一種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子zfp6及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子ZFP6及其應(yīng)用，煙草腺毛特異性啟動(dòng)子或其互補(bǔ)鏈具有如SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子在煙草腺毛中調(diào)控目的基因表達(dá)的應(yīng)用。本發(fā)明的ZFP6基因啟動(dòng)子在煙草葉片的腺毛中特異性表達(dá)，克服組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的外源基因在受體植物中非特異、持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)，增加轉(zhuǎn)基因的效果，可利用本發(fā)明的啟動(dòng)子在煙草腺毛中表達(dá)目的基因，有助于研究腺毛形成和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制和腺毛密度的遺傳規(guī)律，基于腺毛與煙草香氣的密切關(guān)系，本發(fā)明還有助于研究控制煙草腺毛及香氣形成的機(jī)制，提高煙草葉片香氣品質(zhì)，具有重要的理論意義及潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子ZFP6及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子ZFP6及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草已成為21世紀(jì)全球市場(chǎng)上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，它不僅是100多個(gè)國(guó)家煙農(nóng)的收入來(lái)源，而且整個(gè)煙草行業(yè)涉及到不同生產(chǎn)部門(mén)和批發(fā)零售環(huán)節(jié)，已成為許多國(guó)家的重要經(jīng)濟(jì)力量；隨著煙草業(yè)的發(fā)展，許多國(guó)家的地方及當(dāng)?shù)卣亩愂沼辛舜蠓忍岣摺?br> [0003]煙草是高效益作物，我國(guó)煙草的種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位。在所有煙葉類(lèi)型中，烤煙種植最為廣泛。我國(guó)是全球生產(chǎn)烤煙最多的國(guó)家，我國(guó)烤煙種植面積和總產(chǎn)量都居世界首位，其烤煙產(chǎn)量約占全球烤煙產(chǎn)量的50%左右，發(fā)展優(yōu)質(zhì)煙葉不管是對(duì)煙農(nóng)還是卷煙工業(yè)都是十分重要的。煙草又是高稅利商品，農(nóng)業(yè)稅利30 %左右，工業(yè)稅利60 %以上，1987-2001年，煙草行業(yè)實(shí)現(xiàn)的稅利合計(jì)連續(xù)14年高居國(guó)民經(jīng)濟(jì)各行業(yè)之首，為國(guó)家建設(shè)做出了巨大的貢獻(xiàn)。因此，研究和開(kāi)發(fā)綜合性狀良好的煙草品種，提高煙草的生產(chǎn)水平對(duì)于增加國(guó)家和地方財(cái)政收入，解決“三農(nóng)”問(wèn)題和新農(nóng)村建設(shè)具有十分重要的意義。
[0004]煙草育種重點(diǎn)考慮的問(wèn)題是煙葉香味和煙葉安全性等，提高香氣品質(zhì)是國(guó)內(nèi)外煙草育種的核心之一。煙葉香氣不足是影響煙葉質(zhì)量的一個(gè)主要因素，尤其目前低煙堿、低焦油的煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向，使得煙葉香味不足的問(wèn)題更為突出。煙草腺毛是煙葉表皮系統(tǒng)的重要組成部分，煙葉 腺毛膠狀分泌物與煙葉香氣物質(zhì)產(chǎn)生密切相關(guān)，而腺毛密度和類(lèi)型直接影響著腺毛分泌物的質(zhì)和量，而分泌物的量又直接影響葉片的香氣品質(zhì)，腺毛密度越大，多細(xì)胞頭部的腺毛所占比例越大，葉片香氣品質(zhì)越好(煙草葉片腺毛及其分泌物研究進(jìn)展.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(8):61~64)。。因此，煙葉腺毛的研究對(duì)煙草新品種的選育和優(yōu)質(zhì)煙草栽培技術(shù)的實(shí)施，以及提高煙草香氣質(zhì)和香氣量的研究都具有重要的指導(dǎo)意義。目前國(guó)內(nèi)外雖然已在煙草腺毛方面進(jìn)行了大量研究，但對(duì)腺毛形成和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制和腺毛密度的遺傳規(guī)律，特別是在腺毛與煙草香氣形成之間關(guān)系的研究方面還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，因此，從分子水平上研究控制煙草腺毛及香氣形成的機(jī)制，不僅具有重要的理論意義，同時(shí)也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[0005]通過(guò)基因工程的方法在煙草中研究控制腺毛形成、發(fā)育及香氣相關(guān)等的基因，是有效且最常用的手段，通常涉及到外源基因的表達(dá)，而外源基因表達(dá)的則由啟動(dòng)子調(diào)控，啟動(dòng)子通常分為組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子能夠在大部分或所有植物組織中高效非特異的啟動(dòng)外源基因表達(dá)，但大量的異源蛋白會(huì)使植物體內(nèi)原有的代謝平衡紊亂，使植物的正常生長(zhǎng)受到阻礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠在煙草葉片的腺毛中特異性表達(dá)。[0007]—種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子，所述煙草腺毛特異性啟動(dòng)子或其互補(bǔ)鏈具有如SEQID N0.3所示的核苷酸序列。
[0008]本發(fā)明還提供了一種包含所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒。
[0009] 所述重組質(zhì)粒的原始質(zhì)粒載體可以為pHGWFS7。
