專利名稱：乳腺特異性表達載體及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乳腺特異性表達載體及其構建方法。
技術背景目前常用的蛋白質表達系統(tǒng)主要有細菌、酵母、哺乳動物細胞、動物生物反應 器等，上述幾種蛋白質表達系統(tǒng)各有其優(yōu)缺點和適用范圍，不同特性的蛋白質需要 選擇相應的表達系統(tǒng)。動物乳腺生物反應器(mammary gland bioreactor)屬于動物生物反應器中的 一個重要分支，又稱動物個體乳腺表達系統(tǒng)，它屬于轉基因動物的范疇，其核心內 容是通過各種轉基因技術，將乳腺組織特異性啟動子驅動的外源基因，在動物乳腺 組織高效表達，在乳汁中生產目的產品。如何使外源基因高效、穩(wěn)定、特異性表達 是制備乳腺生物反應器的一個主要難題，存在的主要障礙包括1)表達量低或不 表達，不具有商業(yè)開發(fā)價值；2)轉基因的位點效應導致各轉基因動物系表達水平 差異大，需要大量篩選工作，導致工作量和成本大幅上升；3)異位表達問題，即 在乳腺以外的部位滲漏表達外源蛋白，導致動物生理健康受損而難以獲得生產系?？朔陨想y題的關鍵在于表達載體的構建。早期研究中大多將目標基因的cDNA 加上乳蛋白基因有限的上下游調控序列構建表達載體，也有少數(shù)使用目標基因的基 因組序列或微小基因，鑒于克隆載體的容量有限，這樣的載體一般都不超過30Kb， 為了對抗位點效應的影響，有時也會在表達載體中加入一些調控元件如雞溶菌酶 的核基質結合區(qū)(MAR)序列、e-球蛋白的位點控制區(qū)(LCR)序列等。使用這樣 的小表達載體得到了一批動物乳腺生物反應器，但絕大多數(shù)表達量無法達到商業(yè)開 發(fā)的要求，不具備實際應用價值。大量試驗證明，小表達載體無法滿足制備乳腺生 物反應器的要求，盡管有少量成功的案例，但是小表達載體顯然不具有通用性，無 法可靠地獲得高效穩(wěn)定特異性的表達模式。鑒于乳腺生物反應器制備中出現(xiàn)的問題，國外很多相關研究組加強了對一些重 要乳蛋白基因表達調控的研究工作，從國內外長期的相關研究積累來看，要想獲得 良好的表達效果，需要滿足以下幾個要素1)要有足夠完善的表達調控序列，除 了啟動子外，還需要增強子、激素應答區(qū)(hormone response element ;HRE)、位點控制區(qū)(LCR)、腳手架/核基質結合區(qū)(S/MAR)、絕緣子(insulator)等一系 列調控元件；另外，估計還有很多我們尚未發(fā)現(xiàn)其功能的重要因素參與表達調控； 2)最好能夠使用目標基因的基因組序列而不是cDNA，基因組序列更有利于高效表 達，這已經(jīng)獲得公認；3)表達載體要處于一個良好的染色體環(huán)境之中，避免位點 效應的影響，或者表達載體具有對抗位點效應的能力。最近發(fā)展出來的基因座(gene locus)表達載體為滿足以上要求提供了契機。 基因座是指某個基因在染色體上占有的一段區(qū)域，長約數(shù)十到數(shù)百Kb不等，在基 因座的兩側往往有絕緣子等元件，如同一個小王國的邊界，把這個基因座和周圍的染色體環(huán)境分割開來。使用整個基因座進行轉基因表達具有以下幾個優(yōu)勢1)基 因座內具有天然完善的表達調控序列和基因組序列，使用整個基因座進行轉基因表達一般都能夠達到或超過該基因的內源性表達水平；2)基因座的轉錄是相對獨立 的，不受周圍染色體環(huán)境的影響，因此使用整個基因座進行轉基因表達一般都能夠 獲得插入位點非依賴、拷貝數(shù)依賴的表達模式。由于基因座長約數(shù)十到數(shù)百Kb不等，普通的克隆載體無法容納， 一般都使用 BAC、 YAC等載體來克隆。 一系列乳蛋白BAC基因座，如小鼠WAP、奶牛asl-酪蛋 白、人乳白蛋白、山羊P-乳球蛋白等的表達效果都在小鼠乳腺中得到了驗證，都 獲得了位點非依賴和拷貝數(shù)依賴的表達模式，并且表達水平都接近或超過了內源性 基因的表達水平，表達量可以達到每升乳汁數(shù)十克的水平。然而，如果只使用上下 游數(shù)Kb的調控序列加上乳蛋白基因組序列進行表達，表達水平往往只有BAC基因 座表達水平的1/10-1/15，而且很難獲得插入位點非依賴的表達模式。這些結果顯 示乳蛋白BAC基因座具有驚人的表達能力和良好的對抗位點效應的能力，是開發(fā)乳 腺個體表達系統(tǒng)的重要資源。但是直到目前為止，研究結果還只局限在乳蛋白BAC 基因座表達，而人們更感興趣的是如何利用乳蛋白BAC基因座中的調控序列指導外 源基因的表達，特別是表達一些具有重要醫(yī)用價值而內源性表達水平又很低的蛋白 因子，只有這樣，才能真正地把乳蛋白基因座利用起來，使得動物乳腺生物反應器 成為一個通用而方便有效的表達系統(tǒng)。想要達到這個目的，問題的關鍵在于如何把 待表達目標基因的編碼序列和乳蛋白基因座內的調控序列合理地組裝在一起，現(xiàn)在 這方面的研究還處于起步階段。為了使得cre重組酶在小鼠乳腺組織中特異性地表 達，人們把cre重組酶cDNA序列插入到乳蛋白BAC基因座中的啟動子之下進行表 達，結果發(fā)現(xiàn)cre重組酶能夠在小鼠乳腺中高效特異性地表達。發(fā)明內容本發(fā)明提供了一種乳腺特異性表達載體及其構建方法。 本發(fā)明提供的乳腺特異性表達載體的構建方法，包括如下步驟1) 構建DNA片段M。； M。自上游至下游依次為同源臂T,、同源臂T2、同源臂T3、 同源臂L、同源臂T5、同源臂Te;所述6個同源臂的長度均為400-600bp;同源臂 T5和同源臂T6能通過與乳蛋白BAC同源重組獲得乳蛋白基因座3'調控區(qū)；同源臂 T3和同源臂T4能通過與外源目的蛋白BAC同源重組獲得完整的外源目的蛋白基因組 序列；同源臂L和同源臂T2能通過與乳蛋白BAC同源重組獲得乳蛋白基因座5'調 控區(qū)；2) 將所述DNA片段M。插入載體中，得到連續(xù)三次基因抓捕載體；3) 通過與所述乳蛋白BAC進行兩次同源重組、與所述外源目的蛋白BAC進行 一次同源重組，將步驟2)得到的連續(xù)三次基因抓捕載體中的DNA片段M。替換為DNA 片段M,，得到所述外源目的蛋白的乳腺特異性表達載體；Mi自上游至下游依次為所 述乳蛋白基因座5'調控區(qū)、完整的所述外源目的蛋白基因組序列、所述乳蛋白基 因座3'調控區(qū)。