專利名稱：一種4－香豆酸輔酶a連接酶基因及其克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種4-香豆酸輔酶A連接酶基因及其克隆，屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及到紫穗槐(Amorpha fruticosa)編碼4-香豆酸輔酶A連接酶的基因及其克隆。
背景技術(shù)：
林業(yè)生產(chǎn)中樹(shù)木的價(jià)值不但在于木材產(chǎn)量，還體現(xiàn)在木纖維的理化指標(biāo)上。木纖維主要由木質(zhì)素和纖維素組成。纖維素是主要由β-D-葡萄糖基以1-4糖苷鍵連接而成的復(fù)雜的高分子物質(zhì)，是造紙的主要原料。造紙制漿的過(guò)程就是要從植物纖維原料中去除木質(zhì)素類物質(zhì)，盡量保留纖維素和半纖維素。木材與禾桿植物細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量相當(dāng)高，這就是常用造紙?jiān)显谥茲{造紙工業(yè)中產(chǎn)生污染的根本原因。為了降低污染，人們開(kāi)展了多學(xué)科的廣泛研究。隨著植物分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，人們開(kāi)始重視從造紙?jiān)稀参锶胧?，試圖在了解植物生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理及分子調(diào)控的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因工程途徑研究開(kāi)發(fā)出立足減輕環(huán)境污染、更適合于制漿造紙工業(yè)的植物資源，從根本上解決造紙污染問(wèn)題。因此涉及植物纖維素合成以及降低植物木質(zhì)素含量或改變其組成的基因工程的研究、應(yīng)用對(duì)紙漿工業(yè)具有非常重要的作用。本發(fā)明試圖從降低植物木質(zhì)素含量這個(gè)角度來(lái)研究如何改善樹(shù)木材質(zhì)的問(wèn)題，并通過(guò)基因克隆及其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)來(lái)研究相關(guān)基因在植物體內(nèi)的作用。此項(xiàng)研究的成功必將從根本上大大減輕乃至消除因降解木質(zhì)素而對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的污染，提高造紙制漿行業(yè)的生產(chǎn)率，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。因此，通過(guò)基因工程技術(shù)控制木質(zhì)素含量和組成，可在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用。
4-香豆酸輔酶A連接酶(4-CoumarateCoA ligases，4CL，EC 6.2.1.12)的主要功能是催化羥基苯乙酸到相應(yīng)的硫酯的反應(yīng)，維持苯丙酸類(如木質(zhì)素和黃酮類化合物)生物合成所需新陳代謝功能，可利用香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸作為底物，催化合成木質(zhì)素單體，調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成。4CL反義基因，可抑制4-香豆酸CoA連接酶在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，降低木質(zhì)素含量。從降低植物木質(zhì)素含量這個(gè)角度來(lái)研究如何改善樹(shù)木材質(zhì)的問(wèn)題，可從根本上大大減輕乃至消除因降解木質(zhì)素而對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的污染，提高造紙制漿行業(yè)的生產(chǎn)率，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紫穗槐(Amorpha fruticosa)編碼4-香豆酸輔酶A連接酶的基因4CL序列及其相應(yīng)的氨基酸序列。提供了含有4CL的克隆載體pUC19/4CL和含有這種載體的E.coli細(xì)胞JM109/pUC19/4CL。利用本發(fā)明成果，可以構(gòu)建4-香豆酸輔酶A連接酶基因工程菌，用于植物的基因轉(zhuǎn)化，達(dá)到改善植物品質(zhì)的目的。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是利用簡(jiǎn)并寡核苷酸PCR法結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增PCR法，以紫穗槐莖RNA為模板，先用簡(jiǎn)并PCR引物，通過(guò)RT-PCR的方法，得到了4CL基因片段，又據(jù)此片段設(shè)計(jì)反向嵌套引物，用RACE方法獲得了未知的5’和3’端基因片段，從而克隆了紫穗槐4CL全長(zhǎng)cDNA，并測(cè)定了核苷酸序列。將4CL和克隆載體pUC19分別用限制性內(nèi)切酶切割，形成互補(bǔ)的粘性末端，T4DNA連接酶連接，形成4CL克隆載體pUC19/4CL。熱激法將這個(gè)克隆載體導(dǎo)入感受態(tài)E.coli細(xì)胞JM109，成為含有pUC19/4CL的大腸桿菌細(xì)胞JM109/pUC19/4CL。
