能降解脂質(zhì)過(guò)氧化物，防止細(xì)胞過(guò)氧化損傷，這種獨(dú)特的保護(hù)細(xì)胞的功能使它在抗氧化酶體系中占有特別重要的位置。然而，由于天然GPX的來(lái)源相當(dāng)有限、穩(wěn)定性差，致使它的人工產(chǎn)物及其模擬物的研究備受關(guān)注。
[0003]小分子模擬物主要有PZ51 (ebSelen)、AL3823A、BXT系列產(chǎn)品，它們的弱點(diǎn)是活力低，僅為天然GPX的千分之一左右。大分子的模擬物主要有抗體酶(中國(guó)專(zhuān)利94102481.4和96112628.0)和以谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)為蛋白模板制備的GPX模擬酶，其活力顯著高于小分子模擬物。顯然，以具有谷胱甘肽(GSH)結(jié)合部位的蛋白為模板制備的大分子GPX模擬酶收到了更好的效果，因此開(kāi)發(fā)制備這些高活力的GPX模擬酶制備技術(shù)就成了學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)，對(duì)于分子生物學(xué)、生物工程學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。迄今已成功開(kāi)發(fā)的方法有:用化學(xué)法(中國(guó)專(zhuān)利94102481.4,96112628.0)或營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)(中國(guó)專(zhuān)利200810050556.6)在非GPX類(lèi)模板蛋白中引入GPX的催化基團(tuán)硒代半胱氨酸(SeCys)。
[0004]中國(guó)專(zhuān)利94102481.4,96112628.0,99104234.4,200810050556.6 公開(kāi)的各類(lèi)含
硒抗體酶的制備方法就是應(yīng)用化學(xué)突變(修飾)法在抗體類(lèi)模板蛋白中引入GPX的催化基團(tuán)SeCys，有以下缺點(diǎn):(I)在制備過(guò)程中，僅化學(xué)突變(修飾)這一步就會(huì)損失20_40%的酶蛋白，導(dǎo)致模擬酶產(chǎn)率顯著下降；(2)制備模擬酶的周期長(zhǎng)，操作繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)；(3)在化學(xué)突變過(guò)程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，這些物質(zhì)為有毒性的物質(zhì)；(4)缺乏靶向性，對(duì)于大的蛋白分子而言，一次化學(xué)反應(yīng)常在不同位點(diǎn)引入多個(gè)非特異性催化基團(tuán)，因此化學(xué)突變引入催化基團(tuán)無(wú)法達(dá)到基因突變法那樣的專(zhuān)一性。
[0005] 中國(guó)專(zhuān)利200810050556.6也公開(kāi)了人源單鏈含硒抗體酶的另一種制備方法是用營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌)和基因突變法引入催化基團(tuán)，但其僅限于人源單鏈含硒抗體酶的制備，不包括谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)突變體及其它GPX模擬酶的制備方法。具有GPX活性的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的制備方法(Yu, H.J., Liu, J.Q.B ,ckA.，Li, J.，Luo, G.M.，and Shen, J.C.J.Biol.Chem.2005，280，11930-11935)亦見(jiàn)報(bào)道，這種方法雖然也采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)和基因突變法引入催化基團(tuán)，但其僅限于以GST為模板蛋白制備GPX模擬酶，不包括以天然GPX為模板制備GPX突變體。用營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)在非GPX類(lèi)模板蛋白中引入催化基團(tuán)制備模擬酶的方法是將催化基團(tuán)引入到與GPX有相同底物GSH結(jié)合部位的它種蛋白中使其產(chǎn)生GPX活力。
[0006]然而由于這些模板蛋白不具備天然GPX自身的催化基團(tuán)，因此很難找到理想而準(zhǔn)確的催化基團(tuán)的位置；同時(shí)由于這些模板蛋白中也沒(méi)有象天然GPX那樣理想的催化三聯(lián)體，因此這類(lèi)模擬酶的催化效率不高。如果以天然GPX為模板用基因工程方法來(lái)制備GPX突變體則可克服這些缺點(diǎn)。由于編碼GPX的催化基團(tuán)SeCys的密碼子UGA是終止密碼子，在普通原核表達(dá)系統(tǒng)中，需在GPX基因的開(kāi)放閱讀框內(nèi)、緊鄰S(chǎng)eCys的密碼子UGA下游引入頸環(huán)結(jié)構(gòu)才能將UGA翻譯成SeCys而不是終止密碼子，而開(kāi)放閱讀框內(nèi)頸環(huán)的引入必然會(huì)引起GPX空間構(gòu)象的改變，進(jìn)而影響酶活性。因此普通原核表達(dá)系統(tǒng)不適于直接表達(dá)具有GPX活性的含硒蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供數(shù)種新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體及其制備方法。
[0008]應(yīng)用基因工程技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)技術(shù)和SPP (Singleprotein production,單一蛋白生產(chǎn))系統(tǒng)低溫表達(dá)技術(shù)制備具有極高GPX活力的GPX突變體。是用基因工程技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞株或營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)及其SPP低溫表達(dá)系統(tǒng)中直接表達(dá)具有高酶活性的GPX突變體蛋白的方法。本方法不需化學(xué)修飾即可制備具有極高GPX活力的新型人工酶。本發(fā)明方法在生物制藥方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0009]本發(fā)明以人GPX1、GPX2、GPX3 和 GPX4 (參見(jiàn) NCBI, NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3)為模板，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬和定點(diǎn)突變，得到四種新型的高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶突變體，分別由203、190、207或170個(gè)氨基酸組成，與對(duì)應(yīng)的GPX1、GPX2、GPX3和GPX4相比較，其不含有半胱氨酸，是將GPX1-4中所有半胱氨酸突變成丙氨酸，但催化基團(tuán)硒代半胱氨酸(SeCys，單字母縮寫(xiě)為U，序列表中寫(xiě)成Xaa)保持不變。與已公開(kāi)的申請(qǐng)?zhí)枮?01310142866.1和201310302778.3的中國(guó)專(zhuān)利相比，其具有更高的GPX活力和更好的穩(wěn)定性。所述的GPX突變體的氨基酸序列(SEQ ID No: 1-4)分別如下所示:
[0010]序列I (SEQ ID No:1):(實(shí)施例 1-8)
[0011]MAAARLAAAAAAAQSVYAFSARPLAGGEPVSLGSLRGKVLLIENVASLUGTTVRDYTQM NELQRRLGPRGLVVLGFPANQFGHQENAKNEEILNSLKYVRPGGGFEPNFMLFEKAEVNGAGA HPLFAFLREALPAPSDDATALMTDPKLITWSPVARNDVAWNFEKFLVGPDGVPLRRYSRRFQTIDI EPDIEALLSQGPSAA
[0012]序列2 (SEQ ID No:2):(實(shí)施例 9)
[0013]MAFIAKSFYDLSAISLDGEKVDFNTFRGRAVLIENVASLUGTTTRDFTQLNELQARFPRRLV VLGFPANQFGHQENAQNEEILNSLKYVRPGGGYQPTFTLVQKAEVNGQNEHPVFAYLKDKLPY PYDDPFSLMTDPKLIIffSPVRRSDVAWNFEKFLIGPEGEPFRRYSRTFPTINIEPDIKRLLKVAI
[0014]序列3 (SEQ ID No:3):(實(shí)施例 10)
[0015]MQSRGQEKSKMDAHGGISGTIYEYGALTIDGEEYIPFKQYAGKYVLFVNVASYUGLTGQY IELNALQEELAPFGLVILGFPANQFGKQEPGENSEILPTLKYVRPGGGFVPNFQLFEKGDVNGEK EQKFYTFLKNSAPPTSELLGTSDRLFffEPMKVHDIRffNFEKFLVGPDGIPIMRffHHRTTVSNVK MDILSYMRRQAALGVKRK
[0016]序列4 (SEQ ID No:4):(實(shí)施例 11)[0017]MAASRDDWRAARSMHEFSAKDIDGHMVNLDKYRGFVAIVTNVASQUGKTEVNYTQLVD LHARYAEAGLRILAFPANQFGKQEPGSNEEIKEFAAGYNVKFDMFSKIAVNGDDAHPLWKWMK IQPKGKGILGNAIKffNFTKFLIDKNGAVVKRYGPMEEPLVIEKDLPHYF
[0018]進(jìn)一步，所述的GPX突變體的具體氨基酸序列還包括，由于使用了便于靶蛋白純化的pColdl (TAKARA公司)等分泌型原核或真核表達(dá)載體而在上述氨基酸序列的氨基端或羧基端引入該載體上的組氨酸純化標(biāo)簽和其它的氨基酸等所形成的任何一個(gè)新型GPX突變體。比如在序列SEQ ID No: K SEQ ID No:2, SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的氨基端引入pColdl (TAKARA公司)原核表達(dá)載體的組氨酸純化標(biāo)簽和凝血因子X(jué)a切割位點(diǎn)的氨基酸后所形成的序列SEQ ID No:5 (實(shí)施例12),SEQ ID No:6 (實(shí)施例13),SEQ ID No:7 (實(shí)施例14)和SEQ ID No:8 (實(shí)施例15)。
[0019]進(jìn)一步，所述的GPX突變體的具體氨基酸序列還包括，將上述氨基酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)丙氨酸(Ala)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)所形成的任何一個(gè)新型GPX突變體。比如將序列I和5的第2位丙氨酸(Ala)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)，所形成的序列為SEQ ID No:9(實(shí)施例16)和SEQ ID No: 13 (實(shí)施例20);或者將序列2和6的第55位丙氨酸(Ala)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)，所形成的序列為SEQ ID No: 10 (實(shí)施例17)和SEQ ID No: 14 (實(shí)施例21);或者將序列3和7的第13位丙氨酸(Ala)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)，所形成的序列為SEQ ID No: 11(實(shí)施例18)和SEQ ID No: 15 (實(shí)施例22);或者將序列4和8的第2位丙氨酸(Ala)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)，所形成的序列為SEQ ID No: 12 (實(shí)施例19)和SEQ ID No: 16 (實(shí)施例23)。本發(fā)明所述的將上述氨基酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)丙氨酸(Ala)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)所形成的任何一個(gè)新型GPX突變體不僅局限于SEQ ID No:9-16，也可以是序列SEQ ID No: 17-38(實(shí)施例24-27)或符合條件的所有序列。
[0020]本發(fā)明的制備新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體的方法，具體包括如下方法:
[0021]方法1:
[0022]先合成靶基因并組裝到分泌型原核表達(dá)載體上或先將GPX1-4基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上，用基因突變(或氨基酸替換)法獲取靶基因，再通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)或通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核和SPP低溫聯(lián)合表達(dá)系統(tǒng)，將GPX的催化基團(tuán)硒代半胱氨酸(SeCys)引入到GPX突變體的底物結(jié)合部位，因而在該蛋白上既有GPX的底物結(jié)合部位，又有GPX的催化基團(tuán)和催化三聯(lián)體，結(jié)果賦予其極高的GPX的活性，就產(chǎn)生了高活力的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體。方法2:
[0023]或先將編碼GPX突變體的基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上，再將硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2)組裝到胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上，將兩種載體共轉(zhuǎn)染同一哺乳類(lèi)細(xì)胞株，然后用篩選得到的同時(shí)含有GPX突變體和SBP2兩種基因的陽(yáng)性細(xì)胞株制備GPX突變體蛋白，就在體外產(chǎn)生了高活力的基因工程谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體，從而解決天然GPX來(lái)源有限的問(wèn)題。
[0024]本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，突變體活力和產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好,避免包涵體復(fù)性造成的產(chǎn)率下降和失活，從而解決天然GPX來(lái)源有限和性質(zhì)不穩(wěn)定問(wèn)題。
[0025]本發(fā)明所述的SEQ ID No: USEQ ID No:2,SEQ ID No:3 和 SEQ ID No:4 的制備方法，其具體步驟如下所示(每個(gè)序列共可以采用八種方法):[0026]本發(fā)明的第一種方法是先在生物公司用DNA合成儀人工合成能夠表達(dá)本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白的基因，確保基因中不含ACA序列，再用單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)和營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)聯(lián)合制備GPX突變體蛋白。(實(shí)施例1、9、10、11)
[0027]1)、表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)本發(fā)明所述GPX突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)GPX突變體蛋白的基因，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)，3,端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)，確保靶基因中唯一的硒代半胱氨酸(SeCys)的編碼序列替換為半胱氨酸(Cys)的密碼子(可以是TGC等)，且基因全長(zhǎng)不含有ACA序列；具體的基因序列可以是將GPXl基因(參見(jiàn)從^1，匪_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為丙氨酸的密碼子，第49位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子，并根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將基因中所有的ACA序列全部替換為非ACA序列所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白，且全長(zhǎng)不含有ACA序列的編碼基因(由于密碼子的簡(jiǎn)并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因);用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX突變體基因和分泌型原核表達(dá)載體(如PCold系列等)，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX突變體基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而GPX突變體基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；
[0028]2)、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達(dá)與純化:
[0029]用步驟I)中構(gòu)建的含有GPX突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性菌株；再將含有表達(dá)核酸內(nèi)切酶MazF的pMazF (TAKARA, Cat#3367)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌株，用含雙抗性的M9固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)IPTG低溫4-25°C誘導(dǎo)表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，直接表達(dá)出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過(guò)識(shí)別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得GPX突變體蛋白純品。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Westernblot)鑒定目標(biāo)蛋白。
[0030]該方法用合成的基因通過(guò)低溫下誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)聯(lián)合SPP單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)，在GPX突變體的底物結(jié)合部位引入了催化基團(tuán)，因而產(chǎn)生高活力的GPX突變體。
[0031]所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0032]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000_12000g離心15_30min。
[0033] 本發(fā)明的第二種方法是先擴(kuò)增GPX基因，然后以其為模板，用基因突變法獲得能表達(dá)本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白的基因，并在保證其氨基酸序列不變的前提下突變掉基因中的ACA序列，獲得不含ACA的GPX突變體基因，再用單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)和營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)聯(lián)合制備GPX突變體蛋白。(實(shí)施例2)
[0034]I)、表達(dá)載體的構(gòu)建:
