本發(fā)明涉及一種提高液態(tài)發(fā)酵制備低聚肽產(chǎn)量的方法，具體涉及超聲波輔助液態(tài)發(fā)酵制備低聚肽技術(shù)，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

大豆餅粕，是大豆榨取大豆油脂后剩下的副產(chǎn)物。我國(guó)的大豆餅粕資源非常豐富，豆粕年產(chǎn)量可達(dá)5000萬噸以上。豆粕中含有多種氨基酸，種類較平衡，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，目前大約85%的豆粕被用于動(dòng)物飼養(yǎng)。但是由于豆粕中含有胰蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子，不利于動(dòng)物消化吸收，這些問題都限制了豆粕的高值化利用。

目前，研究學(xué)者常用發(fā)酵法來提高豆粕的價(jià)值。該方法通過微生物發(fā)酵原料，利用微生物產(chǎn)生的豐富的酶系進(jìn)行脫苦、脫毒和去抗?fàn)I養(yǎng)因子處理，極大地簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。其中液態(tài)發(fā)酵法周期短，產(chǎn)率高，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，但是成本較高，研究提高發(fā)酵生產(chǎn)效率是目前的研究熱點(diǎn)之一。近年來，采用超聲輔助發(fā)酵法來提高液態(tài)發(fā)酵的次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)效率，取得了顯著成果。目前研究最多的是發(fā)散式超聲處理，陳小林研究結(jié)果表明，在最佳發(fā)散式超聲條件下，發(fā)酵液中的monacolink濃度比對(duì)照提高了96.4％，紅色色素色價(jià)提高了22%（陳小林.紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)monacolink和紅曲色素之研究[d].浙江工業(yè)大學(xué),2007.）。

在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期間，細(xì)胞分泌產(chǎn)生大量的蛋白酶，并酶解豆粕產(chǎn)生大量的多肽和氨基酸，同時(shí)微生物也能將酶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)蛋白。大量研究表明低強(qiáng)度的超聲能刺激此階段的微生物加速生長(zhǎng)。另外在穩(wěn)定生長(zhǎng)期間，細(xì)胞的同化作用趨于平緩，除發(fā)酵液中的蛋白酶外，還有大量蛋白酶殘留在細(xì)胞內(nèi)，沒有得到有效釋放。而聚能式超聲特征在于，大功率的超聲場(chǎng)可直接作用于細(xì)胞，超聲強(qiáng)度大，細(xì)胞破碎率高。因此在發(fā)酵穩(wěn)定期后期，采用高強(qiáng)度的聚能式超聲來破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，能有效釋放胞內(nèi)蛋白酶，使其在酶解豆粕蛋白的同時(shí)也能酶解細(xì)胞蛋白，另外聚能式超聲也有很好的傳質(zhì)效果，可起到加強(qiáng)蛋白酶酶解的作用。所以在細(xì)胞穩(wěn)定期后期采用聚能式超聲能進(jìn)一步促進(jìn)發(fā)酵生產(chǎn)低聚肽的效率，然而目前在微生物的穩(wěn)定生長(zhǎng)期的后期施加聚能式超聲處理促進(jìn)發(fā)酵液多肽生成的研究，還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服已有技術(shù)存在的問題，提供一種超聲促進(jìn)液態(tài)發(fā)酵豆粕制備低聚肽的方法，具體為在豆粕發(fā)酵的不同的生長(zhǎng)期施加不同類型的超聲波，以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和提高低聚肽的生產(chǎn)效率。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，其具體的技術(shù)方案如下：

s1、制備枯草芽孢桿菌發(fā)酵種子液，接種于大豆粕液態(tài)培養(yǎng)基，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵。

s2、在發(fā)酵中施加超聲處理：

將裝有菌液的三角瓶于搖床培養(yǎng)9h進(jìn)入微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，然后進(jìn)行掃頻發(fā)散式超聲處理0.5~1.5h；再于36℃搖床培養(yǎng)14h左右進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后期，再進(jìn)行逆流聚能式超聲處理0.5~1h，將培養(yǎng)基在45~55℃溫度恒溫4~6h。

其中不同階段超聲參數(shù)設(shè)置為：

掃頻發(fā)散式超聲參數(shù)：功率密度60w/l、頻率24±2khz、間歇比5s∶5s。

逆流聚能式超聲參數(shù)：功率500w、頻率40khz、間歇比5s∶5s、超聲處理腔體積50ml，處理液總體積500ml。

上述的菌液不限于枯草芽孢桿菌，還包括一些產(chǎn)蛋白酶的其他菌。例如地衣芽孢桿菌，曲霉菌和毛霉菌。

本發(fā)明相比于傳統(tǒng)的發(fā)酵方法或者一些超聲輔助發(fā)酵法（比如1、發(fā)酵過程中不施加超聲；2、在細(xì)菌穩(wěn)定期后期施加聚能式超聲；3、在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期和后期分別施加掃頻超聲和聚能式超聲；4、在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期和穩(wěn)定期中期分別施加掃頻超聲和聚能式超聲），具有的有益效果為：一方面，發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝旺盛，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收強(qiáng)，在此時(shí)施加低強(qiáng)度的掃頻超聲，加強(qiáng)傳質(zhì)效果，有助于細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)；另一方面，發(fā)酵穩(wěn)定期后期細(xì)胞密度高，胞內(nèi)蛋白酶含量豐富，在此階段施加高強(qiáng)度聚能式超聲能夠有效破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，釋放胞內(nèi)蛋白酶和菌蛋白，補(bǔ)充蛋白酶繼續(xù)酶解蛋白質(zhì)，大幅提高發(fā)酵生產(chǎn)低聚肽效率。