[0010]本發(fā)明還提供了一種包含所述重組質(zhì)粒的重組轉(zhuǎn)化子。
[0011]本發(fā)明還提供了所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子在煙草腺毛中調(diào)控目的基因表達(dá)的應(yīng)用。
[0012]所述的應(yīng)用具體包括:利用所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子構(gòu)建植物表達(dá)載體，然后將目的基因連入所述植物表達(dá)載體中煙草腺毛特異性啟動(dòng)子的下游，得到重組植物表達(dá)載體，再將所述的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草。
[0013]植物表達(dá)載體、重組植物表達(dá)載體的構(gòu)建可采用常規(guī)方法，如可采用gateway系統(tǒng)(InvitiOgen公司)將啟動(dòng)子、目的基因連入相應(yīng)的載體中。其中，所述的植物表達(dá)載體的原始載體可以為PHGWFS7，所述的目的基因并不僅限于GUS基因，所述的目的基因可以根據(jù)具體需要進(jìn)行選擇，轉(zhuǎn)化煙草時(shí)，可采用常規(guī)手段，如可采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法將重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草中，農(nóng)桿菌可以為農(nóng)桿菌GV3101，EHA105等。在轉(zhuǎn)基因煙草中，本發(fā)明的啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)目的基因在煙草葉片的腺毛中進(jìn)行表達(dá)。當(dāng)然，所述的煙草可以為珊西煙，但并不僅限于珊西煙。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0015]本發(fā)明的啟動(dòng)子在煙草葉片的腺毛中特異性表達(dá)，克服組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的外源基因在受體植物中非特異、持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)，增加轉(zhuǎn)基因的效果，可利用本發(fā)明的啟動(dòng)子在煙草腺毛中表達(dá)目的基因，有助于研究腺毛形成和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制和腺毛密度的遺傳規(guī)律，基于腺毛與煙草香氣的密切關(guān)系，本發(fā)明還有助于研究控制煙草腺毛及香氣形成的機(jī)制，提高煙草葉片香氣品質(zhì)，具有重要的理論意義及潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片⑶S染色結(jié)果；
[0017]其中，A、B為轉(zhuǎn)基因煙草，C、D為野生型煙草。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。
[0019]實(shí)施例1ZFP6基因啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因載體構(gòu)建和煙草遺傳轉(zhuǎn)化
[0020](I)取擬南芥葉片，利用CTAB法提取基因組DNA.[0021](2)根據(jù)Genbank上的擬南芥ZFP6基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列設(shè)計(jì)特異引物，分另Ij在引物5'端加上Sal I和Not I限制性酶切位點(diǎn)，序列如下:
[0022]引物1:5 ' -AGTCGACTGCAACGTAAAAGGTCCTGA-3 ' ；
[0023]引物2:5 ' -AAGCGGCCGCCAAAGAGAGAGAGAGAGACAGATTT-3 '。
[0024](3 )以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.[0025]米用高保真酶PrimeSTAR? HS DNA Polymerase (TaKaRa Code:DR010A)體系:
[0026]5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 10 μ 1，[0027]dNTP Mixture (各 2.5mM) 4 μ I,
[0028]引物I (10 μ Μ) I μ 1，
[0029]引物2 (10 μ Μ) I μ 1，
[0030]模板DNAl μ 1，
[0031]PrimeSTAR其 HS DNA Polymerase0.5 μ 1，
[0032] 滅菌蒸餾水加至總體積50 μ I。
[0033]PCR循環(huán)條件為:98°C預(yù)變性5分鐘，98°C變性10秒，55°C退火15秒，72°C延伸2分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，結(jié)束反應(yīng)。
[0034](4)將PCR產(chǎn)物回收后通過(guò)酶切連接到Gateway克隆系統(tǒng)(本申請(qǐng)采用Invitrogen公司的Gateway系統(tǒng))入門(mén)載體pENTRlA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，測(cè)序并分析，ZFP6基因啟動(dòng)子序列如SEQ ID N0.3所示。
[0035](5)將測(cè)序正確的含ZFP6基因啟動(dòng)子的pENTRlA質(zhì)粒與啟動(dòng)子分析載體pHGWFS7進(jìn)行LR交換反應(yīng)。
[0036]使用Gateway LR Clonase TM Enzyme Mix(Invitrogen公司，Cat.N0.11791-019),體系如下:Entry clone (入門(mén)載體)50_150ng, Destination vector (目的載體)150ng,5XLR Clonase Reaction Buffer2 μ I,補(bǔ)充 ddH20 至 8 μ I,加入 2 μ I LR Clonase enzymemix,短暫潤(rùn)旋兩次混勻，輕微離心，于25°C水浴8h,然后加入I μ I Proteinase K solution(蛋白酶K溶液)混勻，37°C放置10分鐘結(jié)束反應(yīng)。
[0037]取5 μ I反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。