[0035]根據(jù)基因文庫(kù)中公開(kāi)的GPX1-4的基因序列(參見(jiàn)NCBI, NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其編碼基因，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)，確保引物中編碼Cys的密碼子替換成Ala的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上(如PCold系列等);在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX中要突變?yōu)榘腚装彼岬奈ㄒ晃腚装彼岷退揉彽陌被岬幕蛐蛄性O(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，將?gòu)建在原核表達(dá)載體上的GPX基因中的硒代半胱氨酸的編碼序列突變成半胱氨酸的密碼子；同理，用上述定點(diǎn)突變的方法在確保不引入ACA序列的前提下，將GPX基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成丙氨酸的密碼子，再根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將GPX基因中所有ACA序列突變掉；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；
[0036]2)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及突變體蛋白的表達(dá)與純化
[0037]用步驟I)中構(gòu)建的含有GPX突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含半胱氨酸的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性菌株；再將表達(dá)核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒pMazF轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌株，用含雙抗性的M9固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有硒代半胱氨酸、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β -D-半乳糖苷低溫4-25°C誘導(dǎo)表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用半胱氨酸的密碼子合成硒代半胱氨酸，直接表達(dá)出在底物谷胱甘肽的結(jié)合部位含有硒代半胱氨酸的重組GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過(guò)識(shí)別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得含GPX突變體的上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0038]該方法用突變的基因通過(guò)低溫下誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)聯(lián)合SPP單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)，在GPX突變體的底物結(jié)合部位引入了催化基團(tuán)，因而產(chǎn)生各型高活力的GPX突變體蛋白。
[0039]所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX突變體，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0040]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000-12000g離心15_30min。
[0041]本發(fā)明的第三種方法是先在生物公司用DNA合成儀人工合成能夠表達(dá)本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白基因，再用營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)制備GPX突變體蛋白。(實(shí)施例3)
[0042]I)、表達(dá)載體的構(gòu)建:[0043]根據(jù)本發(fā)明所述GPX突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)GPX突變體蛋白的基因，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)，3,端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)，確保靶基因中唯一的硒代半胱氨酸(SeCys)的編碼序列替換為半胱氨酸(Cys)的密碼子(可以是TGC等);具體的基因序列可以是將GPXl基因(參見(jiàn)NCBI, NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為丙氨酸的密碼子，第49位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白的編碼基因(由于密碼子的簡(jiǎn)并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因);用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX突變體基因和分泌型原核表達(dá)載體(如PCold系列等)，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX突變體基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有而GPX突變體基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；
[0044]2)、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達(dá)與純化:
[0045]用步驟I)中構(gòu)建的含有GPX突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株_BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達(dá)出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPX突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得GPX突變體蛋白純品。
[0046]該方法通過(guò)合成基因和營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)在GPX突變體的底物結(jié)合部位引入了催化基團(tuán)，因而產(chǎn)生高活力的GPX突變體蛋白。
[0047]所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0048]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000_12000g離心15_30min。
[0049]本發(fā)明的第四種方法是先擴(kuò)增GPX基因，然后以其為模板，用基因突變法獲得能表達(dá)本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白的基因，再用營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)制備GPX突變體蛋白。(實(shí)施例4)
[0050]I)、表達(dá)載體的構(gòu)建:
[0051]根據(jù)基因文庫(kù)中公開(kāi)的GPX1-4的基因序列(參見(jiàn)NCBI, NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其編碼基因，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)，確保引物中編碼Cys的密碼子替換成Ala的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上(如PCold系列等);在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX中要突變?yōu)榘腚装彼?Cys)的唯一 SeCys和它比鄰的氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp ;用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Invitrogen公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作),將構(gòu)建在原核表達(dá)載體上的GPX基因中的SeCys的編碼序列突變成Cys的密碼子(比如TGC);同理，用上述定點(diǎn)突變的方法將GPX基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成丙氨酸的密碼子；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；
[0052]2)、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達(dá)與純化:
[0053]用步驟I)中構(gòu)建的含有GPX突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株_BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達(dá)出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPX突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得GPX突變體蛋白純品。
[0054]該方法通過(guò)基因突變和營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)在GPX突變體的底物結(jié)合部位引入了催化基團(tuán) ，因而產(chǎn)生高活力的GPX突變體蛋白。
[0055]所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0056]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000-12000g離心15_30min。
[0057]第五種方法:用合成的靶基因和哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備GPX突變體蛋白。(實(shí)施例5)
[0058]I)、表達(dá)載體的構(gòu)建:
[0059]根據(jù)本發(fā)明所述的GPX突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成GPX突變體的編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點(diǎn)，3'端在終止密碼子下游引入GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPX基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點(diǎn)；具體的基因序列可以是將GPXl基因(參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為丙氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種編碼本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白的基因(由于密碼子的簡(jiǎn)并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因)，但靶基因的3'端必須含有GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPX基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn) NCBI, NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS);用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX突變體基因和哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司),再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX突變體基因連同其3'端非翻譯區(qū)或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，見(jiàn)NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)，用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；
[0060]2)、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選:
[0061]用含有SBP2和GPX突變體基因的載體在轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染哺乳類(lèi)細(xì)胞，用兩個(gè)載體上的抗性基因通過(guò)抗生素濃度從高到低逐級(jí)遞減法篩選兼具兩種抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，再用多孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，最終獲得同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX突變體兩種外源蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞株；檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株；
[0062]3)、靶蛋白的表達(dá)與純化:
[0063]在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里，用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0064]所述的檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量，可以用抗對(duì)應(yīng)各型GPX的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測(cè)定技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)；
[0065]所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，是用pH7.5，50mmoI/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0066]本發(fā)明的第六種方法是分步用含有SBP2基因的載體和含有GPX突變體基因的載體轉(zhuǎn)染同一哺乳類(lèi)細(xì)胞。(實(shí)施例6)
[0067]I)、表達(dá)載體的構(gòu)建:
[0068]根據(jù)本發(fā)明所述的GPX突變體的氨基酸序列在生物公司用DNA合成儀人工合成GPX突變體的編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點(diǎn)，3'端在終止密碼子下游引入GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPX基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點(diǎn)；具體的基因序列可以是將GPXl基因(參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為丙氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種編碼本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白的基因(由于密碼子的簡(jiǎn)并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因)，但靶基因的3'端必須含有GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPX基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn) NCBI, NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS);用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX突變體基因和哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司),再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX突變體基因連同其3'端非翻譯區(qū)或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，見(jiàn)NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)，用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；
[0069]2)、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選:
[0070]先用含有SBP2基因的載體轉(zhuǎn)染哺乳類(lèi)細(xì)胞，通過(guò)該載體上的抗性基因篩選穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株。再用含有GPX突變體基因的載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株，用兩個(gè)載體上的抗性基因篩選同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株；檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株；
[0071]3)、靶蛋白的表達(dá)與純化:
[0072]在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0073]在陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選中，所述的陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選，也可先轉(zhuǎn)染GPX突變體基因，后轉(zhuǎn)染SBP2基因，再用兩個(gè)載體上的抗性基因篩選同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株。所述的檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量，可以用抗對(duì)應(yīng)各型GPX的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測(cè)定技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0074]所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPX突變體，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0075]第七種方法:用擴(kuò)增的靶基因和哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備GPX突變體蛋白。(實(shí)施例7)
[0076]I)、表達(dá)載體的構(gòu)建:
