本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及氮營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸基因osnpf7.1在提高水稻分蘗和穗數(shù)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氮營(yíng)養(yǎng)與水稻分蘗發(fā)育密切相關(guān)，這是因?yàn)榉痔Y芽生長(zhǎng)前期需要提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。有報(bào)道指出，當(dāng)莖鞘含氮量低于1.3%，葉片含氮量小于2%時(shí)，分蘗芽的分化發(fā)育就會(huì)停止，而莖鞘含氮水平在2.7%-3.3%，葉片含氮5%時(shí)，水稻分蘗就能正常發(fā)生（蔣彭炎，洪曉富，馮來(lái)定，等.水培條件下氮濃度對(duì)水稻氮素吸收和分蘗發(fā)生的影響研究.作物學(xué)報(bào)，1997，23：191-199.）。水稻谷氨酰胺合成酶gs1能夠?qū)@根同化成谷氨酰胺（sukanyar,lim,snustaddp.root-andshoot-specificresponsesofindividualglutaminesynthetasegenesofmaizetonitrateandammonium.plantmolecularbiology,1994,26(6):1935-1946.），其中osgs1;2在水稻銨根同化中起主要作用（funayamak,kojimas,tabuchi-kobayashim,etal.cytosolicglutaminesynthetase1;2isresponsiblefortheprimaryassimilationofammoniuminriceroots.plantandcellphysiology,2013:pct046.）。同時(shí)，水稻osgs1;2對(duì)分蘗側(cè)芽的伸長(zhǎng)非常重要，osgs1;2的缺失導(dǎo)致水稻分蘗芽嚴(yán)重減少，并且導(dǎo)致木質(zhì)素積累（ohashim,ishiyamak,kusanom,etal.lackofcytosolicglutaminesynthetase1;2invasculartissuesofaxillarybudscausesseverereductionintheiroutgrowthanddisorderofmetabolicbalanceinriceseedlings.theplantjournal,2015,81:347-356.）。

氮運(yùn)輸npf家族成員在生長(zhǎng)發(fā)育上起重要作用（rentschd,schmidts,tegederm.transportersforuptakeandallocationoforganicnitrogencompoundsinplants.febsletters,2007,581:2281-2289.）。水稻npf家族成員sp1對(duì)水稻穗長(zhǎng)和結(jié)實(shí)控制起重要作用（lis,qianq,fuz,etal.shortpanicle1encodesaputativeptrfamilytransporteranddeterminesricepaniclesize.theplantjournal,2009,58(4):592-605.）。osnpf2.2介導(dǎo)了木質(zhì)部硝酸根的卸載，影響水稻生長(zhǎng)和種子灌漿結(jié)實(shí)（liy,ouyangj,wangyy,etal.disruptionofthericenitratetransporterosnpf2.2hindersroot-to-shootnitratetransportandvasculardevelopment.scientificreports,2015,5:9635.）。osnpf7.2對(duì)硝酸根有低親和運(yùn)輸，能夠影響植株生長(zhǎng)（hur,qiud,cheny,etal.knock-downofatonoplastlocalizedlow-affinitynitratetransporterosnpf7.2affectsricegrowthunderhighnitratesupply.frontiersinplantscience,2016,7.）。超表達(dá)高親和硝酸根運(yùn)輸基因osnrt2.3b能促進(jìn)水稻生長(zhǎng)，提高氮利用效率，增加產(chǎn)量（fanx,tangz,tany,etal.overexpressionofaph-sensitivenitratetransporterinriceincreasescropyields.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2016,113(26):7118-7123.）。

