本發(fā)明涉及一種利用基因槍法介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化毛竹的方法，屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

竹類是禾本科(gramimineae)竹亞科(bambusoideae)多年生常綠植物。全世界竹類資源約70多屬，1250種，我國竹類資源共有39屬，500多種，竹林面積、蓄積量等均居世界第一位，主要分布在北緯40°以南地區(qū)，既是重要森林資源之一，同時也是重要的可再生資源。對于竹纖維品質(zhì)的提高主要有兩種方法：一是常規(guī)育種方式，但因竹開花具有不確定性，且開花后即死亡等特點，受到的限制巨大；二是通過基因工程手段在分子水平上對其進行改良。然而目前為止，竹纖維的優(yōu)越性主要通過一些理化分析得到驗證，卻未在分子水平上進行深入研究。

目前，竹類基因克隆及其遺傳改良方面的研究尚處起步和探索階段。在基因克隆方面，盡管相繼在慈竹、綠竹、毛竹上克隆了調(diào)控竹木質(zhì)素相關(guān)合成酶基因，但未見在竹中成功進行遺傳轉(zhuǎn)化的研究報道。

毛竹(phyllostachyspubescens)作為我國南方一種重要的森林資源，具有較高的社會、經(jīng)濟和生態(tài)效益，在竹產(chǎn)業(yè)中具有重要地位。毛竹(phyllostachyspubescens)是單軸散生型竹類植物。毛竹種子基因型差異大，不同基因型的毛竹種胚愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織質(zhì)量差異也較大，重復(fù)性不好，目前僅有少量有關(guān)毛竹愈傷組織誘導(dǎo)和再生的報道；而且在篩選培養(yǎng)的過程中常用農(nóng)桿菌抑菌劑如羧卞青霉素和頭孢青霉素等，對毛竹愈傷組織的傷害較大，目前尚無成功遺傳轉(zhuǎn)化毛竹的例子被報道。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法主要應(yīng)用于雙子葉植物，而在單子葉植物應(yīng)用上受到諸多限制，主要的問題是農(nóng)桿菌主要侵染雙子葉植物和極少數(shù)單子葉植物，對大部分單子葉植物特別是禾本科植物不敏感，而世界上大部分最重要的糧食、經(jīng)濟作物均為禾本科單子葉植物，從而限制了它的適用范圍。此外，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化能否取得成功對基因型的依賴性也比較強，即使是雙子葉植物也有不少品種受基因型的限制而難以被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種竹子的遺傳轉(zhuǎn)化的方法。

本發(fā)明提供的竹子的遺傳轉(zhuǎn)化的方法包括如下步驟：

(1)將竹子種子的胚在預(yù)培養(yǎng)基中進行預(yù)培養(yǎng)，得到預(yù)培養(yǎng)后的成熟胚；

(2)利用基因槍法將目的基因轉(zhuǎn)化所述預(yù)培養(yǎng)后的成熟胚，培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因竹子。

上述方法中，所述基因槍法的轟擊參數(shù)如下：金粉量：80-240ug；轟擊距離：6-12cm；轟擊壓力：1100-1550psi；真空度：27。

上述方法中，所述基因槍法的轟擊參數(shù)如下：金粉量：160ug；轟擊距離：6cm；轟擊壓力：1350psi；真空度：27。

上述方法中，所述預(yù)培養(yǎng)基是將ms大量元素溶液、b5有機元素溶液、b5微量元素溶液、ms鐵鹽溶液、2,4-d、kt、iba、蔗糖和凝固劑混勻得到的培養(yǎng)基。