[0077]根據(jù)基因文庫(kù)中 GPX1-4 基因序列(參見(jiàn) NCBI, NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3 )設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GPX的編碼基因及其3 '端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點(diǎn)，靶基因的3'端在終止密碼子下游引入GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPX基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn)NCBI, NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點(diǎn)，確保引物中編碼Cys的密碼子替換成Ala的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點(diǎn)的靶基因和哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX基因連同其3'端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX中要突變?yōu)楸彼岬陌腚装彼岷退揉彽陌被岬幕蛐蛄性O(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，將?gòu)建在真核表達(dá)載體上的GPX基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成丙氨酸的密碼子；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白。根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，見(jiàn)NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)；同樣經(jīng)酶切連接后用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而革巴基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；
[0078]2)、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選:
[0079]用含有SBP2和GPX突變體基因的載體在轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染哺乳類(lèi)細(xì)胞，用兩個(gè)載體上的抗性基因通過(guò)抗生素濃度從高到低逐級(jí)遞減法篩選兼具兩種抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，再用多孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，最終獲得同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX突變體兩種外源蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞株；檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株；
[0080]3)、靶蛋白的表達(dá)與純化:
[0081]在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里，用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0082]所述的檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量，可以用抗對(duì)應(yīng)各型GPX的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測(cè)定技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)；
[0083]所述的用谷胱甘肽 GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0084]本發(fā)明的第八種方法是分步用含有SBP2基因的載體和含有GPX突變體基因的載體轉(zhuǎn)染同一哺乳類(lèi)細(xì)胞。(實(shí)施例8)
[0085]I)、表達(dá)載體的構(gòu)建:
[0086]根據(jù)基因文庫(kù)中GPX1-4 基因序列(參見(jiàn) NCBI, NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3 )設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GPX的編碼基因及其3 '端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點(diǎn)，靶基因的3'端在終止密碼子下游引入GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPX基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn)NCBI, NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點(diǎn)，確保引物中編碼Cys的密碼子替換成Ala的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點(diǎn)的靶基因和哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司),再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX基因連同其3'端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX中要突變?yōu)楸彼岬陌腚装彼岷退揉彽陌被岬幕蛐蛄性O(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖校瑢?gòu)建在真核表達(dá)載體上的GPX基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成丙氨酸的密碼子；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能夠編碼本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白。根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，見(jiàn)NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)；同樣經(jīng)酶切連接后用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而革巴基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；
[0087]2)、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選:
[0088]先用含有SBP2基因的載體轉(zhuǎn)染哺乳類(lèi)細(xì)胞，通過(guò)該載體上的抗性基因篩選穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株；再用含有GPX突變體基因的載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株，用兩個(gè)載體上的抗性基因篩選同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株；檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株；
[0089]3)、靶蛋白的表達(dá)與純化:
[0090]在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0091]在陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選中，所述的陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選，也可先轉(zhuǎn)染GPX突變體基因，后轉(zhuǎn)染SBP2基因，再用兩個(gè)載體上的抗性基因篩選同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株。所述的檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量，可以用抗對(duì)應(yīng)各型GPX的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測(cè)定技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0092]所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPX突變體，是用ρΗ7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0093]本發(fā)明所述的SEQ ID No:5,SEQ ID No:6,SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 的制備方法，其與前面所述的八種完全相同，只是由于使用了便于靶蛋白純化的PColdl (TAKARA公司)等分泌型原核或真核表達(dá)載體而在靶蛋白的氨基端或羧基端引入該載體上的組氨酸純化標(biāo)簽和其它的氨基酸等所形成的任何一個(gè)新型GPX突變體。比如在序列SEQ ID No: 1、SEQ ID No:2,SEQ ID No:3,SEQ ID No:4 的氨基端引入 pColdl (TAKARA 公司)原核表達(dá)載體的組氨酸純化標(biāo)簽和凝血因子X(jué)a切割位點(diǎn)的氨基酸后所形成的序列SEQ ID No:5、SEQID No:6、SEQ ID No:7、SEQ ID No:8。(實(shí)施例 12-15)。
[0094]本發(fā)明所述的SEQ ID No:9, SEQ ID No: 10、SEQ ID No: 11、SEQ ID No: 12 和 SEQID No: 13、SEQ ID No: 14、SEQ ID No: 15、SEQ ID No: 16的制備方法，其與前面所述的八種完全相同，只是合成基因時(shí)將GPXl突變體(SEQ ID No:1或5)的第2位、GPX2突變體(SEQID No:2或6)的第55位、GPX3突變體(SEQ ID No:3或7)的第65位、或者GPX4突變體(SEQ ID No:4或8)的第2位丙氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，最后獲得的GPX突變體蛋白的對(duì)應(yīng)位置的氨基酸是絲氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列不變。對(duì)應(yīng)的序列分別是 SEQ ID No:9、SEQ ID No: 10、SEQ ID No: 11、SEQ ID No: 12 和 SEQ ID No: 13、SEQID No: 14、SEQ ID No: 15、SEQ ID No: 16。(實(shí)施例 16-23)。
[0095]本發(fā)明所述的將上述氨基酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)丙氨酸(Ala)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)所形成的任何一個(gè)新型GPX突變體不僅局限于SEQ ID No:9_16，也可以是序列SEQID No: 17-38 (實(shí)施例24-27)或符合條件的所有序列，其制備方法與前面所述的八種完全相同。
[0096]這里面其實(shí)又包括了序列SEQ ID No: 5 (現(xiàn)在改為9)和SEQ ID No:8 (現(xiàn)在改為12)呀？現(xiàn)在是否可以？
[0097]本發(fā)明具有以下特點(diǎn):
[0098]⑴本發(fā)明使用簡(jiǎn)單的基因合成或擴(kuò)增、基因突變和表達(dá)等基因工程技術(shù)，制備方法簡(jiǎn)單。
[0099]⑵本發(fā)明方法制備的GPX突變體蛋白活力高，已超過(guò)天然GPX活力的一個(gè)數(shù)量級(jí)，細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)對(duì)過(guò)氧化氫損傷的心肌細(xì)胞有更強(qiáng)的保護(hù)作用。
[0100]⑶本發(fā)明所述的GPX突變體的活力顯著高于以往中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)的對(duì)應(yīng)各型GPX突變體的活力。
[0101]⑷本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白具有超強(qiáng)的穩(wěn)定性，不易失活，這一特性彌補(bǔ)了天然GPX的缺陷。
[0102](5)本發(fā)明使用的分泌型表達(dá)載體，能將GPX突變體蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到大腸桿菌的周質(zhì)腔或哺乳類(lèi)細(xì)胞的體外，引導(dǎo)蛋白分泌表達(dá)的前導(dǎo)信號(hào)肽由菌體或細(xì)胞自動(dòng)切除，所表達(dá)的蛋白為可溶性，具有天然蛋白的空間構(gòu)象和更高的活性，不需復(fù)性，可避免包涵體復(fù)性過(guò)程造成的產(chǎn)率下降和失活，因而生產(chǎn)周期短。
[0103](6)本發(fā)明使用的SPP低溫表達(dá)系統(tǒng)能利用MazF蛋白酶特異性識(shí)別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無(wú)ACA序列的蛋白質(zhì)，因此新合成的蛋白主要是外源蛋白，從而提高產(chǎn)率和Cys向SeCys的轉(zhuǎn)化率，因此具有活力高、產(chǎn)率高的雙重優(yōu)勢(shì)。
[0104](7)本發(fā)明所用的真核表達(dá)直接使用GPX自身的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)，不需另外引入SECIS進(jìn)入表達(dá)載體，因而操作簡(jiǎn)單且可用常規(guī)真核表達(dá)載體實(shí)施。
[0105]這些優(yōu)點(diǎn)均有利于大規(guī)模生產(chǎn)，為今后的實(shí)際應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，解決了天然GPX來(lái)源不足、性質(zhì)不穩(wěn)定和活力低的問(wèn)題，在生物制藥方面有廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0106]圖1:純化得到的GPX1-4突變體蛋白的SDS-PAGE (上)和Western blot (下)結(jié)果:其中M是蛋白分子量Marker，1-11泳道是實(shí)施例1~11制備的靶蛋白。
[0107]圖2:純化得到的GPX1-4突變體蛋白的SDS-PAGE (上)和Western blot (下)結(jié)果:其中M是蛋白分子量Marker，1-12泳道是實(shí)施例12~23制備的靶蛋白。
[0108]圖3:純化得到的GPX1-4突變體蛋白的SDS-PAGE (上)和Western blot (下)結(jié)果:其中M是蛋白分子量Marker，1-10泳道是實(shí)施例24制備的靶蛋白。
[0109]圖4:純化得到的GPX1-4突變體蛋白的SDS-PAGE (上)和Western blot (下)結(jié)果:其中M是蛋白分子量Marker，1-12泳道是實(shí)施例25~27制備的靶蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0110]實(shí)施例1:用合成的基因聯(lián)合SPP和營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)制備基因工程人GPXl突變體蛋白
[0111]根據(jù)本發(fā)明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體蛋白的基因，確保GPXl突變體基因的5/端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，端含有終止密碼子和Hind III酶切位點(diǎn)，GPXl突變體基因的第49號(hào)SeCys的編碼序列TGA替換為Cys的密碼子(TGC)，且基因全長(zhǎng)不含有ACA序列；具體的靶基因序列是將GPXl基因(參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密碼子替換為丙氨酸的編碼序列(依次是:GCT、GCC、GCC、GCT、GCT)，第49位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的編碼序列(TGC)，并將基因中第168、537、561和573號(hào)堿基C全部替換為T(mén)所得到的不含有ACA序列的GPXl突變體基因，確保該基因能編碼本發(fā)明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體蛋白，且靶基因的5/端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，3/端含有終止密碼子和Hind III酶切位點(diǎn)；用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，連接到同樣酶切的pCold III (TAKARA，Cat.#3369)載體上。
[0112]用裝有GPXl突變體基因的載體(pCold II1-GPXl突)轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性菌株。再將表達(dá)核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒pMazF (TAKARA, Cat.#3369)轉(zhuǎn)化到該陽(yáng)性菌株中。將菌液均勻涂布在含100 μ g/mLAmp>25 μ g/mLKana和25 μ g/mL的M9-CAA固體培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于1.2L M9缺陷表達(dá)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50μg/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.5。將菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷卻，之后將菌液置于15°C中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)45min。15°C 5000rpm離心5min,棄上清。用0.9%NaCl重懸菌體沉淀，15°C 5000rpm離心5min,棄上清，重復(fù)該步驟。然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸菌體，加入終濃度為lmmol/L IPTG和終濃度為200 μ g/mL SeCys, 15°C振蕩培養(yǎng)16-72h，使GPXl突變體蛋白以可溶性形式表達(dá)在菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過(guò)識(shí)別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)。收集菌體(6000rpm，IOmin)并用等體積的 bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說(shuō)明書(shū)處理GSH親合柱，應(yīng)用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為21.9kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1的第I泳道。其GPX活力為31532U/ym0l，超過(guò)天然GPX 一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0113] 本實(shí)施例使用的SPP低溫表達(dá)系統(tǒng)能利用MazF蛋白酶特異性識(shí)別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無(wú)ACA序列的蛋白質(zhì)，因此新合成的蛋白主要是外源重組蛋白，從而提高產(chǎn)率和Cys向SeCys的轉(zhuǎn)化率，因此具有高活高產(chǎn)雙重優(yōu)勢(shì)。
[0114]實(shí)施例2:用基因擴(kuò)增及突變法和SPP聯(lián)合營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)制備基因工程人GPXl突變體蛋白