[0038](6)從_80°C冰箱中取出EHA105感受態(tài)細(xì)胞，利用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。
[0039]感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍，取2 μ I左右的目的質(zhì)粒加到感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后置于冰上30min，再將離心管內(nèi)的所有混合物加到預(yù)冷的電擊杯內(nèi)，冰上放置。打開(kāi)伯樂(lè)電轉(zhuǎn)儀，程序調(diào)至Agr，吸取Iml的LB液體營(yíng)養(yǎng)基，將電擊杯凸點(diǎn)朝內(nèi)推入電轉(zhuǎn)儀，按一下plus鍵，聽(tīng)到蜂鳴聲，迅速拿出電擊杯，并向電擊杯杯加入1ml的LB液體營(yíng)養(yǎng)基,重懸細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管內(nèi)，放在eppendorf混合儀內(nèi)28°C, 700rpm搖2.5h以上,涂布于抗性YEP平板上(Rif (利福平)50mg/L，Spec (鹽酸大觀霉素)100mg/L)，28°C倒置培養(yǎng)2個(gè)晚上以至長(zhǎng)出單菌落。
[0040](7)挑取長(zhǎng)出的農(nóng)桿菌單克隆，到含有相應(yīng)抗生素的5mL YEP液體培養(yǎng)基中(相為Rif50mg/L spec100mg/L),28°C 150rpm振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。將搖的菌按體積比1:10加入YEP液體培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗生素)28 0C，培養(yǎng)至0D600>1。
[0041](8)將搖好的菌做煙草葉片浸染:
[0042]I) MS液體培養(yǎng)基(PH7.0)將菌液稀釋10倍(2mL菌液+18mL MS溶液)；
[0043]2)利用無(wú)菌的煙草(品種為珊西煙)組培苗。無(wú)菌的煙草葉片切去邊緣和主要葉脈，切成0.5X0.5cm2大小；
[0044]3)切好的外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡5min ；
[0045]4)用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面菌液，轉(zhuǎn)入上鋪一層濾紙的MS培養(yǎng)基，25°C暗培養(yǎng)3天；
[0046]5)三天后，將材料轉(zhuǎn)到適當(dāng)選擇后的分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)中進(jìn)行光照培養(yǎng)，溫度25°C ±2°C，光周期14hr光照/8hr光照；
[0047]6)待生長(zhǎng)至2_3cm高時(shí)，切下小芽轉(zhuǎn)入適當(dāng)篩選的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根(基本MS hpt (潮霉素)35mg/L+cef (頭孢霉素)250mg/L)；
[0048]7)根長(zhǎng)至IOcm以上(約四周)，且具有一定數(shù)量即可去掉封口膜，在組培室中鍛煉2-3天，然后移栽到花盆中，在室溫生長(zhǎng)2-3周，最后移栽至田間種植。當(dāng)移到土里的煙草苗生長(zhǎng)約20d后，取煙草葉片提取DNA，通過(guò)PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。
[0049]實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因煙草的性狀觀察
[0050]煙草的表皮毛按有無(wú)分泌腺分成兩大類(lèi)，一是能產(chǎn)生分泌物的腺毛，二是不具有分泌能力的保護(hù)毛，其中腺毛又根據(jù)形態(tài)分為長(zhǎng)柄腺毛和短柄腺毛。
[0051]將實(shí)施例1獲得的轉(zhuǎn)基因煙草，進(jìn)行組織化學(xué)染色(GUS染色)分析，結(jié)果如圖1所示，將60天齡期的煙 草葉片進(jìn)行GUS染色后，本發(fā)明的啟動(dòng)子(A，B)在煙草葉片的腺毛中特異表達(dá)(腺毛表現(xiàn)為藍(lán)色)，而對(duì)照(C，D)無(wú)顯色反應(yīng)，表明本發(fā)明的啟動(dòng)子在煙草腺毛中有活性，是煙草腺毛特異表達(dá)的啟動(dòng)子。
【權(quán)利要求】
1.一種煙草腺毛特異性啟動(dòng)子，其特征在于，所述煙草腺毛特異性啟動(dòng)子或其互補(bǔ)鏈具有如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
2.一種包含如權(quán)利要求1所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，原始質(zhì)粒載體為PHGWFS7。
4.一種包含如權(quán)利要求2或3所述的重組質(zhì)粒的重組轉(zhuǎn)化子。
5.一種如權(quán)利要求1所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子在煙草腺毛中調(diào)控目的基因表達(dá)的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用包括:利用所述的煙草腺毛特異性啟動(dòng)子構(gòu)建植物表達(dá)載體，然后將目的基因連入所述植物表達(dá)載體中煙草腺毛特異性啟動(dòng)子的下游，得到重組植物表達(dá)載體，再將所述的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草。
7.如權(quán)利要求6所述 的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物表達(dá)載體的原始載體為PHGWFS7。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103966216SQ201410158786
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】甘銀波, 顏安, 孟小芳, 安麗君, 周忠靜, 趙永欽, 劉一華 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)