擬南芥鋅指蛋白基因zfp6在促進煙草腺毛生長中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6在促進煙草腺毛生長中的應用，所述的擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。所述的應用包括：將所述的擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6連入植物表達載體中，構建得到重組表達載體，再將所述的重組表達載體轉化煙草。本發(fā)明通過克隆擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6，并在煙草中進行遺傳轉化，過量表達外源ZFP6基因能夠顯著提高煙草葉片腺毛數量，提高腺毛生長密度，而對不分泌次生代謝產物的保護毛數量沒有影響。本發(fā)明有助于研究腺毛形成和發(fā)育的調控機制和腺毛密度的遺傳規(guī)律，提高煙草葉片香氣品質，有助于研究控制煙草腺毛及香氣形成的機制。
【專利說明】擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6在促進煙草腺毛生長中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術領域】，尤其涉及一種擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6在促進煙草腺毛生長中的應用。
【背景技術】
[0002]煙草已成為21世紀全球市場上最重要的經濟作物之一，它不僅是100多個國家煙農的收入來源，而且整個煙草行業(yè)涉及到不同生產部門和批發(fā)零售環(huán)節(jié)，已成為許多國家的重要經濟力量；隨著煙草業(yè)的發(fā)展，許多國家的地方及當地政府的稅收有了大幅度提高。
[0003]煙草是高效益作物，我國煙草的種植面積和產量均居世界第一位。在所有煙葉類型中，烤煙種植最為廣泛。我國是全球生產烤煙最多的國家，我國烤煙種植面積和總產量都居世界首位，其烤煙產量約占全球烤煙產量的50%左右，發(fā)展優(yōu)質煙葉不管是對煙農還是卷煙工業(yè)都是十分重要的。煙草又是高稅利商品，農業(yè)稅利30 %左右，工業(yè)稅利60 %以上，1987-2001年，煙草行業(yè)實現的稅利合計連續(xù)14年高居國民經濟各行業(yè)之首，為國家建設做出了巨大的貢獻。因此，研究和開發(fā)綜合性狀良好的煙草品種，提高煙草的生產水平對于增加國家和地方財政收入，解決“三農”問題和新農村建設具有十分重要的意義。
[0004]煙草育種重點考慮的問題是煙葉香味和煙葉安全性等，提高香氣品質是國內外煙草育種的核心之一。煙葉香氣不足是影響煙葉質量的一個主要因素，尤其目前低煙堿、低焦油的煙草產業(yè)發(fā)展方向，使得煙葉香味不足的問題更為突出。煙草腺毛是煙葉表皮系統(tǒng)的重要組成部分，煙葉腺毛膠狀分泌物與煙葉香氣物質產生密切相關，而腺毛密度和類型直接影響著腺毛分泌物 的質和量，而分泌物的量又直接影響葉片的香氣品質，腺毛密度越大，多細胞頭部的腺毛所占比例越大，葉片香氣品質越好(煙草葉片腺毛及其分泌物研究進展.貴州農業(yè)科學，2009，37(8):61~64)。。因此，煙葉腺毛的研究對煙草新品種的選育和優(yōu)質煙草栽培技術的實施，以及提高煙草香氣質和香氣量的研究都具有重要的指導意義。目前國內外雖然已在煙草腺毛方面進行了大量研究，但對腺毛形成和發(fā)育的調控機制和腺毛密度的遺傳規(guī)律，特別是在腺毛與煙草香氣形成之間關系的研究方面還遠遠不夠，因此，從分子水平上研究控制煙草腺毛及香氣形成的機制，不僅具有重要的理論意義，同時也具有潛在的應用價值。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供了一種擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6在促進煙草腺毛生長中的應用，在煙草中外源表達擬南芥指蛋白基因ZFP6能夠提高煙草葉片腺毛的生長密度。
[0006]一種擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6在促進煙草腺毛生長中的應用，所述的擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]所述的應用，包括:將所述的擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6連入植物表達載體中，構建得到重組表達載體，再將所述的重組表達載體轉化煙草。
[0008]重組表達載體的構建可采用常規(guī)方法,如可采用Gateway系統(tǒng)(Invitrogen公司)將擬南芥ZFP6基因(即擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6)連入植物表達載體中。
[0009]所述的植物表達載體可以為pH2GW7、pK2GW7等。