上述方法中，所述ms大量元素溶液包括kno3、nh4no3、cacl2、mgso4·7h2o和kh2po4。

上述方法中，所述b5有機元素溶液包括肌醇、煙酸、煙酸硫銨和鹽酸吡哆醇。

上述方法中，所述b5微量元素溶液包括ki、h3bo3、mnso4·4h2o、znso4·7h2o、na2moo4·2h2o和cocl2·6h2o。

上述方法中，所述ms鐵鹽溶液包括feso4·7h20和na2edta。

上述方法中，

所述2,4-d在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為2mg/l；

所述kt在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.2mg/l；

所述iba在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.4mg/l；

所述kno3在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為1.9g/l；

所述nh4no3在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為1.65g/l；

所述cacl2在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.33224g/l；

所述mgso4·7h2o在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.37g/l；

所述kh2po4在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.17g/l；

所述肌醇在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.1g/l；

所述煙酸在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.001g/l；

所述煙酸硫銨在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.01g/l；

所述鹽酸吡哆醇在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.001g/l；

所述ki在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.00075g/l；

所述h3bo3在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.003g/l；

所述mnso4·4h2o在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.01g/l；

所述znso4·7h2o在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.002g/l；

所述na2moo4·2h2o在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.00025g/l；

所述cocl2·6h2o在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.000025g/l；

所述feso4·7h20在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.0279g/l；

所述na2edta·2h2o在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為0.0373g/l；

所述蔗糖所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為30g/l；

所述凝固劑為瓊脂；

所述瓊脂在所述預(yù)培養(yǎng)基中的濃度為8g/l。

上述方法中，所述預(yù)培養(yǎng)基的ph值為5.8。

上述方法中，所述預(yù)培養(yǎng)的時間為5天。

上述方法中，所述預(yù)培養(yǎng)的條件為25℃，黑暗。

上述方法中，所述步驟(1)和步驟(2)還包括高滲培養(yǎng)的步驟。

上述方法中，所述高滲培養(yǎng)的培養(yǎng)基為將甘露醇、山梨醇和所述預(yù)培養(yǎng)基混勻得到的培養(yǎng)基。

上述方法中，

所述甘露醇在所述高滲培養(yǎng)基中的濃度為0.2mol/l；

所述山梨醇在所述高滲培養(yǎng)基中的濃度為0.2mol/l。

上述方法中，

所述目的基因為gus基因；

所述gus基因是通過植物雙元載體pcambia1303-n轉(zhuǎn)化所述預(yù)培養(yǎng)后的成熟胚。

上述方法中，所述竹子種子的胚為竹子種子的成熟胚。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述預(yù)培養(yǎng)基。

本發(fā)明還有一個目的是提供上述高滲培養(yǎng)基。

本發(fā)明的最后一個目的是提供上述預(yù)培養(yǎng)基和/或上述高滲培養(yǎng)基的新用途。

本發(fā)明提供了上述預(yù)培養(yǎng)基和/或上述高滲培養(yǎng)基在竹子的遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

上述方法或上述應(yīng)用中，所述竹子為毛竹。

本發(fā)明的有益效果：目前，基因槍法廣泛應(yīng)用于玉米、水稻、小麥等多種植物的基因轉(zhuǎn)化，特別是對多倍體小麥的的轉(zhuǎn)化尤為突出。因竹屬于禾本科單子葉植物，同樣也是多倍體，故本發(fā)明選擇基因槍法對竹進行遺傳轉(zhuǎn)化。與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比，本發(fā)明的基因槍法它不受宿主、靶受體類型及組織類型限制，可進行多基因及大片段的轉(zhuǎn)化，可控度高，操作簡便、快速。

本發(fā)明選用毛竹成熟胚為材料，利用基因槍轟擊法探索竹的高效遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，提供了一種利用基因槍法介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化毛竹的方法。該方法可以解決毛竹難于進行遺傳轉(zhuǎn)化的問題，縮短獲得轉(zhuǎn)基因植物的周期，大大提高了獲得轉(zhuǎn)基因毛竹的幾率。本發(fā)明的方法不僅可作為其他工業(yè)用竹如慈竹、梁山慈竹等基因槍法介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的參考，也為實施并突破工業(yè)用竹中基因定向改良育種研究、通過基因槍法創(chuàng)制優(yōu)良種質(zhì)新資源及探索工業(yè)用竹遺傳改良的新途徑奠定了基礎(chǔ)。在工業(yè)用竹遺傳改良和竹功能基因組學(xué)研究等方面具有重要的作用及廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為不同基因槍參數(shù)組合轟擊預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)成熟胚的瞬時轉(zhuǎn)化效率。

圖2為不同基因槍參數(shù)組合轟擊預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)成熟胚的篩選成活率。

圖3為不同基因槍參數(shù)組合轟擊預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)成熟胚的陽性率。

圖4為基因槍轟擊毛竹成熟胚轉(zhuǎn)化再生過程。a：毛竹種子；b：預(yù)培養(yǎng)3d毛竹成熟胚；c：預(yù)培養(yǎng)5d毛竹成熟胚；d：預(yù)培養(yǎng)7d毛竹成熟胚；e：預(yù)培養(yǎng)7d毛竹成熟胚高滲培養(yǎng)；f：轟擊后毛竹成熟胚gus染色；g：轉(zhuǎn)化苗抗性篩選；h：轉(zhuǎn)化苗移栽；i：轉(zhuǎn)基因毛竹成苗；j：轉(zhuǎn)化苗分子鑒定；其中，1泳道為2000bpdnamaker，2泳道為陽性對照，3泳道為陰性對照，4-15泳道為轉(zhuǎn)化植株；k：陽性轉(zhuǎn)基因毛竹葉片gus染色。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