[0115]用mRNA 小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN_10)從人 H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細(xì)胞中提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV RT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過(guò)RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))將其轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因文庫(kù)中公開(kāi)的人GPXl的基因(參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2)序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點(diǎn)，并將第2和202號(hào)Cys的密碼子替換成Ala的密碼子，其它氨基酸序列不變；具體的5'端引物是5’ -GGAATTCCATATGGCTGCTGCTCGGC-3’，3 '端引物是 5’ -CCCAAGCTTCTAGGCAGCGCTGGGC-3’。用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，用DNA連接酶連接到同樣酶切的pCold III(TAKARA, Cat.#3369)載體上。在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)49號(hào)SeCys比鄰的氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，引物長(zhǎng)25-50bp，以49號(hào)SeCys的密碼子(TGA)為中心，正義引物的序列是5’ -GAATGTGGCGTCCCTCTGCGGCACCACGGTCCGGGAC-3’。用這兩條完全互補(bǔ)的引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖?InvitiOgen公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)，將構(gòu)建在原核表達(dá)載體pCold III上的GPXl基因的第49號(hào)SeCys的編碼序列TGA突變成Cys的密碼子(TGC)，通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生。用同樣方法將人GPXl基因中其它所有Cys的密碼子突變成Ala的密碼子；對(duì)應(yīng)的正義引物分別是:C78A5’ -GTGCTCGGCTTCCCG￡￡CAACCAGITTGGGC-3’，C115A5’ -CATGCTCTTCGAGAAGe￡CGAGGTGAACGGTGC-3’，C156A5’ -CACCTGGTCTCCGGTG￡￡TCGCAACGATGTTGC-3’。最后在保持GPXl突變體氨基酸序列不變的前提下突變掉基因中所有ACA序列，即將第168、537、561和573號(hào)堿基C全部突變?yōu)門(mén)，共用3條引物，其正義序列分別是5’-CACGGTCCGGGACTATACCCAGATGAACGAG-3’，5’-CCCCTACGCAGGTATAGCCGCCGCTTCC-3’，5’-CGCTTCCAGACCATTGATATCGAGCCTGATATCGAAGCCCTGCTGTC-3’;通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明序列I (Seql)所述的GPXl突變體蛋白。
[0116]用裝有GPXl突變體基因的載體(pCold II1-GPXl突)轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性菌株。再將表達(dá)核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒pMazF (TAKARA, Cat.#3369)轉(zhuǎn)化到該陽(yáng)性菌株中。將菌液均勻涂布在含100 μ g/mLAmp>25 μ g/mLKana和25 μ g/mL的M9-CAA固體培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于1.2L M9缺陷表達(dá)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.5。將菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷卻，之后將菌液置于15°C中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)45min。15°C 5000rpm離心5min,棄上清。0.9%NaCl重懸菌體沉淀，15°C 5000rpm離心5min,棄上清，重復(fù)該步驟。然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸菌體，加入終濃度為lmmol/LIPTG和終濃度為200 μ g/mL SeCys, 15°C振蕩培養(yǎng)16-72h，使GPXl突變體蛋白以可溶性形式表達(dá)在菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過(guò)識(shí)別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)。收集菌體(6000rpm，IOmin)并用等體積的 bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀， 加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說(shuō)明書(shū)處理GSH親合柱，應(yīng)用緩沖液(50mmol/LTriS，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為21.9kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1的第2泳道。其GPX活力為31985υ/μπι01，超過(guò)天然GPX一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0117]本實(shí)施例使用的SPP低溫表達(dá)系統(tǒng)能利用MazF蛋白酶特異性識(shí)別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無(wú)ACA序列的蛋白質(zhì)，因此新合成的蛋白主要是外源重組蛋白，從而提高產(chǎn)率和Cys向SeCys的轉(zhuǎn)化率，因此具有高活高產(chǎn)雙重優(yōu)勢(shì)。
[0118]實(shí)施例3:用合成的基因和營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)制備基因工程人GPXl突變體蛋白
[0119]根據(jù)本發(fā)明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)序列1(SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體蛋白的基因，確保GPXl突變體基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點(diǎn)，GPXl突變體基因的第49號(hào)SeCys的編碼序列TGA替換為Cys的密碼子(TGC);具體的靶基因序列是將GPXl基因(參見(jiàn)NCBI, NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密碼子替換為丙氨酸的編碼序列(依次是:GCT、GCC、GCC、GCT、GCT)，第49位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的編碼序列(TGC)所得到的能編碼本發(fā)明序列I (SEQ ID No:l)所述的GPXl突變體蛋白的基因，且靶基因的
端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點(diǎn)；用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，連接到同樣酶切的pCold III(TAKARA, Cat.#3369)載體上。
[0120]用裝有GPXl突變體基因的載體(pCold II1-GPXl突)轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于1.2L M9缺陷表達(dá)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.1，培養(yǎng)至0D600約為0.3-1，加入終濃度0.1-1mM的IPTG，IOmin后加入終濃度10 μ g/ml的氯霉素。加入氯霉素五分鐘后培養(yǎng)液離心，低溫6000rpm離心5分鐘，用冰浴的生理鹽溶液洗兩次，每次用1.2L，然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸，并向培養(yǎng)基中補(bǔ)充終濃度400 μ g的利福平和600 μ M SeCys。繼續(xù)培養(yǎng)2_12h，使GPXl以可溶性形式表達(dá)在菌體的周質(zhì)腔里。收集菌體(6000rpm, IOmin)并用等體積的bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說(shuō)明書(shū)處理GSH親合柱，應(yīng)用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為21.9kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1的第3泳道。其GPX活力為7815υ/μπι01，達(dá)到天然GPX的數(shù)量級(jí)水平。
[0121]營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3) Cys來(lái)源于題目為“Structure of theCathelicidin Motif of Protegrin~3Precursor: Structural Insights into theActivation Mechanism of an Antimicrobial Protein”的文章，2002年發(fā)表在 Structure第10卷，1363 - 1370頁(yè)。該菌種的獲取可以由文章作者或August Bock教授贈(zèng)予。[0122]實(shí)施例4:用基因擴(kuò)增及突變法和營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)制備基因工程人GPXl突變體蛋白
[0123]用mRNA 小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN_10)從人 H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細(xì)胞中提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV RT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過(guò)RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))將其轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因文庫(kù)中公開(kāi)的人GPXl的基因(參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2)序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點(diǎn)，并將第2和202號(hào)Cys的密碼子替換成Ala的密碼子，其它氨基酸序列不變；具體的5'端引物是5’ -GGAATTCCATATGGCTGCTGCTCGGC-3 ’，3 '端引物是 5 ’ -CCCAAGCTTCTAGGCAGCGCTGGGC-3，。用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，用DNA連接酶連接到同樣酶切的pColdIII (TAKARA，Cat.#3369)載體上。在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)49號(hào)SeCys比鄰的氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，引物長(zhǎng)25_50bp，以49號(hào)SeCys的密碼子(TGA)為中心。用這兩條完全互補(bǔ)的引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Invitrogen公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)，將構(gòu)建在原核表達(dá)載體pCold III上的GPXl基因的第49號(hào)SeCys的編碼序列TGA突變成Cys的密碼子(TGC)，通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，用同樣方法將人GPXl基因中其它所有Cys的編碼序列突變成Ala的密碼子，對(duì)應(yīng)的正義引物分別是:C78A5’ -GTGCTCGGCTTCCCGGCCAACCAGTTTGGGC-3’，Cl 15A5’ -CATGCTCTTCGAGAAGGCCGAGGTGAACGGTGC-3，，和 C156A5，-CACCTGGTCTCCGGTGGCTCGCAACGATGTTGC-3 ’。通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明序列2 (SEQ ID No:2)所述的GPXl突變體蛋白。 [0124]用裝有GPXl突變體基因的載體(pCold II1-GPXl突)轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于1.2L M9缺陷表達(dá)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.1，培養(yǎng)至0D600約為0.3-1，加入終濃度0.1-1mM的IPTG，IOmin后加入終濃度10 μ g/ml的氯霉素。加入氯霉素五分鐘后培養(yǎng)液離心，低溫6000rpm離心5分鐘，用冰浴的生理鹽溶液洗兩次，每次用
1.2L，然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸，并向培養(yǎng)基中補(bǔ)充終濃度400 μ g的利福平和600 μ M SeCys。繼續(xù)培養(yǎng)2_12h，使GPXl以可溶性形式表達(dá)在菌體的周質(zhì)腔里。收集菌體(6000rpm, IOmin)并用等體積的bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說(shuō)明書(shū)處理GSH親合柱，應(yīng)用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為21.9kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1的第4泳道。其GPX活力為7512U/μ mo I，達(dá)到天然GPX的數(shù)量級(jí)水平。
[0125]實(shí)施例5:用合成的基因和哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)一步轉(zhuǎn)染制備人GPXl突變體蛋白
[0126]1.人GPXl突變體蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)本發(fā)明序列1(SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體的氨基酸序列在生物試劑公司用DNA合成儀人工合成GPXl突變體基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Hind III酶切位點(diǎn)，3'端在人GPXl突變體基因終止密碼子下游GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基后插入BamHI酶切位點(diǎn)；具體的靶基因序列是將GPXl基因(參見(jiàn)NCBI,NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密碼子替換為丙氨酸的編碼序列(依次是:GCT、GCC、GCC、GCT、GCT)所得到的能編碼本發(fā)明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體蛋白的基因，且靶基因的3'端含有GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn)NCBI,NM_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基后插入BamHI酶切位點(diǎn)。用先酶切后連接的方法，通過(guò)Hind III/BamHI酶切位點(diǎn)將GPXl突變體基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；同理根據(jù)基因文庫(kù)中人硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點(diǎn)。用先酶切后連接的方法，通過(guò)Xbal/EcoRI酶切位點(diǎn)將SBP2的羧基端(343_854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA(Invitrogen公司)上。
[0127]2.人GPXl突變體基因陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選:當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到IXlO6Ail的密度時(shí)，用含有SBP2和GPXl突變體基因的表達(dá)載體在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說(shuō)明書(shū)使用)介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開(kāi)始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時(shí)后換含有G418和Zeocin的培養(yǎng)液，篩選具有兩種抗性即同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，期間G418和Zeocin濃度分別從800-200 μ g/ml和400-100 μ g/ml逐步遞減,每次分別減200 μ g/ml和100 μ g/ml，每個(gè)濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將陽(yáng)性細(xì)胞克隆用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)。用抗GPXl多克隆抗體和ELISA技術(shù)檢測(cè)GPXl突變體蛋白的表達(dá)量，挑選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株用于擴(kuò)培養(yǎng)和凍存。
[0128]3.人GPXl突變體蛋白的表達(dá)與純化:在大容量含有1-10 μ M亞硒酸鈉的293F表達(dá)培養(yǎng)基中擴(kuò)培養(yǎng)2中篩選獲得的同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株。在SBP2、SECIS和293細(xì)胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPXl突變體蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌于培養(yǎng)基中，每48小時(shí)收集一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPXl突變體蛋白，收集含有GPX4的洗脫液，透析除去小分子物質(zhì)，凍干即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為21.9kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1的第5泳道。其GPX活力為31738υ/μπι01，超過(guò)天然GPX—個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0129]實(shí)施例6:用合成的基因和哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分步轉(zhuǎn)染制備人GPXl突變體蛋白