附圖說明

圖1為枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線圖。

圖2為掃頻超聲設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖：1為培養(yǎng)瓶，2為掃頻超聲換能器。

圖3為聚能式超聲設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖：1為聚能式超聲波探頭，2為超聲杯型腔，3為蠕動(dòng)泵，4為恒溫器。

具體實(shí)施方式

下面通過附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。

在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。

實(shí)施例中所涉及菌種均為常規(guī)市場(chǎng)購(gòu)買所得。

對(duì)照和實(shí)施例中生物量的測(cè)定和多肽含量測(cè)定按照以下方法進(jìn)行：

（1）生物量的測(cè)定:

取發(fā)酵液稀釋不同濃度，按照gb/t13093-2006進(jìn)行tsa培養(yǎng)基涂布測(cè)定，36℃恒溫培養(yǎng)，24h后計(jì)數(shù)，每個(gè)濃度做3次平行。

（2）多肽含量測(cè)定:

用15%三氯乙酸等體積沉淀發(fā)酵液，離心后取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取1ml稀釋液，采用雙縮脲法測(cè)定。

對(duì)照例1:

（1）發(fā)酵種子液配制

將斜面試管保存的枯草芽孢桿菌菌種接種于100mllb培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉和1%nacl，121℃滅菌25min），在36℃，200r/min搖床中培養(yǎng)20h后轉(zhuǎn)移到冰箱中備用。

（2）枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

配制上述15瓶豆粕培養(yǎng)基（20%豆粕、1%kh2po4、1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉和1%nacl，ph調(diào)為7.0，121℃滅菌25min），接10%的枯草芽孢桿菌菌種，菌液共50ml于200ml三角瓶，調(diào)節(jié)ph至7.0，于搖床200r/min，36℃培養(yǎng)。每隔2h取出一瓶培養(yǎng)液，并取出1ml菌液，加入9ml蒸餾水使細(xì)胞重新懸浮，以蒸餾水為空白，420nm下比濁。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，od值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖1顯示，0~1.5h為遲緩期，1.5~16h為對(duì)數(shù)期，16~24h為穩(wěn)定期。

（3）枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵

將裝有豆粕培養(yǎng)基的三角瓶中接種10%枯草芽孢桿菌種子液，放置于200r/min，36℃搖床培養(yǎng)24h。

（4）低聚肽的制備

將上述發(fā)酵好的菌液，100℃沸水浴滅酶10min，4000r/min離心5min，上清液即為低聚肽提取物，再經(jīng)活性炭脫色，通過濃縮提取，最后經(jīng)噴霧干燥即得成品?？莶菅挎邨U菌生物量測(cè)定為9.2×10⁹cfu/ml，多肽含量測(cè)定為25.4mg/ml。

對(duì)照例2:

（1）發(fā)酵種子液配制

同對(duì)照例1步驟1。

（2）枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵

將裝有豆粕培養(yǎng)基的三角瓶中接種10%枯草芽孢桿菌種子液，放置于200r/min，36℃搖床培養(yǎng)23h進(jìn)入微生物穩(wěn)定生長(zhǎng)期后期，進(jìn)行逆流聚能式超聲處理0.5h（圖3），將培養(yǎng)基在45℃溫度恒溫4h。

逆流聚能式超聲參數(shù)：功率500w、頻率40khz、間歇比5s∶5s、超聲處理腔體積50ml，處理液總體積500ml。

（3）低聚肽的制備

同對(duì)照例1步驟4。

生物量和多肽含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：枯草芽孢桿菌生物量測(cè)定為8.7×10⁹cfu/ml，多肽含量測(cè)定為32.4mg/ml。

對(duì)照例3:

（1）發(fā)酵種子液配制

同對(duì)照例1步驟1。

（2）枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵

將裝有豆粕培養(yǎng)基的三角瓶中接種10%枯草芽孢桿菌種子液，放置于200r/min，36℃搖床培養(yǎng)9h進(jìn)入微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期后，將其置于掃頻超聲水槽中，且超聲水槽里的水與三角瓶中菌液液面齊平（圖2）。掃頻超聲處理1.5h后，再于搖床培養(yǎng)6h進(jìn)入對(duì)數(shù)期后期，再進(jìn)行逆流聚能式超聲處理0.5h（圖3），將培養(yǎng)基在45℃溫度恒溫4h。