下述實施例中的毛竹種子的獲取時間為2016年07月，獲取方式屬于購買。直接來源的提供者為譚汝學(xué)(個體經(jīng)營)，所處地區(qū)為云南省昆明市，聯(lián)系方式：云南省昆明市中聯(lián)花園18幢1-103，郵編：650106。原始來源的采集者為譚汝學(xué)，聯(lián)系方式同上，獲取時間為2016年05月，獲取地點為云南省昭通市。

實施例1、一種基因槍法介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化毛竹的方法

一、實驗材料的制備

1、pcambia1303-n載體質(zhì)粒的制備

將植物雙元載體pcambia1303-n(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，mcv035-n)記作目標載體，該載體攜帶有g(shù)us報告基因、卡那霉素和潮霉素抗性基因。

通過熱激法將目標載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5a。挑取大腸桿菌單菌落，在含有100mg/l卡那霉素的lb培養(yǎng)液中，37℃，150rpm，過夜培養(yǎng)。經(jīng)菌液pcr驗證后使用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有目標載體的質(zhì)粒，并濃縮或稀釋至所需濃度，備用。

2、毛竹種子的消毒處理

在25℃條件下用水浸泡毛竹種子(圖4a)24h，然后在超凈工作臺上，用70％乙醇浸泡30s，無菌水沖洗3次，再用5％-6％的次氯酸鈉溶液浸泡10min(期間每隔2-3min進行振蕩)，無菌水沖洗5次，最后用0.1％的升汞溶液浸泡10min，無菌水沖洗5次，得到消毒后的毛竹種子。

二、基因槍法介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化毛竹

1、毛竹種子的預(yù)培養(yǎng)

將消毒后的毛竹種子置于帶紙平皿上，使用胚鉤取出毛竹成熟胚，置于mb6培養(yǎng)基上在25℃，黑暗條件下進行預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)的天數(shù)分別為3天、5天和7天，分別得到預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)的毛竹成熟胚(預(yù)培養(yǎng)3天后的毛竹成熟胚、預(yù)培養(yǎng)5天后的毛竹成熟胚、預(yù)培養(yǎng)7天后的毛竹成熟胚)。預(yù)培養(yǎng)3天后的毛竹成熟胚、預(yù)培養(yǎng)5天后的毛竹成熟胚和預(yù)培養(yǎng)7天后的毛竹成熟胚的形態(tài)分別如圖4b、4c、4d所示。

上述預(yù)培養(yǎng)基(mb6)的配方如下:ms大量元素溶液+b5有機元素溶液+b5微量元素溶液+ms鐵鹽溶液+2,4-d2mg/l+kt0.2mg/l+iba0.4mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，ph5.8。

上述ms大量元素溶液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其在預(yù)培養(yǎng)基中的終濃度如下：kno31.9g/l、nh4no31.65g/l、cacl20.33224g/l、mgso4·7h2o0.37g/l、kh2po40.17g/l；

上述b5有機元素溶液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其在預(yù)培養(yǎng)基中的終濃度如下：肌醇0.1g/l、煙酸0.001g/l、煙酸硫銨0.01g/l、鹽酸吡哆醇0.001g/l；

上述b5微量元素溶液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其在預(yù)培養(yǎng)基中的終濃度如下：ki0.00075g/l、h3bo30.003g/l、mnso4·4h2o0.01g/l、znso4·7h2o0.002g/l、na2moo4·2h2o0.00025g/l、cocl2·6h2o0.000025g/l；

上述ms鐵鹽溶液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其在預(yù)培養(yǎng)基中的終濃度如下：feso4·7h200.0279g/l，na2edta·2h2o0.0373g/l。

2、毛竹成熟胚的高滲培養(yǎng)

分別將預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)的毛竹成熟胚置于高滲培養(yǎng)基平皿中心(直徑3cm范圍)上高滲暗培養(yǎng)4h，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗，分別得到高滲培養(yǎng)后的毛竹成熟胚。其中，預(yù)培養(yǎng)7天后的毛竹成熟胚在高滲培養(yǎng)后的形態(tài)如圖4e所示。