[0010]所述的重組表達載體中，啟動所述擬南芥ZFP6基因表達的啟動子為強啟動子。強啟動子能夠啟動擬南芥ZFP6基因過表達，可提高煙草葉片腺毛的生長密度。所述的強啟動子為35S。
[0011]轉化煙草時，可采用農桿菌介導轉化的方法，所述的農桿菌具體可以為農桿菌GV310UEHA105 等。
[0012]所述煙草的品種可以為珊西煙，但不僅限于珊西煙。
[0013]本發(fā)明還提供了一種重組表達載體，包括原始載體以及插入所述原始載體的目的基因，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0014]所述的重組表達載體中，所述的原始載體可以為pH2GW7、pK2GW7等。
[0015]本發(fā)明還提供了一種包含所述植物表達載體的重組轉化子。
[0016]所述的重組轉化子中，宿主菌可以為農桿菌，具體可以為農桿菌GV3101、EHA105等。
[0017]與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0018]本發(fā)明通過克隆擬南芥ZFP6基因，并在煙草中進行遺傳轉化，過量表達外源擬南芥ZFP6基因能夠顯著提高煙草葉片腺毛數量，提高腺毛生長密度，而對不分泌次生代謝產物的保護毛數量沒有影響。本發(fā)明有助于研究腺毛形成和發(fā)育的調控機制和腺毛密度的遺傳規(guī)律，基于腺毛與煙草香氣的密切關系，本發(fā)明能夠提高煙草葉片香氣品質，有助于研究控制煙草腺毛及香氣形成的機制，具有重要的理論意義及潛在的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為野生型(WT)和轉基因煙草(35S:ZFP6)不同齡期葉片表皮毛數量統(tǒng)計。【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡釋。
[0021]實施例1ZFP6基因過量表達載體構建和煙草遺傳轉化
[0022](I)取擬南芥花序,液氮研磨,加入TRIzol試劑(Invitrogen公司),提取RNA。取
0.5 μ g RNA進行反轉錄反應得到cDNA。
[0023](2)根據Genbank上的ZFP6基因序列設計特異引物，分別在引物5 '端加上Sal I和Not I限制性酶切位點，序列如下:
[0024]引物1:5 ' -GGTCGACGCTCACATATATGGCGACTGAA-3 ' ；
[0025]引物2:5 ' -AAGCGGCCGCTAATCATTCATGGCCCAAGG-3 '。
[0026](3 )以全長cDNA為模板進行PCR擴增。
[0027]采用高保真酶PrimeSTAR? HS DNA Polymerase (TaKaRa Code:DR010A)體系:
[0028]5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 10 μ 1，
[0029]dNTP Mixture (各 2.5mM) 4 μ I,
[0030]引物I (10 μ Μ) I μ 1，
[0031]引物2 (10 μ Μ) I μ 1，[0032]模板cDNAlyl，
[0033]PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.5 μ 1，
[0034]滅菌蒸餾水加至總體積50 μ I。
[0035]PCR循環(huán)條件為:98°C預變性5分鐘，98°C變性10秒，55°C退火15秒，72°C延伸90秒，擴增30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，結束反應。
[0036](4)將PCR產物回收后通過酶切連接到Gateway克隆系統(tǒng)入門載體pENTRlA，轉化大腸桿菌DH5 α，測序并分析，ZFP6基因序列如SEQ IDN0.1所示。
[0037](5)將測 序正確的含ZFP6全長⑶S的pENTRlA質粒與過量表達載體pH2GW7進行LR交換反應。
[0038]使用Gateway LR Clonase TM Enzyme Mix (Invitrogen 公司，Cat.N0.11791-019),體系如下:Entry clone (入門載體)50_150ng, Destination vector (目的載體)150ng,5 X LR Clonase Reaction Buffer2 μ I, ddH20 up ?ο8μ1,加入 2μ1 LR Clonase enzymemix,短暫潤旋兩次混勻，輕微離心，于25°C水浴8h,然后加入I μ I Proteinase K solution(蛋白酶K溶液)混勻，37°C放置10分鐘結束反應。
[0039]取5 μ I反應產物轉化大腸桿菌DH5 α，挑取PCR驗證陽性克隆培養(yǎng)后提取質粒進行雙酶切驗證。
[0040](6)從_80°C冰箱中取出EHA105感受態(tài)細胞，利用電擊法轉化農桿菌EHA105。