紫穗槐(Amorpha fruticosa)4-香豆酸輔酶A連接酶基因4CL全序列在GenBanK數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)，號(hào)碼為AF435968。具體序列如下1 tcacaaacac aaaataccat tcccgcaatg gcatttgaga cagaagaacc aaaggaattc61 atcttcaggt caaaattacc agaaatccca atctccaaac accttcccct tcactcttac121 tgctttgaga acctctcaga attcgggtca cgtccatgct tgatcagtgc cccaacaggg181 gacgtgtaca cctactatga cgtggaactc accgctagaa gagttgcctc tggactcaac241 aaattgggtg tccaacaagg tgatgtcatc atgctccttc ttcctaattc accagaattt301 gtgttctcct tcttgggtgc ctcttaccgt ggtgccatga tcactgctgc caacccattc361 ttcacatccg ctgagattgc aaaacaggcc aaagcctcca acaccaagtt gcttataaca421 caagcttctt actacgacaa ggttaaggat ttggatgtga agttggtgtt cgtggactct481 ccccctgatg ggcacatgca ctattcagag ctgcgtgagg ctgatgagag tgacatgcct541 gaggtgaaga ccaaccctga tgatgtggtg gcacttccct attcgtcagg gacaacaggg601 ttgcccaaag gggtgatgtt atctcacaaa gggttggcga ccagcatagc acaacaagtt661 gatggggaaa accccaacct ctactttcac aatgaggatg tcatattgtg tgtgcttcca721 ctctttcata tatattctct caattctgtt ctgttgtgtg ggttgagagc caaggctgct781 attttgctga tgccaaagtt tgagatcaat gccttgttgg gtctcattca gaaacaccga841 gtaacaattg cccctattgt cccacccatt gttttggcca ttgccaagtc accggatctt901 gaaaagtatg atctctcttc cattagggtg ttgaaatctg gaggggcttc tctgggcaaa961 gaactcgaag acactgtgag ggctaaattc cccaaggcca aacttggaca gggatacgga1021 atgactgagg cagggccagt gctaacaatg tgcttagcat ttgctaagga accgatagat1081 gtaaaaccag gtgcatgtgg aaccgttgta agaaatgcag agatgaagat tgtggatcct1141 gaaactggta attcgttgcc acgaaaccag tccggtgaaa tttgcataag aggcgaccag1201 atcatgaaag gttatctaaa tgatcaagag gctacgcaga gaaccataga caaagaaggg1261 tggttgcata caggtgacat cggctacatc gacgatgacg atgagttatt catcgttgac1321 aggcttaagg aattgatcaa atacaaagga tttcaggtgg ctcctgctga actcgaagcc1381 cttcttctct ctcatcccaa gatcaccgat gctgctgtgg ttccaatgaa ggatgaagca1441 gctggagagg tacctgttgc atttgtggtg agatcaaatg gtcacacaga cacaaccgag1501 gatgaaatta agcagtttat ctccaaacag gtggtgtttt ataaaagaat aagcagagta1561 ttcttcattg atgcaattcc caagtcaccg tcaggtaaaa tcttacgaaa ggatctaaga1621 gcaaagcttg cagcaggtgt tccaaattga aaattctaat tccaagatat atgatattac1681 cattatcata cgatgcccgc acaaagctcc ataaaccttg aaggccagag tgcggacgcg1741 tgcttggagc ttgaccgcat tacttatatt cacacgaggg cagacatgat taccttaaaa1801 gggggggttg ctaattatat tttaaaacta tattgggtaa aatttgattc gatcaaggac1861 tttcatatta tataatatcg aagtataatt tttcaaaaaa aaaaaaaaaa a其中ATG為轉(zhuǎn)錄起始密碼，TAG為轉(zhuǎn)錄終止密碼。根據(jù)以上核苷酸序列，推測(cè)紫穗槐(Amorpha fruticosa)4-香豆酸輔酶A連接酶氨基酸序列如下1 MAFET EEPKE FIFRS KLPEI PISKH LPLHS YCFEN LSEFG41 SRPCL ISAPT GDVYT YYDVE LTARR VASGL NKLGV QQGDV81 IMLLL PNSPE FVFSF LGASY RGAMI TAANP FFTSA EIAKQ