[0130]1.人GPXl突變體蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)本發(fā)明序列1(SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體的氨基酸序列在生物試劑公司用DNA合成儀人工合成GPXl突變體基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Hind III酶切位點(diǎn)，3'端在人GPXl突變體基因終止密碼子下游GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基后插入BamHI酶切位點(diǎn)；具體的靶基因序列是將GPXl基因(參見(jiàn)NCBI,NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密碼子替換為丙氨酸的編碼序列(依次是:GCT、GCC、GCC、GCT、GCT)所得到的能編碼本發(fā)明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體蛋白的基因，且靶基因的3'端含有GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn)NCBI,NM_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基后插入BamHI酶切位點(diǎn)。用先酶切后連接的方法，通過(guò)Hind III/BamHI酶切位點(diǎn)將GPXl突變體基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；同理根據(jù)基因文庫(kù)中人硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點(diǎn)。用先酶切后連接的方法，通過(guò)Xbal/EcoRI酶切位點(diǎn)將SBP2的羧基端(343_854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA (Invitrogen公司)上。
[0131]2.人GPXl突變體基因陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選:當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到IXlO6Ail的密度時(shí)，用含有SBP2基因的表達(dá)載體在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說(shuō)明書(shū)使用)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開(kāi)始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時(shí)后換含有G418的培養(yǎng)液，篩選具有G418抗性即穩(wěn)定表達(dá)SBP2的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，期間G418濃度從800 μ g/ml逐步遞減到200 μ g/ml，每次減200 μ g/ml，每個(gè)濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將陽(yáng)性細(xì)胞克隆用96、48、24、12 和6孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)。再用含有GPXl突變體基因的表達(dá)載體在lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說(shuō)明書(shū)使用)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)SBP2的293F細(xì)胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開(kāi)始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時(shí)后換含有G418和Zeocin的培養(yǎng)液篩選具有兩種抗性即同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，期間G418濃度維持在200 μ g/ml,Zeocin濃度從400 μ g/ml逐步遞減到100 μ g/ml,每次減100 μ g/ml,每個(gè)濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將具有兩種抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克隆用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)。用抗GPXl的多克隆抗體和ELISA技術(shù)檢測(cè)GPXl突變體蛋白的表達(dá)量，挑選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株用于擴(kuò)培養(yǎng)和凍存。
[0132]上述方法也可以先轉(zhuǎn)染GPXl突變體基因，后轉(zhuǎn)染SBP2基因。
[0133]3.人GPXl突變體的表達(dá)與純化:在大容量含有1-10 μ M亞硒酸鈉的293F表達(dá)培養(yǎng)基中擴(kuò)培養(yǎng)2中篩選獲得的同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株。在SBP2、SECIS和293F細(xì)胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPXl突變體以可溶性形式表達(dá)并分泌于培養(yǎng)基中，每48小時(shí)收集一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPXl突變體，收集含有GPXl突變體的洗脫液，透析除去小分子物質(zhì)，凍干即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為21.9kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1的第6泳道。其GPX活力為31506υ/μπιΟ1，超過(guò)天然GPX —個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0134]實(shí)施例7:用擴(kuò)增的靶基因和和哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)一步轉(zhuǎn)染制備人GPXl突變體蛋白
[0135]1.人GPXl突變體蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建:用mRNA小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN-10)從人H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細(xì)胞中提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶(AMVRT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過(guò)RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))將其轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因文庫(kù)中公開(kāi)的人GPXl的基因序列(參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GPXl的編碼基因及其3'端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確保靶基因的
端含有起始密碼子(ATG)和BamHI酶切位點(diǎn)，第2位Cys的密碼子替換為Ala的編碼序列，其它氨基酸序列不變，3'端在終止密碼子下游引入GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2)和Hind III酶切位點(diǎn)；用相同的限性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點(diǎn)的靶基因和哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPXl基因連同其:V端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；具體的5'端引物是5’ -CCCAAGCTTCATATGGCTGCTGCTCGGC-3’，3'端引物是5’-CGGGATCCAGT GGGGAAACTCG-3’。用先酶切后連接的方法，通過(guò)Hind III/BamHI酶切位點(diǎn)將GPXl基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)GPXl中要突變?yōu)楸彼岬陌腚装彼岷退揉彽陌被岬幕蛐蛄性O(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，將?gòu)建在原核表達(dá)載體上的人GPXl基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成丙氨酸的密碼子；具體的正義引物分別是:C78A5’ -GTGCTCGGCTTCCCG￡￡CAACCAGTTTGGGC-3’ , Cl15A5J-CATGCTCTTCGAGMGGCCGAGGTGAACGGTGC-3J，C156A5J-CACCTGGTCTCCGGTGGCTCGCAACGATGTTGC-3’ 和 C202A5’ -GTCTCAAGGGCCCAGCg￡TGCCTAGGGCGCCCCTC-3’ ；通過(guò) DNA 測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明序列I (SEQ ID No:l)所述的GPXl突變體蛋白。根據(jù)基因文庫(kù)中人硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2,NCBI, NM_024077.3)羧基端343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點(diǎn)；具體的Y端引物是5 ’ -GCTCTAGAATGGAAGCTTTATCTTC-3 ’，3 ^端引物是5’ -CGGAATTCTAAATTCAAATTC-3’。用先酶切后連接的方法，通過(guò)Xbal/EcoRI酶切位點(diǎn)將SBP2的羧基端(343-854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA(Invitrogen 公司)上。
[0136]2.人GPXl突變體基因陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選:當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到IXlO6Ail的密度時(shí)，用含有SBP2和GPXl突變體基因的表達(dá)載體在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說(shuō)明書(shū)使用)介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開(kāi)始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時(shí)后換含有G418和Zeocin的培養(yǎng)液，篩選具有兩種抗性即同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，期間G418和Zeocin濃度分別從800-200 μ g/ml和400-100 μ g/ml逐步遞減,每次分別減200 μ g/ml和100 μ g/ml，每個(gè)濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將陽(yáng)性細(xì)胞克隆用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)。用抗GPXl多克隆抗體和ELISA技術(shù)檢測(cè)GPXl突變體蛋白的表達(dá)量，挑選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株用于擴(kuò)培養(yǎng)和凍存。
[0137]3.人GPXl突變體蛋白的表達(dá)與純化:在大容量含有1-10 μ M亞硒酸鈉的293F表達(dá)培養(yǎng)基中擴(kuò)培養(yǎng)2中篩選獲得的同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株。在SBP2、SECIS和293細(xì)胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPXl突變體蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌于培養(yǎng)基中，每48小時(shí)收集一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPXl突變體蛋白，收集含有GPX4的洗脫液，透析除去小分子物質(zhì)，凍干即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為21.9kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1的第7泳道。其GPX活力為30967υ/μπιΟ1，超過(guò)天然GPX—個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0138]實(shí)施例8:用擴(kuò)增的靶基因和和哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分步轉(zhuǎn)染制備人GPXl突變體蛋白
[0139]1.人GPXl突變體蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建:用mRNA小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN-10)從人H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細(xì)胞中提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶(AMVRT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過(guò)RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))將其轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因文庫(kù)中公開(kāi)的人GPXl的基因序列(參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GPXl的編碼基因及其3'端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確保靶基因的
端含有起始密碼子(ATG)和HindIII酶切位點(diǎn)，第2位Cys的密碼子替換為Ala的編碼序列，其它氨基酸序列不變，3'端在終止密碼子下游引入GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個(gè)堿基到多聚寡核苷酸A前一個(gè)堿基，具體序列參見(jiàn)NCBI，NM_000581.2)和BamHI酶切位點(diǎn)；用相同的限性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點(diǎn)的靶基因和哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPXl基因連同其:V端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；具體的5'端引物是5’ -CCCAAGCTTCATATGGCTGCTGCTCGGC-3’，3'端引物是5’ -CG GGA TCCAGT GGGGAMCTCG-3’。用先酶切后連接的方法，通過(guò)Hind III/BamHI酶切位點(diǎn)將GPXl基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)GPXl中要突變?yōu)榻z氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖校瑢?gòu)建在原核表達(dá)載體上的人GPXl基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；具體的正義引物分別是:C78A5’ -GTGCTCGGCTTCCCGe￡CAACCAGTTTGGGC-3’ , Cl15A5J-CATGCTCTTCGAGAAGGCCGAGGTGAACGGTGC-3J，C156A5J-CACCTGGTCTCCGGTGGCTCGCAACGATGTTGC-3’ 和 C202A5’ -GTCTCAAGGGCCCAGC￡￡TGCCTAGGGCGCCCCTC-3’ ；通過(guò) DNA 測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明序列I (SEQ ID No:l)所述的GPXl突變體蛋白。根據(jù)基因文庫(kù)中人硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2,NCBI, NM_024077.3)羧基端343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點(diǎn)；具體的Y端引物是5 ’ -GCTCTAGAATGGAAGCTTTATCTTC-3 ’，3 ^端引物是5’ -CGGAATTCTAAATTCAAATTC-3’。用先酶切后連接的方法，通過(guò)Xbal/EcoRI酶切位點(diǎn)將SBP2的羧基端(343-854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA (Invitrogen 公司)上。
[0140]2.人GPXl突變體基因陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選:當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到IXlO6Ail的密度時(shí)，用含有SBP2基因的表達(dá)載體在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說(shuō)明書(shū)使用)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開(kāi)始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時(shí)后換含有G418的培養(yǎng)液，篩選具有G418抗性即穩(wěn)定表達(dá)SBP2的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，期間G418濃度從800 μ g/ml逐步遞減到200 μ g/ml，每次減200 μ g/ml，每個(gè)濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將陽(yáng)性細(xì)胞克隆用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)。再用含有GPXl突變體基因的表達(dá)載體在lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說(shuō)明書(shū)使用)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)SBP2的293F細(xì)胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開(kāi)始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時(shí)后換含有G418和Zeocin的培養(yǎng)液篩選具有兩種抗性即同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，期間G418濃度維持在200 μ g/ml,Zeocin濃度從400 μ g/ml逐步遞減到100 μ g/ml,每次減100 μ g/ml,每個(gè)濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將具有兩種抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克隆用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)。用抗GPXl的多克隆抗體和ELISA技術(shù)檢測(cè)GPXl突變體蛋白的表達(dá)量，挑選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株用于擴(kuò)培養(yǎng)和凍存。
[0141]上述方法也可以先轉(zhuǎn)染GPXl突變體基因，后轉(zhuǎn)染SBP2基因。