所述乳蛋白基因座5'調控區(qū)為所述乳蛋白基因座中的所述乳蛋白開放閱讀框 架的起始密碼子上游的序列；所述乳蛋白基因座3'調控區(qū)為所述乳蛋白基因座中 的所述乳蛋白開放閱讀框架的終止密碼子下游的序列；這樣確保所述乳蛋白基因座 中的所述乳蛋白開放閱讀框架(由起始密碼子至終止密碼子)精確地置換為所述外 源目的蛋白基因組序列。所述乳蛋白基因座可為所有哺乳動物的所有種類的乳蛋白基因座，如牛、羊、 馬、豬、兔、人或鼠的乳蛋白基因座。所述乳蛋白基因座具體可為羊P -酪蛋白基因座、牛P -酪蛋白基因座、小鼠WAP 基因座、兔WAP基因座、奶牛asl-酪蛋白基因座、奶牛as2-酪蛋白基因座、人乳白蛋白基因座或山羊e-乳球蛋白基因座、牛e-乳球蛋白基因座。所述外源目的蛋白可為任何外源蛋白，如人血清白蛋白。 下述兩種DNA片段也屬于本發(fā)明的保護范圍。一種DNA片段，自上游至下游依次為同源臂L、同源臂L、同源臂L、同源臂 T4、同源臂L、同源臂L;所述6個同源臂的長度均為400-600bp;同源臂^和同 源臂T6能通過與乳蛋白BAC同源重組獲得乳蛋白基因座3'調控區(qū)；同源臂T3和同源臂T4能通過與外源目的蛋白BAC同源重組獲得完整的外源目的蛋白基因組序列； 同源臂L和同源臂T2能通過與乳蛋白BAC同源重組獲得乳蛋白基因座5'調控區(qū)。一種DNA片段，自上游至下游依次為乳蛋白基因座5'調控區(qū)、完整的外源目 的蛋白基因組序列、乳蛋白基因座3'調控區(qū)。所述兩種DNA片段中，所述乳蛋白基因座可為所有哺乳動物的所有種類的乳蛋 白基因座，如牛、羊、馬、豬、兔、人或鼠的乳蛋白基因座。所述乳蛋白基因座具體可為羊e -酪蛋白基因座、牛P -酪蛋白基因座、小鼠WAP 基因座、兔WAP基因座、奶牛asl-酪蛋白基因座、奶牛as2-酪蛋白基因座、人乳白蛋白基因座或山羊p -乳球蛋白基因座、牛e -乳球蛋白基因座。所述外源目的蛋白可為任何外源蛋白，如人血清白蛋白。 攜帶有所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系和重組菌均屬于本發(fā) 明的保護范圍。所述方法、所述DNA片段以及所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌 均可應用于乳腺生物反應器的制備。本發(fā)明利用BAC同源重組技術，把乳蛋白基因座5'調控區(qū)、完整的外源目的 蛋白基因組序列(從起始密碼子到終止密碼子)、乳蛋白基因座3'調控區(qū)三個基 因片段按順序組裝在一起，實現(xiàn)了乳蛋白基因座內部的基因組序列從起始密碼子到 終止密碼子精確地置換為外源目的蛋白的基因組序列，從而形成一個乳蛋白-目的 蛋白的雜合基因座，在這種雜合基因座內包含有乳蛋白上下游表達調控序列，中間 卻是外源目的蛋白的基因組序列。這個方案的好處在于既獲得了完善的乳蛋白表達 調控序列，又使用了外源目的蛋白的基因組序列而不是cDNA序列，使用外源目的 蛋白的基因組序列比使用cDNA序列更有利于高效表達，相對于使用cDNA序列來說， 也更符合真核基因天然的組織狀態(tài)。本發(fā)明將為動物乳腺個體表達系統(tǒng)注入新的活 力，有希望建立一種通用的乳腺生物反應器表達模式，有力地促進乳腺生物反應器 表達系統(tǒng)的推廣運用。以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖i為羊e -酪蛋白-人血清白蛋白連續(xù)三次基因抓捕載體 圖2為牛e -酪蛋白-人血清白蛋白連續(xù)三次基因抓捕載體 圖3為羊e -酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換載體構建示意4為牛e-酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換載體構建示意5為羊e-酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換載體轉基因小鼠southern-blot 鑒定6為牛e -酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換載體轉基因小鼠southern-blot 鑒定7為羊0 -酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換載體轉基因小鼠乳汁SDS-PAGE8為牛P -酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換載體轉基因小鼠乳汁SDS-PAGE9為羊e -酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換載體轉基因小鼠乳汁中表達的人血清白蛋白的western-blot鑒定io為牛e-酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換載體轉基因小鼠乳汁中表達的 人血清白蛋白的western-blot鑒定圖具體實施方式
本發(fā)明可利用任何乳蛋白基因座構建表達任意外源目的蛋白的乳腺特異性表 達載體。下面分別以利用羊P-酪蛋白基因座、牛P-酪蛋白基因座構建人血清白蛋 白的乳腺特異性表達載體為例，闡明本發(fā)明的技術方案。內切酶、分子生物學方面的試劑購于Promega公司；其他試劑購自 Sigma-Aldrich公司；BAC克隆購自美國國立兒童醫(yī)院BACPAC中心；pKD46質粒購 自invitrogen公司。pBR322質粒購自New England Biolab公司;pGEM-T載體購自 promega公司<>下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例i、利用羊e-酪蛋白基因座構建人血清白蛋白乳腺特異性表達載體 一、羊p -酪蛋白-人血清白蛋白的同源臂克隆與連續(xù)三次抓捕載體的構建三對(共6個)長度為400bp-600bp的同源臂，其中第一對同源臂分別位于羊 酪蛋白基因座的3'端和羊P-酪蛋白基因組序列的終止密碼子附近，用于抓捕 羊P-酪蛋白基因座3'調控區(qū)；第二對同源臂分別位于人血清白蛋白基因基因組序 列的起始密碼子和終止密碼子附近，用于抓捕完整的人血清白蛋白基因的基因組序 列；第三對同源臂分別位于羊e-酪蛋白基因座的5'端和羊e-酪蛋白基因組序列 的起始密碼子附近，用于抓捕羊e-酪蛋白基因座5'調控區(qū)；利用羊e-酪蛋白基因座和人血清白蛋白基因座內存在的天然酶切位點實現(xiàn)6個同源臂的無縫連接，構 建獲得連續(xù)三次基因抓捕載體。