上述高滲培養(yǎng)基的配方為：mb6培養(yǎng)基+甘露醇0.2mol/l+山梨醇0.2mol/l，ph5.8。

3、毛竹成熟胚的基因槍轟擊

超凈工作臺上，使用基因槍分別對步驟2獲得的高滲培養(yǎng)后的毛竹成熟胚進行轟擊。選擇不同的基因槍參數(shù)(金粉用量、轟擊距離、轟擊壓力)進行基因槍轟擊(真空度：27)，篩選最佳的轟擊條件?；驑寘?shù)的正交設(shè)計表見表1。pds-1000/he型基因槍的具體實驗步驟如下：

(1)微彈制備(金粉母液配制)

1)稱取80mg金粉加入eppendorf管。

2)加入1ml75％乙醇，充分渦旋，靜置15min，1500rpm離心5min。

3)棄上清，加入1ml無菌水，充分渦旋，1500rpm離心5min。重復(fù)3次。

4)棄上清，加入1ml無菌的50％甘油，充分渦旋，-20℃保存。

(2)dna的包裹及基因槍轟擊操作

1)取50μl金粉懸液(指金粉母液)于eppendorf管。

2)依次加入5μl質(zhì)粒dna(1μg/μl)，50μl2.5mcacl2和20μl0.1m亞精胺。(邊渦旋邊加入，每加完一樣，可振蕩2-3秒)。

3)將上述混好的樣品，渦旋1min，冰上靜置1min，重復(fù)10次。

4)冰上靜置30min。10000rpm離心10sec，去上清。

5)用250μl無水乙醇沖洗沉淀2次(10000rpm離心10sec，去上清)。

6)最后用60μl無水乙醇重懸顆粒。

7)在超凈臺上，75％酒精棉擦洗轟擊室，75％乙醇消毒各配件15min，然后晾干。

8)取10μldna包被的金顆粒點于顆粒子彈載體膜中心(一滴一滴滴加，待第一滴干燥后，滴加第二滴，防止金粉顆粒擴散太大)。

9)打開真空泵和基因槍的電源開關(guān)。

10)打開氦氣瓶閥門，旋轉(zhuǎn)氦氣調(diào)節(jié)桿，使氣壓高于所選可裂膜壓為1500psi左右。

11)旋下可裂膜擋蓋，將可裂膜放在擋蓋中央(要放正，防止漏氣)，將擋蓋旋上，用專用扳手加固。

12)把微粒發(fā)射裝置移出轟擊室，旋下蓋子，加入阻擋網(wǎng)，把微粒載片安裝在固定槽中(有微粒的一面朝下)，旋上蓋子，將微粒發(fā)射裝置放回轟擊室。

13)將樣品盤放置在轟擊室的適當位置，關(guān)上轟擊室門。

14)將樣品盤放置在轟擊室的適當位置，關(guān)上轟擊室門。

15)取出微粒發(fā)射裝置，卸下微粒載膜和阻擋網(wǎng)(阻擋網(wǎng)和微粒載片固定槽放入70％的酒精中浸泡)。

16)旋下可裂膜擋蓋，清除可裂膜碎片。

17)若pds-1000/he不再使用時，關(guān)掉氦氣瓶的主閥，按住fire開關(guān)，放掉氣體加速管內(nèi)的氦氣壓力，最后關(guān)掉一切電源。

表1基因槍參數(shù)正交試驗表

基因槍轟擊后，超凈工作臺上，將基因槍轟擊后的毛竹成熟胚繼續(xù)在25℃，黑暗條件下進行高滲暗培養(yǎng)16h。

4、恢復(fù)培養(yǎng)

高滲暗培養(yǎng)后，超凈工作臺上，將毛竹成熟胚轉(zhuǎn)至mb6培養(yǎng)基上在25℃，黑暗條件下恢復(fù)暗培養(yǎng)7d，得到轟擊恢復(fù)培養(yǎng)后的毛竹成熟胚。并在第3d取部分轟擊后的毛竹成熟胚置于無菌ep管中，加入大于毛竹成熟胚3倍體積的gus染液(50mm磷酸緩沖液,0.1％tritonx-100,2mm鐵氧化鉀，2mm亞鐵氧化鉀，10mmedta，2mmx-gluc)，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進行暗反應(yīng)，反應(yīng)48-72h后，檢查染色呈藍色的毛竹成熟胚，并計算瞬時轉(zhuǎn)化效率。瞬時轉(zhuǎn)化效率＝呈藍色毛竹胚個數(shù)/染色總個數(shù)。

結(jié)果表明：不同基因槍參數(shù)組合轟擊預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)成熟胚的瞬時轉(zhuǎn)化效率結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著金粉量的加大，瞬時轉(zhuǎn)化效率增大；預(yù)培養(yǎng)5天后的胚是較適合的遺傳轉(zhuǎn)化材料?；驑屴Z擊參數(shù)為如下數(shù)值時：金粉量：160ug；轟擊距離：6cm；轟擊壓力：1350psi(基因槍參數(shù)組合6)，瞬時轉(zhuǎn)化效率最高(圖1)。