121 AKASN TKLLI TQASY YDKVK DLDVK LVFVD SPPDG HMHYS161 ELREA DESDM PEVKT NPDDV VAL VMLSH201 KGLAT SIAQQ VDGEN PNLYF HNEDV ILCVL PLFHI YSLNS241 VLLCG LRAKA AILLM PKFEI NALLG LIQKH RVTIA PIVPP281 IVLAI AKSPD LEKYD LSSIR VLKSG GASLG KELED TVRAK321 FPKAK LGQGY GMTEA GPVLT MCLAF AKEPI DVKPG ACGTV361 VRNAE MKIVD PETGN SLPRN QS D QIMKG YLNDQ401 EATQR TIDKE GWLHT GDIGY IDDDD ELFIV DRLKE LIKYK441 GFQVA PAELE ALLLS HPKIT DAAVV MKDEA AGEVP VAFVV481 RSNGH TDTTE DEIKQ FISKQ VVFYK RISRV FFIDA IPKSP521 SGKIL RKDLR AKLAA GVPN紫穗槐(Amorpha fruticosa)4-香豆酸輔酶A連接酶基因4CL全長(zhǎng)1911bp，28-1650為編碼區(qū)，共編碼540個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明紫穗槐4CL全長(zhǎng)cDNA編碼的4-香豆酸CoA連接酶，含有預(yù)計(jì)的AMP-binding位點(diǎn)PYSSG TTG LPKG，催化活性反應(yīng)區(qū)GEICIRG和保守的Cys殘基，是典型的4CL蛋白。
本發(fā)明的效果和益處在于4CL是首次被提取、測(cè)序和克隆的紫穗槐(Amorpha fruticosa)4-香豆酸輔酶A連接酶基因。因其所編碼的4-香豆酸輔酶A連接酶參與植物木質(zhì)素合成代謝過(guò)程，所以該基因的克隆可用于構(gòu)建表達(dá)4-香豆酸輔酶A連接酶的基因工程菌，用于植物的基因轉(zhuǎn)化，達(dá)到改善植物品質(zhì)的目的。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明給予進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例14CL cDNA全長(zhǎng)目的片段的克隆和測(cè)序取春季萌發(fā)的紫穗槐枝條，剝?nèi)ネ馄?，用清潔刀片刮取次生分生組織，液氮研磨成粉，加入TRIzol試劑，提取RNA。按照BcabESTTMRNA PCR KitVer.1.1(TAKALA)方法，以O(shè)ligo dT為引物，以提取的總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。根據(jù)GenBank上編碼4CL蛋白保守區(qū)序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物4CLF1和4CLR1(表1)，以上述合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。用TaKaRa Ex TaqTM試劑盒，調(diào)制反應(yīng)液，PCR反應(yīng)物組成如下(50μl體系)5μl dNTP，5μl ExTag buffer，0.25μl(5U/μl)ExTag，RT反應(yīng)產(chǎn)物1μl，引物4CLF1和4CLR1各1μl。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，然后98℃10s，55℃30s，72℃55s，共30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)72℃繼續(xù)延伸7min。將PCR產(chǎn)物回收片段4CL1克隆，測(cè)序并分析。
根據(jù)已獲得的紫穗槐4CL1 cDNA部分序列，設(shè)計(jì)一條5′末端磷酸化的反轉(zhuǎn)錄引物ART1。在反轉(zhuǎn)錄引物內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)兩對(duì)反向嵌套PCR引物AF1\AR1和AF2\AR2，擴(kuò)增包括5′末端的cDNA片段。引物序列如下4CLF1 AAGGAATTNATNAAATACAAN4CLR1 AANACNACNAGTTTNGAGATAAART1 (P)-CCACCTGTTTGGAGAF1 ACACAGACACAACCGAGGATAR1 GCTGCTTCATCCTTCATTGGAF2 CATCCCAAGATCACCGATGCTAR2 CGAGTTCAGCAGGAGCCACAF3 TCACAAACACAAAATACCATAFATGGCATTTGAGACAGAAGAAARTCAATTTGGAACACCTGCTGC反應(yīng)按照5′-Full RACE Core Set(TAKARA)的方法進(jìn)行。
PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min，94℃1min，55℃30s，72℃60s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)72℃繼續(xù)延伸7分鐘。將PCR產(chǎn)物回收測(cè)序。
按照3′-FULL RACE Core Set(TAKARA)方法，用OligodT-3sitesAdaptor引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。再用OligodT-3sites Adaptor引物和AF1引物擴(kuò)增含3′末端的cDNA片段4CL3。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min，94℃1min，55℃30s，72℃60s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)72℃繼續(xù)延伸7分鐘。將PCR產(chǎn)物回收測(cè)序。
依據(jù)5′RACE和3′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異引物AF3，按照BcaBESTTMRNA PCR Kit Ver.1.1(TAKALA)方法，以O(shè)ligo dT為下游引物，擴(kuò)增4CL全長(zhǎng)cDNA并測(cè)序，得到紫穗槐(Amorpha fruticosa)4-香豆酸輔酶A連接酶基因4CL。
實(shí)施例24CL與克隆載體pUC19的重組4CL和克隆載體pUC19分別用EcoRI/SphI雙酶切。酶切條件如下Eppendorf AddH2O11μl1×H 2μlPCR片段(1μg/μl)5μlEcoRI1μlSphI 1μlEppendorf BddH2O15μl1×H 2μl質(zhì)粒(1μg/μl)1μlEcoRI 1μlSphI 1μl37℃酶切3小時(shí)，電泳后分別回收兩個(gè)目的片段，用T4DNA連接酶連接。連接條件如下ddH2O 6μlPCR片段(0.1μg/μl) 1μl質(zhì)粒(0.05μg/μl) 1μl10×T4DNA連接酶Buffer 1μlT4DNA連接酶(1U/μl) 1μl16℃連接1小時(shí)，電泳檢測(cè)連接產(chǎn)物，回收其中約3.5kb片段為含有4CL的克隆載體pUC19/4CL，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
實(shí)施例3克隆載體pUC19/4CL轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109加入60μl解凍的感受態(tài)E.coli JM109和10μl連接液至Eppendorf中，冰上30秒，42℃50秒，冰上2分鐘，加入37℃的LB培養(yǎng)基930μl，37℃震蕩培養(yǎng)1小時(shí)。菌液與4μl IPTG及40μl X-gal混合后涂含有50mg/Ap的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑選白色菌落做PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)1.5kb特異帶者為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌落，為含有pUC19/4CL的大腸桿菌JM109/pUC19/4CL。從JM109/pUC19/4CL中提取質(zhì)粒，以pUC19的測(cè)序通用引物測(cè)定外源插入序列4CL的核苷酸序列，與實(shí)施例1中所述PCR測(cè)序結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.一種4-香豆酸輔酶A連接酶基因4CL，其特征在于它是紫穗槐(Amorphafruticosa)編碼4-香豆酸輔酶A連接酶(4-CoumarateCoA ligases)的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述4-香豆酸輔酶A連接酶基因4CL的核苷酸序列SEQ IDNo.1，具體序列如下1 tcacaaacac aaaataccat tcccgcaatg gcatttgaga cagaagaacc aaaggaattc61 atcttcaggt caaaattacc agaaatccca atctccaaac accttcccct tcactcttac121 tgctttgaga acctctcaga attcgggtca cgtccatgct tgatcagtgc cccaacaggg181 gacgtgtaca cctactatga cgtggaactc accgctagaa gagttgcctc tggactcaac241 aaattgggtg tccaacaagg tgatgtcatc atgctccttc ttcctaattc accagaattt301 gtgttctcct tcttgggtgc ctcttaccgt ggtgccatga tcactgctgc caacccattc361 ttcacatccg ctgagattgc aaaacaggcc aaagcctcca acaccaagtt gcttataaca421 caagcttctt actacgacaa ggttaaggat ttggatgtga