1、 同源臂3fl與3f2的獲得以羊0-酪蛋白BAC (目錄號CH243-261D1)為模板，以P1和P2為引物，使 用PCR方法克隆獲得羊3 -酪蛋白同源臂3fl ，羊P -酪蛋白同源臂3f 1位于羊P -酪蛋白基因3'遠端；以羊P-酪蛋白BAC為模板，以P3和P4為引物，使用PCR 方法克隆獲得羊P -酪蛋白同源臂3f2，羊0 -酪蛋白同源臂3f2位于羊0 -酪蛋白基 因終止密碼子下游近側；這一對同源臂共同用于抓捕羊3 -酪蛋白基因約8Kb的3' 側翼區(qū)。Pl (上游引物)5，-《^ acGTTTTTCCTGTGGTCATGTATGGATG-3，； P2 (下游引物)5'-^^^ccgcCGGAGTTCACTCAGACTCATGTCCATC-3'; P3 (上游引物)5，-ccaz^gGAGGATTTCAATGTGAATGCCCCCTC-3，； P4 (下游引物)5，-gfc^acAAATTTTGAGATAAAACAATTG-3，。 上述引物中，小寫兼斜寫部分為酶切位點。分別將羊e-酪蛋白同源臂3fl和3f2與pGEM-T連接，進行測序分析，分析結 果表明，同源臂內部沒有突變。羊P-酪蛋白同源臂3fl的序列見序列表的序列l(wèi)， 自5'端第1至6位脫氧核糖核苷酸為5^7/酶切位點，第357至364位脫氧核糖核 苷酸為AbV酶切位點。羊P-酪蛋白同源臂3f2的序列見序列表的序列2，自5' 端的第1至6位脫氧核糖核苷酸為Afco/酶切位點；自5'端的第451至456位脫氧 核糖核苷酸為&7/酶切位點。2、 同源臂gl與g2的獲得以人血清白蛋白BAC (目錄號RP11-580P21)為模板，以P5和P6為引物，使 用PCR方法克隆獲得人血清白蛋白同源臂gl，人血清白蛋白同源臂gl位于終止密 碼子上游近側；以人血清白蛋白BAC為模板，以P7和P8為引物，使用PCR方法克 隆獲得人血清白蛋白同源臂g2，人血清白蛋白同源臂g2位于起始密碼子下游近側; 這一對同源臂共同用于抓捕從起始密碼子到終止密碼子全長約16Kb的人血清白蛋 白基因組片段。P5 (上游引物)5，-《f t朋cAGCACTTTGTTTTTATCTCCTGCTC-3，； P6 (下游引物)5， -cca z^gTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3，； P7 (上游引物)5'-c^ga^ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTC-3';P8 (下游引物)5'-g〃朋cAACAGCAACCAAGAAGACAGAC-3'。 上述引物中，小寫兼斜寫部分為酶切位點。分別將人血清白蛋白同源臂gl和g2與pGEM-T連接，進行測序分析，分析結果 表明，同源臂內部沒有突變。人血清白蛋白同源臂gl的序列見序列表的序列3，自 5'端第l至6位脫氧核糖核苷酸為^ps/酶切位點，第513至518位脫氧核糖核苷 酸為^o/酶切位點。人血清白蛋白同源臂g2的序列見序列表的序列4，自5'端 的第1至6位脫氧核糖核苷酸為J力oJ酶切位點；自5，端的第514至519位脫氧核 糖核苷酸為^^/酶切位點。3、 同源臂5f 1與5f2的獲得以羊0-酪蛋白BAC (目錄號CH243-261D1)為模板，以P9和P10為引物，使 用PCR方法克隆獲得羊P -酪蛋白同源臂5f 1 ，羊3 -酪蛋白同源臂5f 1位于羊P -酪蛋白基因起始密碼子上游近側；以羊e-酪蛋白BAC為模板，以P11和P12為引 物，使用PCR方法克隆獲得羊e-酪蛋白同源臂5f2，羊P-酪蛋白同源臂5f2位于 羊e-酪蛋白基因5'遠端；這一對同源臂共同用于抓捕羊e-酪蛋白基因約13Kb 的5'側翼區(qū)。P9 (上游引物)5，-塔&"TAAGTGAATC MCCACTTAA TTTTTC-3，； P10 (下游引物)5，-cz^^^GGCTCTCGATTCCTGTGAATGGGAAG-3'; Pll (上游引物)5，-《c^^ccgcACTCTGGAAC AATTTCTTTT TTG-3，； P12 (下游引物)5，-^taciGCAAAACTCACCTCTCTGAATTGC-3'。 上述引物中，小寫兼斜寫部分為酶切位點。分別將羊e -酪蛋白同源臂5f 1和5f2與pGEM-T連接，進行測序分析，分析結 果表明，同源臂內部沒有突變。羊P-酪蛋白同源臂5fl的序列見序列表的序列5， 自5'端第1至6位脫氧核糖核苷酸為6bs/酶切位點，第460至465位脫氧核糖核 苷酸為X力o/酶切位點。羊e-酪蛋白同源臂5f2的序列見序列表的序列6，自5' 端的第1至8位脫氧核糖核苷酸為#"/酶切位點；自5'端的第459至464位脫氧 核糖核苷酸為5"M/酶切位點。4、 三次抓捕載體的構建 1) pBR322載體的改造合成兩個寡核苷酸小片段N1和N2; N1和N2片段退火后形成雙鏈，在兩端分 別形成Pstl和Pvul的粘末端；pBR322用Pstl和Pvul酶切后與上述退火的雙鏈寡核苷酸小片段連接，獲得帶有Notl酶切位點的pBR322質粒，同時破壞掉了pBR322 的氨芐抗性基因，只保留下了四環(huán)素抗性。N1和N2序列如下，劃線部分為vV"I位點Nl: 5， -CGGCGGCCGCCTGCA-3，；N2: 5'-TAGCGCGGCCGCG-3'。2) 將6個同源臂按次序連接在一起，具體如下羊0 -酪蛋白基因同源臂3f 1與羊P -酪蛋白基因同源臂3f2依靠&7/酶切位 點連接在一起，羊P -酪蛋白基因同源臂3f2與人血清白蛋白基因同源臂gl依靠 # /酶切位點連接在一起，人血清白蛋白基因同源臂gl與人血清白蛋白基因同源 臂g2依靠v^3/酶切位點連接在一起，人血清白蛋白基因同源臂g2與羊e -酪蛋白 基因同源臂5fl依靠Wo/酶切位點連接在一起，羊e-酪蛋白基因同源臂5fl與羊 e -酪蛋白基因同源臂5f2依靠5ba/酶切位點連接在一起。3) 在羊e -酪蛋白基因同源臂3fl的3'端和羊P -酪蛋白基因同源臂5f2的5' 端各有一個^^/酶切位點，將按次序連接到一起的6個同源臂使用U酶切，并 轉移克隆到步驟l)改造后的pBR322載體上。將得到的重組載體進行酶切和測序鑒定，證明獲得了連接完全正確的連續(xù)三次 基因抓捕載體pBRSV。，連續(xù)三次基因抓捕載體pBRSV。的結構見圖1。