水稻npf家族有80多個(gè)成員，挖掘出氮高效運(yùn)輸基因，特別是控制水稻株型的關(guān)鍵基因，將有利于水稻高產(chǎn)品種的培育。雖然已了解氮肥可以影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，但是氮肥是如何影響植株生長(zhǎng)發(fā)育的，目前還未知。特別是，氮素是如何被npf家族中某些關(guān)鍵基因運(yùn)輸，又是如何引起植株生長(zhǎng)發(fā)育變化的，目前也沒(méi)有什么相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明通過(guò)長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，npf家族中osnpf7.1基因?qū)λ痉痔Y和有效穗等有重要的控制作用，可應(yīng)用于植物株型改良從而使水稻增產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供水稻npf基因家族成員osnpf7.1基因在提高水稻分蘗和穗數(shù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明以水稻的npf基因家族成員osnpf7.1基因?yàn)閷?duì)象，從水稻中花11中克隆了osnpf7.1的cdna序列。通過(guò)構(gòu)建osnpf7.1基因超表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌eha105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11中，得到osnpf7.1基因超表達(dá)植株，其分蘗數(shù)和穗數(shù)與對(duì)照野生型中花11相比顯著提高。通過(guò)rnai技術(shù)構(gòu)建osnpf7.1基因干擾表達(dá)載體，將干擾表達(dá)載體導(dǎo)入中花11中，得到osnpf7.1基因表達(dá)量下降的干擾植株，干擾植株的分蘗數(shù)和穗數(shù)與中花11相比顯著降低。這些結(jié)果表明，通過(guò)提高osnpf7.1基因的表達(dá)，可以使正常的水稻分蘗數(shù)、穗數(shù)增加，從而提高水稻產(chǎn)量。

基于本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的osnpf7.1基因的功能，osnpf7.1基因可用于水稻選育中。所述的水稻選育為提高水稻分蘗數(shù)、穗數(shù)，從而提高水稻產(chǎn)量。具體可通過(guò)提高osnpf7.1基因的表達(dá)使水稻分蘗數(shù)和每株穗數(shù)增加，達(dá)到提高水稻產(chǎn)量的目的。

osnpf7.1基因也可用于提高其他植物的產(chǎn)量，如通過(guò)轉(zhuǎn)基因使osnpf7.1基因在植物中（超量）表達(dá)，來(lái)提高植物的分枝數(shù)量，進(jìn)而使植物的產(chǎn)量得到提高。所述的植物是指單子葉植物或雙子葉植物；如：小麥、番茄、草坪草或苜蓿等。

所述的osnpf7.1基因編碼的osnpf7.1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述的osnpf7.1基因的cdna序列優(yōu)選如seqidno.2所示。

應(yīng)該理解為，在不影響osnpf7.1蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)seqidno.1所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。因此，osnpf7.1蛋白還包括seqidno.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得的具有同等活性的蛋白質(zhì)。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：

（1）本發(fā)明克隆的osnpf7.1基因超表達(dá)后使水稻分蘗能力增強(qiáng)，說(shuō)明osnpf7.1基因?qū)μ岣咚井a(chǎn)量有明顯影響，因此，通過(guò)基因工程技術(shù)提高osnpf7.1基因的表達(dá)能夠提高植物產(chǎn)量。這不僅有助于通過(guò)正常施氮條件下培育高產(chǎn)水稻，還可以通過(guò)分子育種進(jìn)行植物的品種改良。

（2）osnpf7.1基因的成功克隆，進(jìn)一步證實(shí)了npf家族在氮吸收過(guò)程中的重要作用，對(duì)闡明npf家族的生物學(xué)功能有重要的意義，另外對(duì)進(jìn)一步了解植物氮代謝途徑，提高氮吸收效率有極大的推動(dòng)作用。

（3）盡管目前已克隆到了一些提高植物產(chǎn)量的基因，但對(duì)植物增產(chǎn)的分子機(jī)制仍不清楚。而本發(fā)明克隆的osnpf7.1基因能夠提高水稻的產(chǎn)量，對(duì)確定植物增產(chǎn)的關(guān)鍵因素有極大的推動(dòng)作用。

附圖說(shuō)明

圖1是對(duì)照中花11、osnpf7.1基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和osnpf7.1基因干擾植株2個(gè)株系的整株表型圖。

圖2是對(duì)照中花11、osnpf7.1基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和osnpf7.1基因干擾植株2個(gè)株系分蘗數(shù)的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進(jìn)行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別星號(hào)（*）表示與對(duì)照具有顯著差異。

圖3是對(duì)照中花11、osnpf7.1基因超表達(dá)植株2個(gè)株系的單株有效穗表型圖。

圖4是對(duì)照中花11、osnpf7.1基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和osnpf7.1基因干擾植株2個(gè)株系有效穗數(shù)的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進(jìn)行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別星號(hào)（*）表示與對(duì)照具有顯著差異。