[0041]感受態(tài)細胞置于冰上解凍，取2 μ I左右的目的質粒加到感受態(tài)細胞中，混勻后置于冰上30min，再將離心管內的所有混合物加到預冷的電擊杯內，冰上放置。打開伯樂電轉儀，程序調至Agr，吸取Iml的LB液體營養(yǎng)基，將電擊杯凸點朝內推入電轉儀，按一下plus鍵，聽到蜂鳴聲，迅速拿出電擊杯，并向電擊杯杯加入1ml的LB液體營養(yǎng)基,重懸細胞,轉移至1.5ml的離心管內，放在eppendorf混合儀內28°C,700rpm搖2.5h以上,涂布于抗性YEP平板上(Rif (利福平)50mg/L，Spec (鹽酸大觀霉素)100mg/L)，28°C倒置培養(yǎng)2個晚上以至長出單菌落。
[0042](7)挑取長出的農桿菌單克隆，到含有相應抗生素的5mL YEP液體培養(yǎng)基中(相應抗生素為Rif50mg/L spec100mg/L), 28°C 150rpm振蕩培養(yǎng)48小時。將搖的菌按體積比1:10加入YEP液體培養(yǎng)基(含相應抗生素)280C，培養(yǎng)至0D600>1。
[0043](8)將搖好的菌做煙草葉片浸染:
[0044]I) MS液體培養(yǎng)基(PH7.0)將菌液稀釋10倍(2mL菌液+18mL MS溶液)；
[0045]2)利用無菌的煙草(品種為珊西煙)組培苗。無菌的煙草葉片切去邊緣和主要葉脈，切成0.5X0.5cm2大?。?br> [0046]3)切好的外植體在農桿菌菌液中浸泡5min ；
[0047]4)用無菌濾紙吸干外植體表面菌液，轉入上鋪一層濾紙的MS培養(yǎng)基，25°C暗培養(yǎng)3天；
[0048]5)三天后，將材料轉到適當選擇后的分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)中進行光照培養(yǎng)，溫度25°C ±2°C，光周期14hr光照/8hr光照；
[0049]6)待生長至2_3cm高時，切下小芽轉入適當篩選的生根培養(yǎng)基中誘導生根(基本MS+hpt (潮霉素)35mg/L+cef (頭孢霉素)250mg/L)；
[0050]7)根長至IOcm以上(約四周)，且具有一定數量即可去掉封口膜，在組培室中鍛煉2-3天，然后移栽到花盆中，在室溫生長2-3周，最后移栽至田間種植。當移到土里的煙草苗生長約20d后，取煙草葉片提取DNA，通過PCR方法檢測轉基因植株。
[0051]實施例2轉基因煙草的性狀觀察
[0052]煙草的表皮毛按有無分泌腺分成兩大類，一是能產生分泌物的腺毛，二是不具有分泌能力的保護毛，其中腺毛又根據形態(tài)分為長柄腺毛和短柄腺毛。
[0053]對實施例1獲得的轉基因煙草進行腺毛表型統(tǒng)計，如圖1所示，在煙草中過量表達擬南芥ZFP6基因(如SEQ ID N0.1所示的序列)，和野生型相比，能極顯著促進20天齡期第3和4片煙草葉上表面長腺毛(長柄腺毛)數量和短腺毛(短炳腺毛)數量(P〈0.01)，而不分泌次生代謝產物的表皮毛(保護毛)數量則差異不顯著。我們也同時統(tǒng)計了 40天齡期和60天齡期在第7和8片葉上表面煙草腺毛和保護毛(長表皮毛和短表皮毛)的數量，結果表明在煙草中過量表達擬南芥ZFP6基因能顯著增加煙草長腺毛數量和短腺毛數量，而不分泌次生代謝產物的表皮毛(長 表皮毛、短表皮毛)數量則差異不顯著。
【權利要求】
1.一種擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6在促進煙草腺毛生長中的應用，其特征在于，所述的擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，包括:將所述的擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6連入植物表達載體中，構建得到重組表達載體，再將所述的重組表達載體轉化煙草。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的植物表達載體為PH2GW7或pK2GW7。
4.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的重組表達載體中，啟動所述擬南芥鋅指蛋白基因ZFP6表達的啟動子為強啟動子。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的強啟動子為35S。
6.一種重組表達載體，包括原始載體以及插入所述原始載體的目的基因，其特征在于，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
7.如權利要求6所述的重組表達載體，其特征在于，所述的原始載體為PH2GW7或pK2GW70
8.一種包含如權 利要求6或7所述重組表達載體的重組轉化子。
9.如權利要求8所述的重組轉化子，其特征在于，宿主菌為農桿菌GV3101或EHA105。
【文檔編號】C12N15/84GK103966232SQ201410158764
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權日:2014年4月18日
【發(fā)明者】甘銀波, 顏安, 安麗君, 周忠靜, 孟小芳, 劉伯涵, 張愛冬 申請人:浙江大學