二、乳腺特異性表達載體的構建 1、感受態(tài)細胞的制備1) 分別將含有羊P -酪蛋白基因BAC的DH10(3菌和含有人血清白蛋白BAC的 DH10(5菌制成化學感受態(tài)細胞；2) 將編碼Red重組系統(tǒng)pKD46質粒分別熱激轉化至上述兩種化學感受態(tài)細胞中；3) 將步驟2)得到的細胞在含有氨芐西林和氯霉素的平板上30°C培養(yǎng)基過夜;4) 挑單克隆轉接至液體LB培養(yǎng)基中30°C繼續(xù)培養(yǎng)至0D600為0. 20~0. 25;5) 然后加入lmol/L的L-阿拉伯糖，使終濃度約為6mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)45min 至lh，使0D600達到0. 40~0. 50;6) 離心收集細菌，用10%滅菌甘油洗三次，最后用10%滅菌甘油懸浮，得到終 濃度為lx101。 cells/VL的含有pKD46及羊0 -酪蛋白基因BAC的電擊感受態(tài)細胞， 終濃度為lx101。 cellsAiL的含有pKD46及人血清白蛋白基因BAC的電擊感受態(tài)細胞。2、基因抓捕連續(xù)三次基因抓捕的流程見圖3。圖3中，T6:羊e-酪蛋白基因同源臂3fl;T5:羊e-酪蛋白基因同源臂3f2; T4:人血清白蛋白基因同源臂gl; T3:人血清 白蛋白基因同源臂g2; T2:羊3-酪蛋白基因同源臂5fl; Tl:羊3_酪蛋白基因同源臂5f2。1) 第一次基因抓捕① 將構建好的連續(xù)三次基因抓捕載體pBRSV。用限制性內切酶&7/酶切，打開 羊e-酪蛋白基因同源臂3fl和同源臂3f2之間的連接，釋放出兩個同源臂，脫磷 后回收，構成線性的基因抓捕載體，濃度約為50ng/uL;② 取2uL步驟①得到的線性化抓捕載體加入50uL含pKD46及羊P -酪蛋白基因 BAC的大腸桿菌感受態(tài)細胞中，進行電擊，電擊參數(shù)為2.5kv， 5ms;電擊后立即加 入500uL SOC培養(yǎng)液懸浮，37°C， 220r/min，復蘇1. 5h，然后涂布于含四環(huán)素 (50ug/mL)的LB平板上，37。C孵育24h。對四環(huán)素抗性的細菌克隆抽提質粒進行鑒定，發(fā)現(xiàn)獲得的質粒明顯比抓捕載體 大，說明已經(jīng)抓捕獲得了第一個基因片段；進行酶切鑒定和測序鑒定，證明已經(jīng)成 功抓捕獲得了8Kb的羊e-酪蛋白基因3，調控區(qū)。獲得了克隆有羊P -酪蛋白基因座3'調控區(qū)的抓捕載體pBRSVi。2) 第二次基因抓捕① 從抓捕載體pBRSV,出發(fā)，用限制性內切酶7^s/酶切，打開人血清白蛋白基 因同源臂gl和同源臂g2之間的連接，釋放出兩個同源臂，脫磷后回收，構成線性 的基因抓捕載體，濃度約為50ng/uL;② 取2uL步驟①得到的線性化抓捕載體加入50uL含pKD46及人血清白蛋白基 因BAC的大腸桿菌感受態(tài)細胞中，進行電擊，電擊參數(shù)為2.5kv， 5ms;電擊后立即 加入500uL SOC培養(yǎng)液懸浮，37°C， 220r/min，復蘇1. 5h，然后涂布于含四環(huán)素 (50ug/mL)的LB平板上，37。C孵育24h。對四環(huán)素抗性的細菌克隆抽提質粒進行鑒定，發(fā)現(xiàn)獲得的質粒明顯比第一次抓 捕獲得的質粒大，說明已經(jīng)抓捕獲得了第二個基因片段；進行酶切鑒定和測序鑒定， 證明已經(jīng)成功抓捕獲得了從起始密碼子到終止密碼子16Kb完整的人血清白蛋白基 因組序列。至此獲得了克隆有羊P -酪蛋白基因座3'調控區(qū)和完整的人血清白蛋白基因基因組序列的抓捕載體pBRSV2。 3)第三次基因抓捕① 從抓捕載體pBRSV2出發(fā)，用限制性內切酶5ba/酶切，打開羊e-酪蛋白基因 同源臂5f2和5fl之間的連接，釋放出兩個同源臂，脫磷后回收，構成線性的基因 抓捕載體，濃度約為50ng/uL;② 取2uL步驟①得到的線性化抓捕載體加入50uL含pKD46及羊e -酪蛋白基因 BAC的大腸桿菌感受態(tài)細胞中，進行電擊，電擊參數(shù)為2.5kv， 5ms;電擊后立即加 入500uL SOC培養(yǎng)液懸浮，37°C， 220r/min，復蘇1. 5h，然后涂布于含四環(huán)素 (50ug/mL)的LB平板上，37。C孵育24h。對四環(huán)素抗性的細菌克隆抽提質粒進行鑒定，發(fā)現(xiàn)獲得的質粒明顯比第二次抓 捕獲得的質粒大，說明已經(jīng)抓捕獲得了第三個基因片段；進行酶切鑒定和測序鑒定， 證明已經(jīng)成功抓捕獲得了 13Kb的羊P-酪蛋白5，調控區(qū)。至此獲得了克隆有羊P-酪蛋白基因8Kb的3，調控區(qū)、從起始密碼子到終止密 碼子16Kb的完整的人血清白蛋白基因組序列和13Kb的羊e-酪蛋白5'調控區(qū)的羊 P -酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換型表達載體pBRS，成功實現(xiàn)了把羊P -酪蛋白 基因座中的基因組序列精確地從起始密碼子到終止密碼子置換為人血清白蛋白基 因的基因組序列。將羊P -酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換型表達載體pBRS進行^z'/^/J/酶切 鑒定，結果出現(xiàn)240bp、 3281bp、 4412bp、 5429bp、 6409bp、 7712bp、 9246bp共6 個片段，與預計的完全相同，表明該羊e-酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換型表達 載體pBRS構建正確。三、轉基因小鼠的制備和鑒定1、轉基因小鼠的制備將表達載體pBRS用Y"/酶切，回收目的基因片段，顯微注射到C57小鼠(軍 事醫(yī)學科學院實驗動物中心)受精卵的原核中，經(jīng)過注射的小鼠受精卵通過輸卵管 移植入C57代孕小鼠中，待仔鼠分娩，即得到轉基因首建者(Founder)小鼠。應用southern-blot方法對轉基因首建者(Founder)小鼠進行鑒定，探針序 列見序列表的序列l(wèi)l (645 bp)。共獲得9只陽性的轉基因Founder小鼠(3只雌 鼠；6只雄鼠)。9只陽性的轉基因Founder小鼠的southern-blot鑒定結果如圖5。圖5中，1-9為9只陽性的轉基因Founder小鼠；10為普通的C57小鼠；11為 pBRS載體。將陽性的轉基因Founder小鼠傳代建立了相應的轉基因小鼠系。