[0142]3.人GPXl突變體的表達(dá)與純化:在大容量含有1-10 μ M亞硒酸鈉的293F表達(dá)培養(yǎng)基中擴(kuò)培養(yǎng)2中篩選獲得的同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株。在SBP2、SECIS和293F細(xì)胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPXl突變體以可溶性形式表達(dá)并分泌于培養(yǎng)基中，每48小時(shí)收集一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPXl突變體，收集含有GPXl突變體的洗脫液，透析除去小分子物質(zhì)，凍干即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為21.9kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1的第8泳道。其GPX活力為30069U/μ mo I，超過(guò)天然GPX —個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0143]實(shí)施例9:用合成的基因聯(lián)合SPP和營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)制備基因工程人GPX2突變體蛋白
[0144]根據(jù)本發(fā)明序列2 (SEQ ID No:2)所述的GPX2突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)序列2 (SEQ ID No:2)所述的GPX2突變體蛋白的基因，確保GPX2突變體基因的5/端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，
端含有終止密碼子 和Hind III酶切位點(diǎn)，GPX2突變體基因的第40號(hào)SeCys的編碼序列TGA替換為Cys的密碼子(TGC)，且基因全長(zhǎng)不含有ACA序列；具體的靶基因序列是將GPX2基因(參見(jiàn)NCBI, NM_002083.3)中第55、68、77和105位的半胱氨酸的密碼子替換為丙氨酸的編碼序列(依次是:GGC、GGC、GGT、GGT)，第40位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的編碼序列(TGC)，并在不改變氨基酸序列的前提下將GPX2基因中所有ACA序列突變掉，獲得無(wú)ACA序列的GPX2突變體基因，確保該基因能編碼本發(fā)明序列2 (SEQ ID No:2)所述的GPX2突變體蛋白，且靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點(diǎn)；用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，連接到同樣酶切的pCold III (TAKARA, Cat.#3369)載體上。
[0145]用裝有GPX2突變體基因的載體(pCold II1-GPX2突)轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性菌株。再將表達(dá)核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒pMazF (TAKARA, Cat.#3369)轉(zhuǎn)化到該陽(yáng)性菌株中。將菌液均勻涂布在含100 μ g/mLAmp>25 μ g/mLKana和25 μ g/mL的M9-CAA固體培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于1.2L M9缺陷表達(dá)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.5。將菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷卻，之后將菌液置于15°C中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)45min。15°C 5000rpm離心5min,棄上清。用0.9%NaCl重懸菌體沉淀，15°C 5000rpm離心5min,棄上清，重復(fù)該步驟。然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸菌體，加入終濃度為lmmol/L IPTG和終濃度為200 μ g/mL SeCys, 15°C振蕩培養(yǎng)16-72h，使GPX2突變體蛋白以可溶性形式表達(dá)在菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過(guò)識(shí)別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)。收集菌體(6000rpm，IOmin)并用等體積的 bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說(shuō)明書(shū)處理GSH親合柱，應(yīng)用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平 衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPX2突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為21.8kDa，且與抗GPX2抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1的第9泳道。其GPX活力為3925U/μ mo I，達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0146]本實(shí)施例使用的SPP低溫表達(dá)系統(tǒng)能利用MazF蛋白酶特異性識(shí)別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無(wú)ACA序列的蛋白質(zhì)，因此新合成的蛋白主要是外源重組蛋白，從而提高產(chǎn)率和Cys向SeCys的轉(zhuǎn)化率，因此具有高活高產(chǎn)雙重優(yōu)勢(shì)。
[0147]實(shí)施例10:用合成的基因聯(lián)合SPP和營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)制備基因工程人GPX3突變體蛋白
[0148]根據(jù)本發(fā)明序列3 (SEQ ID No:3)所述的GPX3突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)序列3 (SEQ ID No:3)所述的GPX3突變體蛋白的基因，確保GPX3突變體基因的5/端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，
端含有終止密碼子和Hind III酶切位點(diǎn)，GPX3突變體基因的第54號(hào)SeCys的編碼序列TGA替換為Cys的密碼子(TGC)，且基因全長(zhǎng)不含有ACA序列；具體的靶基因序列是將GPX3基因(參見(jiàn)NCBI，、NM_002084.3)中第13、82、和137位的半胱氨酸的密碼子替換為丙氨酸的編碼序列(依次是:GCC、GGC、GGT)，第54位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的編碼序列(TGC)，并在不改變氨基酸序列的前提下將GPX3基因中所有ACA序列突變掉，獲得無(wú)ACA序列的GPX3突變體基因，確保該基因能編碼本發(fā)明序列3 (SEQ ID No:3)所述的GPX3突變體蛋白，且靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點(diǎn)；用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，連接到同樣酶切的 pCold III (TAKARA, Cat.#3369)載體上。
[0149]用裝有GPX3突變體基因的載體(pCold II1-GPX3突)轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性菌株。再將表達(dá)核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒pMazF (TAKARA, Cat.#3369)轉(zhuǎn)化到該陽(yáng)性菌株中。將菌液均勻涂布在含100 μ g/mLAmp>25 μ g/mLKana和25 μ g/mL的M9-CAA固體培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于1.2L M9缺陷表達(dá)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.5。將菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷卻，之后將菌液置于15°C中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)45min。15°C 5000rpm離心5min,棄上清。用0.9%NaCl重懸菌體沉淀，15°C 5000rpm離心5min,棄上清，重復(fù)該步驟。然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸菌體，加入終濃度為lmmol/L IPTG和終濃度為200 μ g/mL SeCys, 15°C振蕩培養(yǎng)16-72h，使GPX3突變體蛋白以可溶性形式表達(dá)在菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過(guò)識(shí)別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)。收集菌體(6000rpm，IOmin)并用等體積的 bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說(shuō)明書(shū)處理GSH親合柱，應(yīng)用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPX3突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為23.4kDa，且與抗GPX3抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1的第10泳道。其GPX活力為3692U/ym0l，達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0150]本實(shí)施例使用的SPP低溫表達(dá)系統(tǒng)能利用MazF蛋白酶特異性識(shí)別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無(wú)ACA序列的蛋白質(zhì)，因此新合成的蛋白主要是外源重組蛋白，從而提高產(chǎn)率和Cys向SeCys的轉(zhuǎn)化率，因此具有高活高產(chǎn)雙重優(yōu)勢(shì)。
[0151]實(shí)施例11:用合成的基因聯(lián)合SPP和營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核表達(dá)系統(tǒng)制備基因工程人GPX4突變體蛋白
[0152] 根據(jù)本發(fā)明序列4 (SEQ ID No:4)所述的GPX4突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)序列4 (SEQ ID No:4)所述的GPX4突變體蛋白的基因，確保GPX4突變體基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點(diǎn)，GPX4突變體基因的第46號(hào)SeCys的編碼序列TGA替換為Cys的密碼子(TGC)，且基因全長(zhǎng)不含有ACA序列；具體的靶基因序列是將GPX4基因(參見(jiàn)NCBI,、NM_002085.3)中第2、10、37、66、75、107和148位的半胱氨酸的密碼子替換為丙氨酸的編碼序列，第46位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的編碼序列(TGC)，并在不改變氨基酸序列的前提下將GPX4基因中所有ACA序列突變掉，獲得無(wú)ACA序列的GPX4突變體基因，確保該基因能編碼本發(fā)明序列4 (SEQ ID No:4)所述的GPX4突變體蛋白，且靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點(diǎn)；用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，連接到同樣酶切的 pCold III (TAKARA, Cat.#3369)載體上。
[0153]用裝有GPX4突變體基因的載體(pCold II1-GPX4突)轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性菌株。再將表達(dá)核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒pMazF (TAKARA, Cat.#3369)轉(zhuǎn)化到該陽(yáng)性菌株中。將菌液均勻涂布在含100 μ g/mLAmp>25 μ g/mLKana和25 μ g/mL的M9-CAA固體培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于1.2L M9缺陷表達(dá)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.5。將菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷卻，之后將菌液置于15°C中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)45min。15°C 5000rpm離心5min,棄上清。用0.9%NaCl重懸菌體沉淀，15°C 5000rpm離心5min,棄上清，重復(fù)該步驟。然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸菌體，加入終濃度為lmmol/L IPTG和終濃度為200 μ g/mL SeCys, 15°C振蕩培養(yǎng)16-72h，使GPX4突變體蛋白以可溶性形式表達(dá)在菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過(guò)識(shí)別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)。收集菌體(6000rpm，IOmin)并用等體積的 bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說(shuō)明書(shū)處理GSH親合柱，應(yīng)用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPX4突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為19.2kDa，且與抗GPX4抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標(biāo)蛋白，見(jiàn)圖1的第11泳道。其GPX活力為1092U/ymOl，達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0154]本實(shí)施例使用的SPP低溫表達(dá)系統(tǒng)能利用MazF蛋白酶特異性識(shí)別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無(wú)ACA序列的蛋白質(zhì)，因此新合成的蛋白主要是外源重組蛋白，從而提高產(chǎn)率和Cys向SeCys的轉(zhuǎn)化率，因此具有高活高產(chǎn)雙重優(yōu)勢(shì)。
[0155]實(shí)施例12:
[0156]除將實(shí)施例1所用的表達(dá)載體pCold III (TAKARA，Cat.#3369)換成帶組氨酸純化標(biāo)簽的pColdl (TAKARA, Cat.#3367)，其余與實(shí)施例1完全相同，即最終將獲得本發(fā)明序列9 (SEQ ID No:9)所述的GPXl突變體蛋白。該突變體在氨基端引入了載體上包括6個(gè)組氨酸在內(nèi)的16個(gè)外源氨基酸，因此分子量有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上可以看到，見(jiàn)圖2的第5泳道，其優(yōu)點(diǎn)是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其GPX活力為31226U/ym0l，略低于實(shí)施例1，證明純化標(biāo)簽對(duì)蛋白的活力沒(méi)有明顯影響，活力超過(guò)天然GPX 一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0157]實(shí)施例13:
[0158]除將實(shí)施例9所用的表達(dá)載體pCold III (TAKARA, Cat.#3369)換成帶組氨酸純化標(biāo)簽的pColdl (TAKARA, Cat.#3367)，其余與實(shí)施例9完全相同，即最終將獲得本發(fā)明序列10(SEQ ID No:10)所述的GPX2突變體蛋白。該突變體在氨基端引入了載體上包括6個(gè)組氨酸在內(nèi)的16個(gè)外源氨基酸，因此分子量較實(shí)施例9有所增加，在SDS-PAGE和WesternBlot結(jié)果上可以看到，見(jiàn)圖2的第6泳道，其優(yōu)點(diǎn)是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其GPX活力為3826U/ μ mol，略低于實(shí)施例9，證明純化標(biāo)簽對(duì)蛋白的活力沒(méi)有明顯影響，活力達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0159]實(shí)施例14:
[0160]除將實(shí)施例10所用的表達(dá)載體pCold III (TAKARA, Cat.#3369)換成帶組氨酸純化標(biāo)簽的pCold I (TAKARA, Cat.#3367)，其余與實(shí)施例10完全相同，即最終將獲得本發(fā)明序列11 (SEQ IDNo: 11)所述的GPX3突變體蛋白。該突變體在氨基端引入了載體上包括6個(gè)組氨酸在內(nèi)的16個(gè)外源氨基酸，因此分子量較實(shí)施例10有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上可以看到，見(jiàn)圖2的第7泳道，其優(yōu)點(diǎn)是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其GPX活力為3602U/ymol，略低于實(shí)施例10，證明純化標(biāo)簽對(duì)蛋白的活力沒(méi)有明顯影響，活力達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0161]實(shí)施例15:[0162]除將實(shí)施例11所用的表達(dá)載體pCold III (TAKARA, Cat.#3369)換成帶組氨酸純化標(biāo)簽的pCold I (TAKARA, Cat.#3367)，其余與實(shí)施例11完全相同，即最終將獲得本發(fā)明序列12 (SEQ IDNo: 12)所述的GPX4突變體蛋白。該突變體在氨基端引入了載體上包括6個(gè)組氨酸在內(nèi)的16個(gè)外源氨基酸，因此分子量較實(shí)施例11有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上可以看到，見(jiàn)圖2的第8泳道，其優(yōu)點(diǎn)是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其GPX活力為1086U/ymol，略低于實(shí)施例11，證明純化標(biāo)簽對(duì)蛋白的活力沒(méi)有明顯影響，活力達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0163]實(shí)施例16:
[0164]與實(shí)施例1制備方法完全相同，只是合成GPXl突變體的編碼基因時(shí)將第2位丙氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，最后獲得的GPXl突變體蛋白的第2位是絲氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列不變，即本發(fā)明序列5 (SEQ ID Νο:5)所述的GPXl突變體蛋白。該突變體分子量?jī)H有微小的變化，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上沒(méi)有區(qū)別，見(jiàn)圖2的第I泳道。但其GPX活力為30235U/ymol，略低于實(shí)施例1，超過(guò)天然GPX—個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0165]實(shí)施例17:
[0166]與實(shí)施例9制備方法完全相同，只是合成GPX2突變體的編碼基因時(shí)將第55位丙氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，最后獲得的GPX2突變體蛋白的第55位是絲氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列不變，即本發(fā)明序列6 (SEQ ID Νο:6)所述的GPX2突變體蛋白。該突變體分子量?jī)H有微小的變化，在SDS-PAGE和Western Blot與實(shí)施例9的GPX2結(jié)果上沒(méi)有區(qū)別，見(jiàn)圖2的第2泳道。但其GPX活力為3835U/ μ mol，略低于實(shí)施例9，達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0167]實(shí)施例18:
[0168]與實(shí)施例10制備方法完全相同，只是合成GPX3突變體的編碼基因時(shí)將第65位丙氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，最后獲得的GPX3突變體蛋白的第65位是絲氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列不變，即本發(fā)明序列7 (SEQ ID No:7)所述的GPX3突變體蛋白。該突變體分子量?jī)H有微小的變化，在SDS-PAGE和Western Blot與實(shí)施例10的GPX3結(jié)果上沒(méi)有區(qū)別，見(jiàn)圖2的第3泳道。但其GPX活力為3619U/ μ mol，略低于實(shí)施例10，達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0169]實(shí)施例19:
[0170]與實(shí)施例11制備方法完全相同，只是合成GPX4突變體的編碼基因時(shí)將第2位丙氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，最后獲得的GPX4突變體蛋白的第2位是絲氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列不變，即本發(fā)明序列8 (SEQ ID No:8)所述的GPX4突變體蛋白。該突變體分子量?jī)H有微小的變化，在SDS-PAGE和Western Blot與與實(shí)施例11的GPX4結(jié)果上沒(méi)有區(qū)別，見(jiàn)圖2的第4泳道。但其GPX活力為1025U/ μ mol，略低于實(shí)施例11，達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0171]實(shí)施例20:
[0172]除將實(shí)施例16所用的表達(dá)載體pCold III (TAKARA, Cat.#3369)換成帶組氨酸純化標(biāo)簽的pCold I (TAKARA, Cat.#3367)，其余與實(shí)施例16完全相同，即最終將獲得本發(fā)明序列13 (SEQ IDNo: 13)所述的GPXl突變體蛋白。該突變體在氨基端引入了載體上包括6個(gè)組氨酸在內(nèi)的16個(gè)外源氨基酸，因此分子量較實(shí)施例16有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上可以看到，見(jiàn)圖2的第9泳道，其優(yōu)點(diǎn)是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其GPX活力為30832υ/μπιΟ1，略高于實(shí)施例16，證明純化標(biāo)簽對(duì)蛋白的活力沒(méi)有明顯影響，活力達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0173]實(shí)施例21:
[0174]除將實(shí)施例17所用的表達(dá)載體pCold III (TAKARA, Cat.#3369)換成帶組氨酸純化標(biāo)簽的pCold I (TAKARA, Cat.#3367)，其余與實(shí)施例17完全相同，即最終將獲得本發(fā)明序列14 (SEQ IDNo: 14)所述的GPX2突變體蛋白。該突變體在氨基端引入了載體上包括6個(gè)組氨酸在內(nèi)的16個(gè)外源氨基酸，因此分子量較實(shí)施例17有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上可以看到，見(jiàn)圖2的第10泳道，其優(yōu)點(diǎn)是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其GPX活力為3752υ/μπι01，略低于實(shí)施例17，證明純化標(biāo)簽對(duì)蛋白的活力沒(méi)有明顯影響，活力達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0175]實(shí)施例22:
[0176]除將實(shí)施例18所用的表達(dá)載體pCold III (TAKARA, Cat.#3369)換成帶組氨酸純化標(biāo)簽的pCold I (TAKARA, Cat.#3367)，其余與實(shí)施例18完全相同，即最終將獲得本發(fā)明序列15 (SEQ IDNo: 15)所述的GPX3突變體蛋白。該突變體在氨基端引入了載體上包括6個(gè)組氨酸在內(nèi)的16個(gè)外源氨基酸，因此分子量較實(shí)施例18有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上可以看到，見(jiàn)圖2的第11泳道，其優(yōu)點(diǎn)是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其GPX活力為3635υ/μπι01，略低于實(shí)施例18，證明純化標(biāo)簽對(duì)蛋白的活力沒(méi)有明顯影響，活力達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0177]實(shí)施例23:
[0178]除將實(shí)施例19所用的表達(dá)載體pCold III (TAKARA, Cat.#3369)換成帶組氨酸純化標(biāo)簽的pCold I (TAKARA, Cat.#3367)，其余與實(shí)施例19完全相同，即最終將獲得本發(fā)明序列16 (SEQ IDNo: 16)所述的GPX4突變體蛋白。該突變體在氨基端引入了載體上包括6個(gè)組氨酸在內(nèi)的16個(gè)外源氨基酸，因此分子量較實(shí)施例19有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上 可以看到，見(jiàn)圖2的第12泳道，其優(yōu)點(diǎn)是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其GPX活力為1016υ/μπιΟ1，略低于實(shí)施例19，證明純化標(biāo)簽對(duì)蛋白的活力沒(méi)有明顯影響，活力達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0179]實(shí)施例24
[0180]與實(shí)施例1或12制備方法完全相同，只是合成GPXl突變體的編碼基因時(shí)將SEQID No:1或SEQ ID No:5中1_29個(gè)丙氨酸的一個(gè)或多個(gè)的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，比如將78、115、156、202單位點(diǎn)或2和78雙位點(diǎn)的丙氨酸編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，最后獲得的GPXl突變體蛋白的對(duì)應(yīng)位置是絲氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列不變，即本發(fā)明序列17-26 (SEQ ID No: 17-26)所述的GPXl突變體蛋白。該突變體分子量?jī)H有微小的變化，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上沒(méi)有區(qū)別，見(jiàn)圖3的第1_10泳道。其GPX活力為30218-30237U/ymol，略低于實(shí)施例1，超過(guò)天然GPX—個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0181]實(shí)施例25
[0182]與實(shí)施例9或13制備方法完全相同，只是合成GPX2突變體的編碼基因時(shí)將SEQID Νο:2或SEQ ID Νο:6中1_12個(gè)丙氨酸的一個(gè)或多個(gè)的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，比如將77或105位的丙氨酸編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，最后獲得的GPXl突變體蛋白的對(duì)應(yīng)位置是絲氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列不變，即本發(fā)明序列27-30 (SEQ IDNo:27-30)所述的GPXl突變體蛋白。該突變體分子量?jī)H有微小的變化，在SDS-PAGE和WesternBlot結(jié)果上沒(méi)有區(qū)別，見(jiàn)圖4的第1_4泳道。其GPX活力為30218-30237U/ μ mol,略低于實(shí)施例9，超過(guò)天然GPX —個(gè)數(shù)量級(jí)。其GPX活力為3815-3832U/ymol，略低于實(shí)施例9，達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。 [0183]實(shí)施例26:
[0184]與實(shí)施例10或14制備方法完全相同，只是合成GPX3突變體的編碼基因時(shí)將SEQID No:3或SEQ ID No:7中1_10個(gè)丙氨酸的一個(gè)或多個(gè)的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，比如將41或51位的丙氨酸編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，最后獲得的GPXl突變體蛋白的對(duì)應(yīng)位置是絲氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列不變，即本發(fā)明序列31-34 (SEQ ID No:31-34)所述的GPX3突變體蛋白。該突變體分子量?jī)H有微小的變化，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上沒(méi)有區(qū)別，見(jiàn)圖4的第5_8泳道。但其GPX活力為3602-3619U/ymol，略低于實(shí)施例10，達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0185]實(shí)施例27:
[0186]與實(shí)施例11或15制備方法完全相同，只是合成GPX4突變體的編碼基因時(shí)將SEQID Νο:4或SEQ ID No:8中1_18個(gè)丙氨酸的一個(gè)或多個(gè)的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，比如將10或75位的丙氨酸編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，最后獲得的GPXl突變體蛋白的對(duì)應(yīng)位置是絲氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列不變，即本發(fā)明序列35-38 (SEQ ID No:35-38)所述的GPX4突變體蛋白。該突變體分子量?jī)H有微小的變化，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上沒(méi)有區(qū)別，見(jiàn)圖4的第9_12泳道。但其GPX活力為1011-1025U/ymol，略低于實(shí)施例11，達(dá)到天然GPX同一個(gè)數(shù)量級(jí)。
【權(quán)利要求】
1. 一種新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID No: 1、SEQ ID No:2, SEQ ID No:3 或 SEQ ID No:4 所示。
2.如權(quán)利要求1所述的一種新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體，其特征在于:是在SEQ ID No: 1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3或SEQ ID No:4所示氨基酸序列的氨基端或羧基端引入該載體上的組氨酸純化標(biāo)簽和其它的氨基酸等所形成的GPX突變體。
3.如權(quán)利要求2所述的一種新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體，其特征在于:其氨基酸序列如 SEQ ID No:5、SEQ ID No:6、SEQ ID No:7 或 SEQ ID No:8 所示。
4.如權(quán)利要求1所述的一種新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體，其特征在于:是將SEQ ID No: 1、SEQ ID No: 2、SEQ ID No: 3或SEQ ID No:4所示氨基酸序列中靶基因的任何一個(gè)或多個(gè)丙氨酸Ala突變?yōu)榻z氨酸Ser所形成的GPX突變體。
5.如權(quán)利要求3所述的一種新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體，其特征在于:是將SEQ ID No: 5、SEQ ID No:6、SEQ ID No: 7或SEQ ID No:8所示氨基酸序列中靶基因的任何一個(gè)或多個(gè)丙氨酸Ala突變?yōu)榻z氨酸Ser所形成的GPX突變體。
6.如權(quán)利要求4或5所述的一種新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體，其特征在于:其氨基酸序列如 SEQ ID No:9、SEQ ID No: 10、SEQ ID No: 11、SEQ ID No: 12、SEQ IDNo: 13、SEQ ID No: 14、SEQ ID No: 15、SEQ ID No: 16 或 SEQ ID No: 17 ~38 所示。
7.權(quán)利要求1所述的一種新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體的制備方法，其步驟如下: 1)、表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)本發(fā)明所述GPX突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)GPX突變體蛋白的基因，確保靶基因的5'端含有起始密碼子ATG，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)，確保靶基因中唯一的硒代半胱氨酸SeCys的編碼序列替換為半胱氨酸Cys的密碼子，且基因全長(zhǎng)不含有ACA序列；具體的基因序列是將GPXl基因中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為丙氨酸的密碼子，第49位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子，并根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將基因中所有的ACA序列全部替換為非ACA序列所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)GPX突變體蛋白，且全長(zhǎng)不含有ACA序列的編碼基因；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX突變體基因和分泌型原核表達(dá)載體，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX突變體基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而GPX突變體基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達(dá)與純化: 用步驟I)中構(gòu)建的含有GPX突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性菌株；再將含有表達(dá)核酸內(nèi)切酶MazF的pMazF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌株，用含雙抗性的M9固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)IPTG低溫4_25°C誘導(dǎo)表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，直接表達(dá)出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過(guò)識(shí)別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得GPX突變體蛋白純品； 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，是用pH7.5, 50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 所述的將液體低溫離心，是在4°C、8000-12000g離心15_30min ； 或， 1)、表達(dá)載體的構(gòu)建: 根據(jù)基因文庫(kù)中公開(kāi)的GPX1、GPX2、GPX3或GPX4的基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其編碼基因，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確?；虻?'端含有起始密碼子ATG，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)，確保引物中編碼Cys的密碼子替換成Ala的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX中要突變?yōu)榘腚装彼岬奈ㄒ晃腚装彼岷退揉彽陌被岬幕蛐蛄性O(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，將?gòu)建在原核表達(dá)載體上的GPX基因中的硒代半胱氨酸的編碼序列突變成半胱氨酸的密碼子；同理，用上述定點(diǎn)突變的方法在確保不引入ACA序列的前提下，將GPX基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成丙氨酸的密碼子，再根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將GPX基因中所有ACA序列突變掉；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及突變體蛋白的表達(dá)與純化 用步驟I)中構(gòu)建的含有GPX突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含半胱氨酸的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性菌株；再將表達(dá)核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒pMazF轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌株，用含雙抗性的M9固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有硒代半胱氨酸、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β -D-半乳糖苷低溫4-25°C誘導(dǎo)表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys能用半胱氨酸的密碼子合成硒代半胱氨酸，直接表達(dá)出在底物谷胱甘肽的結(jié)合部位含有硒代半胱氨酸的重組GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里,而MazF能通過(guò)識(shí)別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得含GPX突變體的上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化，透析凍干后即得酶蛋白純品； 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 所述的將液體低溫離心， 是在4°C，8000-12000g離心15_30min ； 或，1)、表達(dá)載體的構(gòu)建: 根據(jù)本發(fā)明所述GPX突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)GPX突變體蛋白的基因，確保靶基因的5'端含有起始密碼子ATG，.3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)，確保靶基因中唯一的硒代半胱氨酸SeCys的編碼序列替換為半胱氨酸Cys的密碼子；具體的基因序列是將GPXl基因中第2、.78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為丙氨酸的密碼子，第49位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)GPX突變體蛋白的編碼基因；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX突變體基因和分泌型原核表達(dá)載體，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX突變體基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有而GPX突變體基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達(dá)與純化: 用步驟I)中構(gòu)建的含有GPX突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達(dá)出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPX突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗漆、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得GPX突變體蛋白純品； 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，是用pH7.5, 50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 所述的將液體低溫離心，是在4°C，8000-12000g離心15_30min ； 或， 1)、表達(dá)載體的構(gòu)建: 根據(jù)基因文庫(kù)中公開(kāi)的GPX1、GPX2、GPX3或GPX4的基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其編碼基因，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確?