5、篩選培養(yǎng)

恢復(fù)培養(yǎng)后，將轟擊恢復(fù)培養(yǎng)后的毛竹成熟胚轉(zhuǎn)至1/2ms篩選培養(yǎng)基(1/2ms培養(yǎng)基+潮霉素5mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，ph5.8)上長芽長根，培養(yǎng)條件為25℃，晝夜時間為14/8h，培養(yǎng)30d，獲得轉(zhuǎn)基因毛竹成苗(圖4i)。并統(tǒng)計不同基因槍參數(shù)組合轟擊預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)的毛竹成熟胚的篩選成活率。篩選成活率＝成苗個數(shù)/總胚數(shù)。

不同基因槍參數(shù)組合轟擊預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)的毛竹成熟胚的篩選成活率如圖2所示。從圖2中可以看出：160ug金粉量轟擊毛竹成熟胚，毛竹篩選成活率最高，240ug金粉量次之，80ug金粉量最低。

6、轉(zhuǎn)基因植株的pcr檢測

采用潮霉素抗性基因特異引物hyg-f(gcagccactggtaacaggat)和hyg-r(actgtcgggcgtacacaaat)對上述獲得的轉(zhuǎn)基因毛竹成苗進行pcr檢測，pcr擴增得到大小為2000bp的轉(zhuǎn)基因毛竹成苗為外源基因成功整合到基因組dna中的陽性轉(zhuǎn)基因毛竹，并統(tǒng)計不同基因槍參數(shù)組合轟擊預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)的毛竹成熟胚的陽性率。經(jīng)多批次重復(fù)pcr，檢測到近100株能擴增出2000bp的目標條帶的陽性轉(zhuǎn)基因毛竹。部分pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4j所示。

不同基因槍參數(shù)組合轟擊預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)的毛竹成熟胚的陽性率如圖3所示，從圖中可以看出：預(yù)培養(yǎng)5天后的毛竹成熟胚的陽性率最高，尤其基因槍參數(shù)組合為金粉量160ug/槍，轟擊距離6cm，轟擊壓力1350psi時，陽性率更高，最高可達10％。

根據(jù)上述瞬時轉(zhuǎn)化效率、篩選成活率和轉(zhuǎn)基因植株陽性率，最終基因槍轟擊參數(shù)的最優(yōu)組合如下：金粉量：160ug；轟擊距離：6cm；轟擊壓力：1350psi。

7、轉(zhuǎn)基因毛竹的gus檢測

洗凈上述步驟6獲得的陽性轉(zhuǎn)基因毛竹的根部培養(yǎng)基，移入營養(yǎng)缽(泥炭土：石英砂：土壤＝2:1:1)中培養(yǎng)，利用人工噴水保持環(huán)境濕度，培養(yǎng)條件為：晝溫度25℃，夜溫度18℃，光照時間14h/d。經(jīng)過馴化煉苗20-30天后，移栽入裝有花園土、直徑為30cm的花盆中(圖4h)。

對陽性轉(zhuǎn)基因毛竹的葉片進行g(shù)us組織化學(xué)分析。具體步驟如下：于組培瓶中取出毛竹部分葉片，加入大于葉片3倍體積的gus染液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進行暗反應(yīng)，反應(yīng)48-72h后，在100％，75％，50％梯度酒精中進行脫色處理，脫色完成后，于倒置顯微鏡下，觀察報告基因gus的表達情況。

通過對陽性轉(zhuǎn)基因毛竹葉片的gus檢測分析，發(fā)現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)基因毛竹葉片上均表達報告基因gus，說明pcambia1303-n載體成功整合到毛竹基因組中并進行了翻譯和表達(如圖4k)。

對比例、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛竹遺傳轉(zhuǎn)化方法

按照文獻“農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)大型叢生竹類的方法”(專利授權(quán)號為zl20101023093.x，專利授權(quán)時間為2012-06-13)中的方法，以毛竹為受體材料采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)增殖、預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)、抗性愈傷組織篩選的步驟，未在篩選培養(yǎng)基上獲得陽性的毛竹愈傷組織和再生苗。因此，文獻“農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)大型叢生竹類的方法”中的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括轉(zhuǎn)化各過程中的專用培養(yǎng)基并不適合毛竹的遺傳轉(zhuǎn)化。