9只陽性轉基 因Founder小鼠相互交配，得到的子代轉基因小鼠為Fl代，連續(xù)傳代直至F6代。 2、轉基因小鼠的鑒定從F6代轉基因小鼠中任選2只雌性小鼠與雄性C57小鼠進行交配產子。轉基 因小鼠產子后12天，隔離母子3小時，對母鼠注射0. 2U的催產素，20分鐘后麻醉， 擠取乳汁約80ul。同時將普通C57小鼠雌雄交配產子，雌性小鼠產子后12天，隔離母子3小時， 對母鼠注射0.2U的催產素，20分鐘后麻醉，擠取乳汁約80ul，作為陰性對照。1) 轉基因小鼠乳汁中人血清蛋白表達量的測定將乳汁離心脫脂后按10ul每管分裝凍存于-8(TC冰箱中備用，取出后用PBS稀 釋20倍，取10ul加上樣緩沖液混合，煮5分鐘，冰上放置，使用12%的膠進行 SDS-PAGE分析，使用凝膠掃描測定表達的人血清白蛋白的含量。結果見圖7。圖7中，1:普通陰性小鼠乳汁樣本；2:轉基因小鼠乳汁樣本；M: 低分子量蛋白標準?？梢娒黠@的人血清白蛋白條帶，分子量約為66Kda，表達量約 為5g/L乳汁。2) 轉基因小鼠乳汁中人血清白蛋白的鑒定小鼠乳汁使用PBS稀釋1萬倍后取10ul進行SDS-PAGE,使用western-blot 方法鑒定表達的產物是否的確為人血清白蛋白，使用的抗體為HRP標記的小鼠抗人 血清白蛋白單抗。結果見圖9。圖9中，1、 2為兩個轉基因小鼠系乳汁樣本，3為普通陰性小鼠乳 汁樣本。證明表達的的確是人血清白蛋白。實施例2、利用牛0 -酪蛋白基因座構建人血清白蛋白乳腺特異性表達載體 一、牛3 -酪蛋白-人血清白蛋白的同源臂克隆與連續(xù)三次抓捕載體的構建 三對(共6個)長度為400bp-600bp的同源臂，其中第一對同源臂分別位于牛e-酪蛋白基因座的3'端和牛e-酪蛋白基因組序列的終止密碼子附近，用于抓捕牛P-酪蛋白基因座3'調控區(qū)；第二對同源臂分別位于人血清白蛋白基因基因組序 列的起始密碼子和終止密碼子附近，用于抓捕完整的人血清白蛋白基因的基因組序列；第三對同源臂分別位于牛e-酪蛋白基因座的5'端和牛e-酪蛋白基因組序列的起始密碼子附近，用于抓捕牛P-酪蛋白基因座5'調控區(qū)；利用牛P-酪蛋白基 因座和人血清白蛋白基因座內存在的天然酶切位點實現(xiàn)6個同源臂的無縫連接，構 建獲得連續(xù)三次基因抓捕載體。1、 同源臂3f 1與3f2的獲得以牛P-酪蛋白BAC (目錄號RP42-127E3)為模板，以P13和P14為引物，使 用PCR方法克隆獲得牛3 -酪蛋白同源臂3f 1 ，牛e -酪蛋白同源臂3fl位于牛P -酪蛋白基因3'遠端；以牛3-酪蛋白BAC為模板，以P15和P16為引物，使用PCR 方法克隆獲得牛P -酪蛋白同源臂3f2，牛0 -酪蛋白同源臂3f2位于牛P -酪蛋白基 因終止密碼子下游近側;這一對同源臂共同用于抓捕牛e -酪蛋白基因約11 Kb的3' 側翼區(qū)。P13 (上游引物)5， -cafa&AGTGAAAGTG AAAATGAAGT TGCTC-3'; P14 (下游引物)5'-^^^cc^cGAGATGGTGAGGGACAGGGAGGTC-3，； P15 (上游引物):5，-cca ^gGTCTAAATTT ACTAACTGTG CTG-3，； P16 (下游引物)5， -ca"^ATAATTGTGATAAGGAGAACTTC-3'。 上述引物中，小寫兼斜寫部分為酶切位點。分別將牛e -酪蛋白同源臂3f 1和3f2與pGEM-T連接，進行測序分析，分析結 果表明，同源臂內部沒有突變。牛P-酪蛋白同源臂3fl的序列見序列表的序列7， 自5'端第1至6位脫氧核糖核苷酸為#&/酶切位點，第416至423位脫氧核糖核 苷酸為^W/酶切位點。牛P -酪蛋白同源臂3f2的序列見序列表的序列8，自5' 端的第1至6位脫氧核糖核苷酸為7fco/酶切位點；自5'端的第441至446位脫氧 核糖核苷酸為yW/e/酶切位點。2、 同源臂gl與g2的獲得以人血清白蛋白BAC(目錄號RP11-580P21)為模板，以P5和P6為引物，使用 PCR方法克隆獲得人血清白蛋白同源臂gl，人血清白蛋白同源臂gl位于終止密碼 子上游近側；以人血清白蛋白BAC為模板，以P7和P8為引物，使用PCR方法克隆 獲得人血清白蛋白同源臂g2，人血清白蛋白同源臂g2位于起始密碼子下游近側； 這一對同源臂共同用于抓捕從起始密碼子到終止密碼子全長約16Kb的人血清白蛋 白基因組片段。P5 (上游引物)5， -g"朋cAGCACTTTGTTTTTATC TCCTGCTC-3';P6 (下游引物)5，-ccaz^gTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3，； P7 (上游引物)5，-"c卵MTGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTC-3'; P8 (下游引物)5，-《"朋cAACAGCAACCAAGAAGACAGAC-3，。 上述引物中，小寫兼斜寫部分為酶切位點。分別將人血清白蛋白同源臂gl和g2與pGEM-T連接，進行測序分析，分析結果 表明，同源臂內部沒有突變。人血清白蛋白同源臂gl的序列見序列表的序列3，自 5'端第l至6位脫氧核糖核苷酸為^^/酶切位點，第513至518位脫氧核糖核苷 酸為^o/酶切位點。人血清白蛋白同源臂g2的序列見序列表的序列4，自5'端 的第1至6位脫氧核糖核苷酸為化o/酶切位點；自5，端的第514至519位脫氧核 糖核苷酸為^/^/酶切位點。3、 同源臂5f 1與5f2的獲得以牛P-酪蛋白BAC (目錄號RP42-127E3)為模板，以P17和P18為引物，使 用PCR方法克隆獲得牛e -酪蛋白同源臂5f 1，牛e -酪蛋白同源臂5fl位于牛e -酪蛋白基因起始密碼子上游近側；以牛P-酪蛋白BAC為模板，以P19和P20為引 物，使用PCR方法克隆獲得牛P-酪蛋白同源臂5f2，牛0-酪蛋白同源臂5f2位于 牛e-酪蛋白基因5'遠端；這一對同源臂共同用于抓捕牛e-酪蛋白基因約15 Kb 的5'側翼區(qū)。P17 (上游引物)5， -a《&ciCTAAGACATATCTGGCAATAAAAATTA-3'; P18 (下游引物)5， -cz^ga^GGCTCTCAATTCCTGGGAATG-3，； P19 (上游引物)5，-《c^rc《cTCAAGAAGAT CCCCTGGAGA AGG-3，； P20 (下游引物)5'-^tacz^ATGGTGACCAGAACGCCTTGTGG-3，。 上述引物中，小寫兼斜寫部分為酶切位點。