agttggtgtt cgtggactct481 ccccctgatg ggcacatgca ctattcagag ctgcgtgagg ctgatgagag tgacatgcct541 gaggtgaaga ccaaccctga tgatgtggtg gcacttccct attcgtcagg gacaacaggg601 ttgcccaaag gggtgatgtt atctcacaaa gggttggcga ccagcatagc acaacaagtt661 gatggggaaa accccaacct ctactttcac aatgaggatg tcatattgtg tgtgcttcca721 ctctttcata tatattctct caattctgtt ctgttgtgtg ggttgagagc caaggctgct781 attttgctga tgccaaagtt tgagatcaat gccttgttgg gtctcattca gaaacaccga841 gtaacaattg cccctattgt cccacccatt gttttggcca ttgccaagtc accggatctt901 gaaaagtatg atctctcttc cattagggtg ttgaaatctg gaggggcttc tctgggcaaa961 gaactcgaag acactgtgag ggctaaattc cccaaggcca aacttggaca gggatacgga1021 atgactgagg cagggccagt gctaacaatg tgcttagcat ttgctaagga accgatagat1081 gtaaaaccag gtgcatgtgg aaccgttgta agaaatgcag agatgaagat tgtggatcct1141 gaaactggta attcgttgcc acgaaaccag tccggtgaaa tttgcataag aggcgaccag1201 atcatgaaag gttatctaaa tgatcaagag gctacgcaga gaaccataga caaagaaggg1261 tggttgcata caggtgacat cggctacatc gacgatgacg atgagttatt catcgttgac1321 aggcttaagg aattgatcaa atacaaagga tttcaggtgg ctcctgctga actcgaagcc1381 cttcttctct ctcatcccaa gatcaccgat gctgctgtgg ttccaatgaa ggatgaagca1441 gctggagagg tacctgttgc atttgtggtg agatcaaatg gtcacacaga cacaaccgag1501 gatgaaatta agcagtttat ctccaaacag gtggtgtttt ataaaagaat aagcagagta1561 ttcttcattg atgcaattcc caagtcaccg tcaggtaaaa tcttacgaaa ggatctaaga1621 gcaaagcttg cagcaggtgt tccaaattga aaattctaat tccaagatat atgatattac1681 cattatcata cgatgcccgc acaaagctcc ataaaccttg aaggccagag tgcggacgcg1741 tgcttggagc ttgaccgcat tacttatatt cacacgaggg cagacatgat taccttaaaa1801 gggggggttg ctaattatat tttaaaacta tattgggtaa aatttgattc gatcaaggac1861 tttcatatta tataatatcg aagtataatt tttcaaaaaa aaaaaaaaaa a
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述含有4-香豆酸輔酶A連接酶基因4CL的核苷酸序列的重組載體pUC19/4CL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述含有4-香豆酸輔酶A連接酶基因4CL的核苷酸序列的重組載體的宿主細(xì)胞JM109/pUC19/4CL。
全文摘要
本發(fā)明是一種4－香豆酸輔酶A連接酶基因及其克隆，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種來(lái)自于紫穗槐(Amorpha fruticosa)編碼4－香豆酸輔酶A連接酶的基因4CL，提供了4CL序列及其相應(yīng)的氨基酸序列。提供了含有4CL的克隆載體pUC 19/4CL和含有這種載體的E.coli細(xì)胞JM109/pUC19/4CL。本發(fā)明可用于構(gòu)建4－香豆酸輔酶A連接酶基因工程菌，用于植物的基因轉(zhuǎn)化，達(dá)到改善植物品質(zhì)的目的。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1390940SQ0213263
公開(kāi)日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2002年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月19日
發(fā)明者安利佳, 劉文哲, 蘇喬, 高曉蓉, 楊君 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)