；虻?'端含有起始密碼子ATG，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點(diǎn)，確保引物中編碼Cys的密碼子替換成Ala的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX基因組裝到分泌型原核表達(dá)載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX中要突變?yōu)榘腚装彼酑ys的唯一 SeCys和它比鄰的氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp ;用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，將?gòu)建在原核表達(dá)載體上的GPX基因中的SeCys的編碼序列突變成Cys的密碼子；同理，用上述定點(diǎn)突變的方法將GPX基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成丙氨酸的密碼子；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性 核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列；2)、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達(dá)與純化: 用步驟I)中構(gòu)建的含有GPX突變體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態(tài)細(xì)胞，涂含Cys的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達(dá)出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPX突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里；先小量培養(yǎng)篩選高表達(dá)株，再擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)；收集、洗漆、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得GPX突變體蛋白純品； 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，是用pH7.5, 50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 所述的將液體低溫離心，是在4°C，8000-12000g離心15_30min ； 或， 1)、表達(dá)載體的構(gòu)建: 根據(jù)本發(fā)明所述的GPX突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成GPX突變體的編碼基因，確?；虻?/端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3/端在終止密碼子下游引入GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點(diǎn)；具體的基因序列可以是將GPXl基因中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為丙氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種編碼GPX突變體蛋白的基因，但靶基因的3'端必須含有GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX突變體基因和哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX突變體基因連同其3'端非翻譯區(qū)或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2羧基端343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)，用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選: 用含有SBP2和GPX突變體基因的載體在轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染哺乳類(lèi)細(xì)胞，用兩個(gè)載體上的抗性基因通過(guò)抗生素濃度從高到低逐級(jí)遞減法篩選兼具兩種抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，再用多孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，最終獲得同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX突變體兩種外源蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞株；檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株; 3)、靶蛋白的表達(dá)與純化: 在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里，用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品；所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，是用pH7.5, 50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 或， 1)、表達(dá)載體的構(gòu)建: 根據(jù)本發(fā)明所述的GPX突變體的氨基酸序列在生物公司用DNA合成儀人工合成GPX突變體的編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3'端在終止密碼子下游引入GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點(diǎn)；具體的基因序列可以是將GPXl基因中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為丙氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種編碼GPX突變體蛋白的基因，但靶基因的3'端必須含有GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS ;用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點(diǎn)的GPX突變體基因和哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX突變體基因連同其3'端非翻譯區(qū)或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2羧基端的343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)，用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選: 先用含有SBP2基因的載體轉(zhuǎn)染哺乳類(lèi)細(xì)胞，通過(guò)該載體上的抗性基因篩選穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株；再用含有GPX突變體基因的載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株，用兩個(gè)載體上的抗性基因篩選同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株，檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株；或先轉(zhuǎn)染GPX突變體基因，后轉(zhuǎn)染SBP2基因，再用兩個(gè)載體上的抗性基因篩選同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株； 3)、靶蛋白的表達(dá)與純化: 在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品； 所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPX突變體，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 或， 1)、表達(dá)載體的構(gòu)建: 根據(jù)基因文庫(kù)中公開(kāi)的GPX1、GPX2、GPX3或GPX4設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GPX的編碼基因及其.3,端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確保靶基因的5'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，靶基因的3'端在終止密碼子下游引入GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點(diǎn)，確保引物中編碼Cys的密碼子替換成Ala的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點(diǎn)的靶基因和哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體， 再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX基因連同其3'端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX中要突變?yōu)楸彼岬陌腚装彼岷退揉彽陌被岬幕蛐蛄性O(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，將?gòu)建在真核表達(dá)載體上的GPX基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成丙氨酸的密碼子；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白；根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2羧基端的343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)；同樣經(jīng)酶切連接后用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選: 用含有SBP2和GPX突變體基因的載體在轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染哺乳類(lèi)細(xì)胞，用兩個(gè)載體上的抗性基因通過(guò)抗生素濃度從高到低逐級(jí)遞減法篩選兼具兩種抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，再用多孔培養(yǎng)板逐級(jí)放大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，最終獲得同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX突變體兩種外源蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞株；檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株; 3)、靶蛋白的表達(dá)與純化: 在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里，用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品； 所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX突變體蛋白，是用pH7.5, 50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白； 或， 1)、表達(dá)載體的構(gòu)建: 根據(jù)基因文庫(kù)中公開(kāi)的GPXl、GPX2、GPX3或GPX4設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GPX的編碼基因及其3,端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，確保靶基因的5'端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，靶基因的3'端在終止密碼子下游引入GPX基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點(diǎn)，確保引物中編碼Cys的密碼子替換成Ala的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點(diǎn)的靶基因和哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體，再用DNA連接酶通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)將GPX基因連同其3'端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPX中要突變?yōu)楸彼岬陌腚装彼岷退揉彽陌被岬幕蛐蛄性O(shè)計(jì)完全等長(zhǎng)互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長(zhǎng)25-50bp，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖校瑢?gòu)建在真核表達(dá)載體上的GPX基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成丙氨酸的密碼子；通過(guò)DNA測(cè)序確定突變成功，且無(wú)其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能夠編碼本發(fā)明所述的GPX突變體蛋白；根據(jù)基因文庫(kù)中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2羧基端的343-854位的512個(gè)氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其編碼基因，確?；虻?/端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點(diǎn)，3/端含有終止密碼子和特定的酶切位點(diǎn)；同樣經(jīng)酶切連接后用特定的酶切位點(diǎn)將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體上；所述的特定的酶切位點(diǎn)可以是表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中含有的而靶基因中不存在的任何一個(gè)酶切位點(diǎn)，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基組成的DNA序列； 2)、陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選: 先用含有SBP2基因的載體轉(zhuǎn)染哺乳類(lèi)細(xì)胞，通過(guò)該載體上的抗性基因篩選穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株；再用含有GPX突變體基因的載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)SBP2的細(xì)胞株，用兩個(gè)載體上的抗性基因篩選同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)SBP2和GPX突變體兩種外源蛋白的細(xì)胞株；檢測(cè)GPX突變體蛋白的表達(dá)量并篩選靶蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞株； 3)、靶蛋白的表達(dá)與純化: 在搖瓶中將同時(shí)表達(dá)兩種外源蛋白的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)GPX突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
8.權(quán)利要求2或3所述的一種新型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體的制備方法，其特征在于:其制備過(guò)程與權(quán)利要求8中所述的方法相同，只是在序列SEQ ID NoiUSEQID No:2, SEQ ID No:3或SEQ ID No:4的氨基端引入pColdl原核表達(dá)載體的組氨酸純化標(biāo)簽和凝血因子X(jué)a切割位點(diǎn)的氨基酸，得到所述的GPX突變體。
9.權(quán)利要求6所述的一種新 型高活力谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPX突變體的制備方法，其特征在于:其制備過(guò)程與權(quán)利要求8中所述的方法相同，只是將SEQ ID No:1和SEQ IDNo:5 的第 2 位、SEQ ID No:2 和 SEQ ID No:6 的第 55 位、SEQ ID No:3 和 SEQ ID No:7 的第65位、SEQ ID No:4和SEQ ID No:8的第2位的丙氨酸替換為絲氨酸，或?qū)EQ ID No: 1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4 或 SEQ ID No:5、SEQ ID No:6、SEQ ID No:7 或SEQ ID No:8第1~29位的任何一個(gè)或多個(gè)的丙氨酸替換為絲氨酸，得到所述的GPX突變體。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103898075SQ201410159032
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月19日
【發(fā)明者】魏景艷, 宋健, 邢瑞慶, 郭笑 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)