分別將牛e-酪蛋白同源臂5fl和5f2與pGEM-T連接，進行測序分析，分析結 果表明，同源臂內部沒有突變。牛0-酪蛋白同源臂5fl的序列見序列表的序列9， 自5，端第1至6位脫氧核糖核苷酸為5ba/酶切位點，第505至510位脫氧核糖核 苷酸為J力o/酶切位點。牛P-酪蛋白同源臂5f2的序列見序列表的序列10，自5， 端的第1至8位脫氧核糖核苷酸為iV"/酶切位點；自5'端的第459至464位脫氧 核糖核苷酸為5ba/酶切位點。4、 三次抓捕載體的構建 1) pBR322載體的改造同實施例1的步驟一的4的1)。2) 將6個同源臂按次序連接在一起，具體如下牛e -酪蛋白基因同源臂3fl與牛P -酪蛋白基因同源臂3f2依靠7W/eJ酶切位 點連接在一起，牛e -酪蛋白基因同源臂3f2與人血清白蛋白基因同源臂gl依靠 AfcoJ酶切位點連接在一起，人血清白蛋白基因同源臂gl與人血清白蛋白基因同源 臂g2依靠i^a/酶切位點連接在一起，人血清白蛋白基因同源臂g2與牛P -酪蛋白 基因同源臂5f 1依靠Z力o/酶切位點連接在一起，牛0 -酪蛋白基因同源臂5f 1與牛 P -酪蛋白基因同源臂5f2依靠6bs/酶切位點連接在一起。3) 在牛e -酪蛋白基因同源臂3fl的3'端和牛P -酪蛋白基因同源臂5f2的5' 端各有一個M^/酶切位點，將按次序連接到一起的6個同源臂使用yV"/酶切，并 轉移克隆到步驟1)改造后的PBR322載體上。將得到的重組載體進行酶切和測序鑒定，證明獲得了連接完全正確的連續(xù)三次 基因抓捕載體pBRCV。，連續(xù)三次基因抓捕載體pBRCV。的結構見圖2。 二、乳腺特異性表達載體的構建1、 感受態(tài)細胞的制備1) 分別將含有牛e -酪蛋白基因BAC的DH10P菌和含有人血清白蛋白BAC的 DH10卩菌制成化學感受態(tài)細胞；2) 將編碼Red重組系統(tǒng)pKD46質粒分別熱激轉化至上述兩種化學感受態(tài)細胞中；3) 將步驟2)得到的細胞在含有氨芐西林和氯霉素的平板上30°C培養(yǎng)基過夜；4) 挑單克隆轉接至液體LB培養(yǎng)基中30°C繼續(xù)培養(yǎng)至0D600為0. 20~0. 25;5) 然后加入lmol/L的L-阿拉伯糖，使終濃度約為6mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)45min 至lh，使0廳0達到0. 40~0. 50;6) 離心收集細菌，用10%滅菌甘油洗三次，最后用10%滅菌甘油懸浮，得到終 濃度為lxl01Q cells/(iL的含有pKD46及牛e -酪蛋白基因BAC的電擊感受態(tài)細胞， 終濃度為lxl01D cellsAiL的含有pKD46及人血清白蛋白基因BAC的電擊感受態(tài)細 胞。2、 基因抓捕連續(xù)三次基因抓捕的流程見圖4。圖4中，T6:牛e-酪蛋白基因同源臂3fl; T5:牛P-酪蛋白基因同源臂3f2; T4:人血清白蛋白基因同源臂gl; T3:人血清白蛋白基因同源臂g2; T2:牛e-酪蛋白基因同源臂5fl; Tl:牛P-酪蛋白基因同 源臂5f2。1) 第一次基因抓捕① 將構建好的連續(xù)三次基因抓捕載體pBRSV。用限制性內切酶T^e/酶切，打開 牛P-酪蛋白基因同源臂3fl和同源臂3f2之間的連接，釋放出兩個同源臂，脫磷 后回收，構成線性的基因抓捕載體，濃度約為50ng/uL;② 取2uL步驟①得到的線性化抓捕載體加入50uL含pKD46及牛e -酪蛋白基因 BAC的大腸桿菌感受態(tài)細胞中，進行電擊，電擊參數(shù)為2.5kv， 5ms;電擊后立即加 入500uL SOC培養(yǎng)液懸浮，37°C， 220r/min，復蘇1. 5h，然后涂布于含四環(huán)素 (50ug/mL)的LB平板上，37"C孵育24h。對四環(huán)素抗性的細菌克隆抽提質粒進行鑒定，發(fā)現(xiàn)獲得的質粒明顯比抓捕載體 大，說明已經(jīng)抓捕獲得了第一個基因片段；進行酶切鑒定和測序鑒定，證明已經(jīng)成 功抓捕獲得了 11 Kb的牛P-酪蛋白基因3'調控區(qū)。獲得了克隆有牛P -酪蛋白基因座3'調控區(qū)的抓捕載體pBRCV,。2) 第二次基因抓捕① 從抓捕載體pBRCK出發(fā)，用限制性內切酶i^a/酶切，打開人血清白蛋白基 因同源臂gl和同源臂g2之間的連接，釋放出兩個同源臂，脫磷后回收，構成線性 的基因抓捕載體，濃度約為50ng/uL;② 取2uL步驟①得到的線性化抓捕載體加入50uL含pKD46及人血清白蛋白基 因BAC的大腸桿菌感受態(tài)細胞中，進行電擊，電擊參數(shù)為2.5kv， 5ms;電擊后立即 加入500uL SOC培養(yǎng)液懸浮，37°C， 220r/min，復蘇1. 5h，然后涂布于含四環(huán)素 (50ug/mL)的LB平板上，37。C孵育24h。對四環(huán)素抗性的細菌克隆抽提質粒進行鑒定，發(fā)現(xiàn)獲得的質粒明顯比第一次抓 捕獲得的質粒大，說明已經(jīng)抓捕獲得了第二個基因片段；進行酶切鑒定和測序鑒定， 證明已經(jīng)成功抓捕獲得了從起始密碼子到終止密碼子16Kb完整的人血清白蛋白基 因組序列。至此獲得了克隆有牛P -酪蛋白基因座3'調控區(qū)和完整的人血清白蛋白基因基 因組序列的抓捕載體pBRCV2。3) 第三次基因抓捕①從抓捕載體pBRCV2出發(fā)，用限制性內切酶5b3/酶切，打開牛P-酪蛋白基因同源臂5f2和5fl之間的連接，釋放出兩個同源臂，脫磷后回收，構成線性的基因 抓捕載體，濃度約為50ng/uL;②取2uL步驟①得到的線性化抓捕載體加入50uL含pKD46及牛P -酪蛋白基因 BAC的大腸桿菌感受態(tài)細胞中，進行電擊，電擊參數(shù)為2.5kv， 5ms;電擊后立即加 入500uL SOC培養(yǎng)液懸浮，37°C ， 220r/min，復蘇1. 5h，然后涂布于含四環(huán)素(50ug/mL) 的LB平板上，37。C孵育24h。對四環(huán)素抗性的細菌克隆抽提質粒進行鑒定，發(fā)現(xiàn)獲得的質粒明顯比第二次抓 捕獲得的質粒大，說明已經(jīng)抓捕獲得了第三個基因片段；進行酶切鑒定和測序鑒定， 證明已經(jīng)成功抓捕獲得了 15 Kb的牛e-酪蛋白5'調控區(qū)。