圖5是對(duì)照中花11、osnpf7.1基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和osnpf7.1基因干擾植株2個(gè)株系中osnpf7.1基因相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進(jìn)行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別星號(hào)（*）表示與對(duì)照具有顯著差異。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。若未特別指明，下述實(shí)施例所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；所用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，并可按照已描述的重組技術(shù)（參見(jiàn)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約）完成；所用的材料、試劑等，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1osnpf7.1基因超表達(dá)植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的rna，并將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用引物對(duì)：

f1：5'-ggtaccatggcgtttcttttttttttttgtggcacagttcct-3'（kpni），

r1：5'-ggatccgacttggatgacagccttcttcaa-3'（bamhi）；

通過(guò)pcr擴(kuò)增osnpf7.1基因的cdna后，通過(guò)kpni、bamhi酶切后連入pcambia-1306載體（pcambia-1306載體購(gòu)自cambia公司），構(gòu)建出osnpf7.1基因的超表達(dá)載體osnpf7.1-p1306。采用農(nóng)桿菌eha105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常水稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長(zhǎng)高約10cm時(shí)，種于大田中，待苗長(zhǎng)大后，提取基因組dna通過(guò)pcr對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)引物對(duì)為：

f2：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r2：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若擴(kuò)增出517bp的片段，則說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株為陽(yáng)性植株。陽(yáng)性植株單株收種并種植，直至t2代鑒定出純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到osnpf7.1基因超表達(dá)植株。osnpf7.1基因超表達(dá)植株的分蘗數(shù)和有效穗數(shù)遠(yuǎn)多于對(duì)照中花11植株，差異顯著，如圖1、2、3、4中所示。

取osnpf7.1基因超表達(dá)植株葉片，提取rna并將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)osnpf7.1基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示（圖5）超表達(dá)植株osnpf7.1基因的表達(dá)量與對(duì)照中花11相比顯著升高。實(shí)時(shí)熒光定量pcr所用引物對(duì)為：

f3：5'-ttgtggcacagttcctcagcaaga-3'，

r3：5'-gttgcgcgactatggggatgcctc-3'。

實(shí)施例2osnpf7.1基因干擾植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的rna，并將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用引物對(duì)：

f4：5'-ggtacccacagttcctcagcaagacaagcg-3'（kpni），

r4：5'-ggatccggtctcccctcccctgtggcggct-3'（bamhi）；

f5：5'-actagtcacagttcctcagcaagacaagcg-3'（spei），

r5：5'-gagctcggtctcccctcccctgtggcggct-3'（saci）；

各自pcr擴(kuò)增出osnpf7.1基因的cdna片段后，通過(guò)相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶酶切后連入ptck303載體，構(gòu)建出osnpf7.1基因的干擾表達(dá)載體osnpf7.1-ptck303。采用農(nóng)桿菌eha105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將干擾表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長(zhǎng)高約10cm時(shí)，種于大田中，待苗長(zhǎng)大后，提取基因組dna通過(guò)pcr對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)引物對(duì)為：

f2：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r2：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若擴(kuò)增出517bp的片段，則說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株為陽(yáng)性植株。陽(yáng)性植株單株收種并種植，直至t2代鑒定出純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到osnpf7.1基因干擾植株。osnpf7.1基因干擾植株的分蘗數(shù)和有效穗數(shù)遠(yuǎn)少于對(duì)照中花11植株，差異顯著，如圖1、2、3中所示。

取osnpf7.1基因干擾植株葉片，提取rna并將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)osnpf7.1基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示（圖5）干擾植株osnpf7.1基因的表達(dá)量與對(duì)照中花11相比顯著降低。實(shí)時(shí)熒光定量pcr所用引物同實(shí)施例1。

上述結(jié)果表明，通過(guò)提高osnpf7.1基因的表達(dá)，可以增加水稻的分蘗數(shù)、穗數(shù)，進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>武漢生物工程學(xué)院

<120>氮營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸基因osnpf7.1在提高水稻分蘗和穗數(shù)中的應(yīng)用

<130>1

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>678

<212>prt

<213>oryzasativa

<400>1

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151015

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