對(duì)河流弧菌o2，o4，o13，o15和o18特異的核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及對(duì)河流弧菌O2，O4，O13，O15和O18血清型特異的核苷酸及其應(yīng)用，所述核苷酸包括1）SEQIDNO:1-14所示的核苷酸中的至少一種；2）與SEQIDNO:1-14所示的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸中的至少一種。這些核苷酸可用于制備檢測(cè)河流弧菌用PCR試劑盒和基因芯片。本發(fā)明的對(duì)河流弧菌O2，O4，O13，O15和O18血清型特異的核苷酸及包含該核苷酸的PCR試劑盒、基因芯片的實(shí)用性強(qiáng)，PCR試劑盒配制方法簡便，檢測(cè)周期短、速度快，可操作性強(qiáng)，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而檢測(cè)成本卻相對(duì)較低；準(zhǔn)確性高；靈敏度高。
【專利說明】對(duì)河流弧菌02，04，013，015和018特異的核苷酸及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001]本發(fā)明涉及對(duì)河流弧菌02，04，013，015和018血清型特異的核苷酸，尤其涉及對(duì)河流弧菌02，04，013,015和018血清型O抗原基因簇中單個(gè)基因特異的核苷酸及其應(yīng)用。 【背景技術(shù)】 [0002]河流弧菌為革蘭氏陰性菌，是海洋環(huán)境的主要棲息菌之一，廣泛存在于河流和出?？诃h(huán)境水域，也是人類與水生生物主要的細(xì)菌性病原之一，可以起魚、蝦、貝等多種養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。河流弧菌還可以通過各種食物導(dǎo)致人類嚴(yán)重的流行性腹瀉，是弧菌屬中僅次于霍亂弧菌和副溶血弧菌的致病性弧菌，被認(rèn)為是一種全球性的人獸共患的新型病原菌。它的分型與鑒定是海洋菌種庫建立的重要前提之一。 [0003]細(xì)菌分型與鑒定方法主要有傳統(tǒng)的表型方法、血清學(xué)方法以及分子鑒定方法。然而，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的血清分型和鑒定方法存在著一定的問題，如血清分型這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和儲(chǔ)存中也存在一些困難。另一方面血清分型方法耗時(shí)長、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，不同的O抗原產(chǎn)生的抗血清之間經(jīng)常存在交叉反應(yīng)。因此，建立基于分子生物學(xué)技術(shù)的血清鑒定方法成為發(fā)展方向。 [0004]河流弧菌的分子鑒定越來越受到人們的重視，成為河流弧菌菌種與株型鑒定的重要依據(jù)，不少新菌也因此產(chǎn)生。對(duì)弧菌而言，生化反應(yīng)主要是各種酶譜的表現(xiàn)，屬于外部形態(tài)的內(nèi)容，核酸的相似性才是弧菌種的界定最根本、最直接的特征。因此，河流弧菌的分型與鑒定最有效、最直接的方式應(yīng)該從核酸的研究觸發(fā)，通過比較核酸(包括基因組與核酸片段)的相似性確定河流弧菌的歸屬。 [0005]近年來，越來越多的分子技術(shù)用于病原菌的分型、鑒定、檢測(cè)及病害診斷，包括轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性(RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析等。分子生物學(xué)方法不僅可用于河流弧菌的快速血清分型篩查，穩(wěn)定的鑒定結(jié)果可以彌補(bǔ)表型特征鑒定方法的不足。和傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，這些基于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子檢測(cè)技術(shù)，不需要經(jīng)過病原菌的分離、純培養(yǎng)等過程，而且具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。 [0006]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerase chain reaction,簡稱PCR技術(shù))作為微生物檢測(cè)技術(shù)目前正在得到認(rèn)同和推廣，該技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，只需對(duì)樣品進(jìn)行簡單的預(yù)增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備細(xì)菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導(dǎo)下的PCR過程中擴(kuò)增目標(biāo)序列，達(dá)到檢測(cè)樣品中是否含有待測(cè)的致病性微生物的目的。PCR的擴(kuò)增過程僅需I個(gè)半小時(shí)。這對(duì)檢驗(yàn)檢疫部門和臨床檢驗(yàn)無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。 [0007]不論從國內(nèi)和國際的角度來看，快速、準(zhǔn)確地鑒定出血清類型，為河流弧菌的防控提供有效技術(shù)支持是十分重要的。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供了本發(fā)明涉及對(duì)河流弧菌02，04，013，015和018血清型特異的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有:
OSEQ ID NO: 1-14所示的核苷酸中的至少一種；
2)與SEQ ID NO: 1-14所示的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸中的至少一種；所述的SEQ IDNO: 1-14 如下:
【權(quán)利要求】
1.對(duì)河流弧菌02，04，013，015和018血清型特異的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有: 1)SEQ ID NO: 1-14所示的核苷酸中的至少一種； 2)與SEQ ID NO: 1-14所不的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸中的至少一種。
2.上述核苷酸可以用于制備檢測(cè)河流弧菌02，04，013，015和018血清型用PCR試劑盒、基因芯片或微陣列；所述河流弧菌可以取樣于自來水、河流水、海水的培養(yǎng)物的粗提液，或是河流弧菌的純培養(yǎng)物的粗提液。
3.一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物為如SEQID NO: 1-14所示的核苷酸中的至少一種。
4.權(quán)利要求2所述的試劑盒，還包括如下試劑:10mM dNTP 30 μ 1 ；10Χ酶特異性反應(yīng)緩沖液50 μ1；5U/ μ I耐熱DNA聚合酶5 μ 1 ;引物混合物10 μ 1;陽性對(duì)照品10 μ 1 ;陰性對(duì)照品 10 μ 1 ；ddH20 1ml。
5.權(quán)利要求1所述的SEQID NO: 1-14核苷酸在制備用于檢測(cè)河流弧菌PCR試劑盒方面的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的SEQID NO: 1-14核苷酸在制備用于檢測(cè)河流弧菌的基因芯片方面的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的SEQID NO: 1-14核苷酸在制備用于檢測(cè)河流弧菌微陣列方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103898108SQ201410158813
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】王敏, 王磊, 胡少輝, 馮露 申請(qǐng)人:南開大學(xué)