至此獲得了克隆有牛e-酪蛋白基因11Kb的3，調控區(qū)、從起始密碼子到終止 密碼子16Kb的完整的人血清白蛋白基因組序列和15 Kb的牛P-酪蛋白5'調控區(qū) 的牛e -酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換型表達載體pBRC，成功實現(xiàn)了把牛0 -酪 蛋白基因座中的基因組序列精確地從起始密碼子到終止密碼子置換為人血清白蛋 白基因的基因組序列。將牛P -酪蛋白-人血清白蛋白基因組置換型表達載體pBRC進行^^/酶切鑒 定。鑒定結果出現(xiàn)10個條帶，分別為663bp、 803bp、 2194bp、 2221bp、 3080bp、 3385bp、 3647bp、 5350bp、 9250bp、 11865bp，表明牛P -酪蛋白-人血清白蛋白基 因組置換型表達載體pBRC構建正確。三、轉基因小鼠的制備和鑒定1、 轉基因小鼠的制備將表達載體pBRC用y^f/酶切，回收目的基因片段，顯微注射到C57小鼠(購 自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心)受精卵的原核中，經(jīng)過注射的小鼠受精卵通過輸 卵管移植入C57代孕鼠中，待仔鼠分娩，即得到轉基因首建者(Founder)小鼠。應用southern-blot方法對轉基因首建者(Founder)小鼠進行鑒定，探針序 列見序列表的序列l(wèi)l (645 bp)。共獲得7只陽性的轉基因Founder小鼠。7只陽 性的轉基因Founder小鼠的southern-blot鑒定結果如圖6。圖6中，1為pBRC載 體；2為普通C57小鼠；3-9為7只陽性的轉基因小鼠。將陽性的轉基因Founder小鼠傳代建立了相應的轉基因小鼠系。7只陽性轉基 因Founder小鼠相互交配，得到的子代轉基因小鼠為Fl代，連續(xù)傳代直至F6代。2、 轉基因小鼠的鑒定從F6代轉基因小鼠中任選3只雌性小鼠與雄性C57小鼠進行交配產子。轉基 因小鼠產子后12天，隔離母子3小時，對母鼠注射0. 2U的催產素，20分鐘后麻醉， 擠取乳汁約80ul。同時將C57小鼠雌雄交配產子，雌性小鼠產子后12天，隔離母子3小時，對 母鼠注射0.2U的催產素，20分鐘后麻醉，擠取乳汁約80ul，作為陰性對照。1) 轉基因小鼠乳汁中人血清蛋白表達量的測定將乳汁離心脫脂后按10ul每管分裝凍存于-8(TC冰箱中備用，取出后用PBS稀 釋20倍，取10ul加上樣緩沖液混合，煮5分鐘，冰上放置，使用12%的膠進行 SDS-PAGE分析，使用凝膠掃描測定表達的人血清白蛋白的含量。結果見圖8。圖8中，1:轉基因小鼠乳汁樣本；2:普通陰性小鼠乳汁樣本； M:低分子量蛋白標準?？梢娒黠@的人血清白蛋白條帶，分子量約為66Kda，表達量 約為8g/L乳汁。2) 轉基因小鼠乳汁中人血清白蛋白的鑒定小鼠乳汁使用PBS稀釋1萬倍后取10ul進行SDS-PAGE，使用western-blot 方法鑒定表達的產物是否的確為人血清白蛋白，使用的抗體為HRP標記的小鼠抗人 血清白蛋白單抗。結果見圖IO。圖IO中，I、 2、 3為三個轉基因小鼠系乳汁樣本，4為普通陰性 小鼠乳汁樣本。證明表達的的確是人血清白蛋白。序列表<110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所<120>乳腺特異性表達載體及其構建方法〈130〉 CGGNARY81247〈160〉 11〈210〉 1<211〉 364<212> DNA <213〉人工序列<400〉 1gtcgacgttt ttcctgtggt catgtatgga tgtgagagtt caccgaagaa ttgatgcttt tgaactgtgg tgttggagaa actgcaagga gatccaacca gtccattctg aaggagatca gtaatgatgc taaagctgaa actccaatac tttggccacc ttggaaaaga ctctgatggt gggagggatt gggggcaaga atgagatggc tgaatggcat cactgeictcg atggacatga ccgc〈210> 2 <211> 456 <212〉 靈 <213>人工序列<400> 2ccatgggagg atttcaatgt gaatgccccc tcctcactttggactgtg肌gaaggctgag gactcttgag agtcccttgg gccctgggat ttctttggaa "tcatgtgaag agttgactca_ gg卿agggg acga^cagagg gtctgagtga actccggcgg60 120 180 240 300 360 364tggtaagctt taggagatta60gaggcagactgatcatttttatagttaatatcttttacatttaattttcctggataagac120ccaatagtagcaatttctatcagt3tscc3gcgtaaagattagttttaaatttattttca180gtg3ttg3Ctgttatttactgacctgaaattatgtatctgttatatttcaaataatgcaa240atatggtgttgac3gatttgattggttttctttcaattgcctatatcctt300attattgsttgtaatcatttataga犯aaactgaaaataatttcttatacttttatgtaa3603CCtgtt3g3gcttattttaaagatcaactgcattcacatttctaatctagtcattatga420gcttcaattgttttatctcactt犯肌tttgtcgac456〈210〉 3〈211〉 518〈212〉 DNA〈213>人工序列<400> 3gttaacagcactttgtttttatctcctgctctattgtgccatactgttaaatgtttataa60tgcctgttctgtttccaaatttgtgatgcttatgaatatt肪taggaatatttgt犯ggc120ctgaaatsttttga_tc3tgaaatcaaaacattaMttatttaaacatttacttgaaatgt180ggtggtttgtgatttagttgattttataggCt8Lgtggg3gaatttacattcaaatgtcta240aatcacttaaaattgccctttatggcctgacagtaacttttttttattcatttggggaca300actatgtccgtgagcttccgtccagagattatagtagtaaattgteiattaaaggatatga360tgcacgtgaaatcactttgcaatcatcaatagcttcataaatgttaattttgtatcctaa420tagtaatgctaatattttcctaacatctgtcatgtctttgtgttC3gggt朋aaaacttg■ttgctgcaagtcaagctgccttaggcttataacc3tgg518<210〉 4<211> 519<212〉DNA 〈213〉人工序列<400> 4ctcgagatgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattcc60鄉(xiāng)ggtgtgtttcgtcgagatgcacgtaagaaatccatttttctattgttcaacttttat120tctattttcccagtaaaataaagtttta^gt3aactctgC3tcttta肌gaattattttgg180catttatttctaaaatggcatagtattttgtatttgtgaeigtcttacaaggttatcttat240caaacatcctaggtaaeiaaacagaattgtttagtgactgt300aattttcttttgcgcactaagg犯agtgcaaagt6L8icttaggtgtgactgEiaacttcacag360aerUgggttgaagattgaattcataactatcccEiaagacctatccattgcactatgcttt420at 11 aaaaaccacaaaacctgtgctgttgatctcataaatag肌cttgt3tttatattta480ttttCElttttagtctgtcttcttggttgctgttgttaac519<210> 5〈211〉 465〈212〉 腿〈213〉人工序列<400> 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1. 乳腺特異性表達載體的構建方法，包括如下步驟1)構建DNA片段M0；M0自上游至下游依次為同源臂T1、同源臂T2、同源臂T3、同源臂T4、同源臂T5、同源臂T6；所述6個同源臂的長度均為400-600bp；同源臂T5和同源臂T6能通過與乳蛋白BAC同源重組獲得乳蛋白基因座3’調控區(qū)；同源臂T3和同源臂T4能通過與外源目的蛋白BAC同源重組獲得完整的外源目的蛋白基因組序列；同源臂T1和同源臂T2能通過與乳蛋白BAC同源重組獲得乳蛋白基因座5’調控區(qū)；2)將所述DNA片段M0插入載體中，得到連續(xù)三次基因抓捕載體；3)通過與所述乳蛋白BAC進行兩次同源重組、與所述外源目的蛋白BAC進行一次同源重組，將步驟2)得到的連續(xù)三次基因抓捕載體中的DNA片段M0替換為DNA片段M1，得到所述外源目的蛋白的乳腺特異性表達載體；M1自上游至下游依次為所述乳蛋白基因座3’調控區(qū)、完整的所述外源目的蛋白基因組序列、所述乳蛋白基因座5’調控區(qū)。
2、 如權利要求l所述的方法，其特征在于所述乳蛋白基因座為牛、羊、豬、 馬、兔、人或鼠的乳蛋白基因座。
3、 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述乳蛋白基因座為羊e-酪蛋白基因座、牛0-酪蛋白基因座、小鼠WAP基因座、兔WAP基因座、奶牛asl-酪蛋白基因 座、奶牛as2-酪蛋白基因座、人乳白蛋白基因座或山羊e-乳球蛋白基因座或牛e-乳球蛋白基因座。
4、 如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述外源目的蛋白為人 血清白蛋白。
5、 一種DNA片段，自上游至下游依次為同源臂T,、同源臂L、同源臂L、同源 臂L、同源臂Ts、同源臂Te;所述6個同源臂的長度均為400-600bp;同源臂Ts和同 源臂T6能通過與乳蛋白BAC同源重組獲得乳蛋白基因座3'調控區(qū)；同源臂T3和同源 臂T4能通過與外源目的蛋白BAC同源重組獲得完整的外源目的蛋白基因組序列；同源 臂L和同源臂T2能通過與乳蛋白BAC同源重組獲得乳蛋白基因座5'調控區(qū)。
6、 一種DNA片段，自上游至下游依次為乳蛋白基因座5'調控區(qū)、完整的外源目 的蛋白基因組序列、乳蛋白基因座3'調控區(qū)。
7、 如權利要求5或6所述的DNA片段，其特征在于所述乳蛋白基因座為牛、羊、豬、馬、兔、人或鼠的乳蛋白基因座；優(yōu)選為羊e-酪蛋白基因座、牛e-酪蛋白基因座、小鼠WAP基因座、兔WAP基因座、奶牛asl-酪蛋白基因座、奶牛as2-酪蛋白基因座、人乳白蛋白基因座或山羊P -乳球蛋白基因座或牛P -乳球蛋白基因座。
8、 如權利要求5至7中任一所述的DNA片段，其特征在于所述外源目的蛋白 為人血清白蛋白。
9、 攜帶有權利要求5至8中任一所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細 胞系和重組菌。
10、 權利要求1至4中任一所述方法、權利要求5至8中任一所述DNA片段或權 利要求9所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系、重組菌在制備乳腺生物反應器中的 應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳腺特異性表達載體及其構建方法。本發(fā)明提供的乳腺特異性表達載體的構建方法，包括如下步驟1)構建DNA片段M₀；M₀自上游至下游依次為同源臂T₁-T₆；2)將M₀插入載體，得到連續(xù)三次基因抓捕載體；3)通過三次同源重組，T₅和T₆抓獲乳蛋白基因座3’調控區(qū)；T₃和T₄抓獲完整的外源目的蛋白基因組序列；T₁和T₂抓獲乳蛋白基因座5’調控區(qū)。本發(fā)明得到了乳蛋白-目的蛋白的雜合基因座，雜合基因座內包含乳蛋白上下游表達調控序列，中間是外源目的蛋白的基因組序列。本發(fā)明將為動物乳腺個體表達系統(tǒng)注入新的活力，有力促進乳腺生物反應器表達系統(tǒng)的推廣運用。
文檔編號A01K67/027GK101265483SQ20081010501
公開日2008年9月17日 申請日期2008年4月25日 優(yōu)先權日2008年4月25日
發(fā)明者吳曉潔, 周顏榮, 施庚壽, 陳紅星, 黃培堂 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所