掃頻發(fā)散式超聲參數(shù)：功率密度60w/l、頻率24±2khz、間歇比5s∶5s。

逆流聚能式超聲參數(shù)：功率500w、頻率40khz、間歇比5s∶5s、超聲處理腔體積50ml，處理液總體積500ml。

（3）低聚肽的制備

同對(duì)照例1步驟4。

生物量和多肽含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：枯草芽孢桿菌生物量測(cè)定為4.1×10⁹cfu/ml，多肽含量測(cè)定為17.9mg/ml。

對(duì)照例4:

（1）發(fā)酵種子液配制

同對(duì)照例1步驟1。

（2）枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵

將裝有豆粕培養(yǎng)基的三角瓶中接種10%枯草芽孢桿菌種子液，放置于200r/min，36℃搖床培養(yǎng)9h進(jìn)入微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期后，將其置于掃頻超聲水槽中，且超聲水槽里的水與三角瓶中菌液液面齊平（圖2）。掃頻超聲處理1.5h后，再于搖床培養(yǎng)10h進(jìn)入穩(wěn)定期中期，再進(jìn)行逆流聚能式超聲處理0.5h（圖3），將培養(yǎng)基在45℃溫度恒溫4h。

掃頻發(fā)散式超聲參數(shù)：功率密度60w/l、頻率24±2khz、間歇比5s∶5s。

逆流聚能式超聲參數(shù)：功率500w、頻率40khz、間歇比5s∶5s、超聲處理腔體積50ml，處理液總體積500ml。

（3）低聚肽的制備

同對(duì)照例1步驟4。

生物量和多肽含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：枯草芽孢桿菌生物量測(cè)定為1.2×10¹⁰cfu/ml，多肽含量測(cè)定為29.6mg/ml。

實(shí)施例1：

（1）發(fā)酵種子液配制

同對(duì)照例1步驟1。

（2）枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵

將裝有豆粕培養(yǎng)基的三角瓶中接種10%枯草芽孢桿菌種子液，放置于200r/min，36℃搖床培養(yǎng)9h進(jìn)入微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期后，將其置于掃頻超聲水槽中，且超聲水槽里的水與三角瓶中菌液液面齊平（圖2）。掃頻超聲處理1.5h后，再于搖床培養(yǎng)14h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后期，再進(jìn)行逆流聚能式超聲處理0.5h（圖3），將培養(yǎng)基在45℃溫度恒溫4h。

掃頻發(fā)散式超聲參數(shù)：功率密度60w/l、頻率24±2khz、間歇比5s∶5s。

逆流聚能式超聲參數(shù)：功率500w、頻率40khz、間歇比5s∶5s、超聲處理腔體積50ml，處理液總體積500ml。

（3）低聚肽的制備

同對(duì)照例1步驟4。

生物量和多肽含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：枯草芽孢桿菌生物量測(cè)定為1.3×10¹⁰cfu/ml，多肽含量測(cè)定為36.4mg/ml。

實(shí)施例2：

（1）發(fā)酵種子液配制

同對(duì)照例1步驟1。

（2）枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵

將裝有豆粕培養(yǎng)基的三角瓶中接種10%枯草芽孢桿菌種子液，放置于200r/min，36℃搖床培養(yǎng)9h進(jìn)入微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期后，將其置于掃頻超聲水槽中，且超聲水槽里的水與三角瓶中菌液液面齊平（圖2）。掃頻超聲處理0.75h后，再于搖床培養(yǎng)14h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后期，再進(jìn)行逆流聚能式超聲處理0.75h（圖3），將培養(yǎng)基在50℃溫度恒溫4h。

掃頻發(fā)散式超聲參數(shù)：功率密度60w/l、頻率24±2khz、間歇比5s∶5s。

逆流聚能式超聲參數(shù)：功率500w、頻率40khz、間歇比5s∶5s、超聲處理腔體積50ml，處理液總體積500ml。

（3）低聚肽的制備

同對(duì)照例1步驟4。

生物量和多肽含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：枯草芽孢桿菌生物量測(cè)定為2.7×10¹⁰cfu/ml，多肽含量測(cè)定為55.3mg/ml。

實(shí)施例3：

（1）發(fā)酵種子液配制

同對(duì)照例1步驟1。

（2）枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵

將裝有豆粕培養(yǎng)基的三角瓶中接種10%枯草芽孢桿菌種子液，放置于200r/min，36℃搖床培養(yǎng)9h進(jìn)入微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期后，將其置于掃頻超聲水槽中，且超聲水槽里的水與三角瓶中菌液液面齊平（圖2）。掃頻超聲處理1h后，再于搖床培養(yǎng)14h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后期，再進(jìn)行逆流聚能式超聲處理1h（圖3），將培養(yǎng)基在55℃溫度恒溫4h。

掃頻發(fā)散式超聲參數(shù)：功率密度60w/l、頻率24±2khz、間歇比5s∶5s。

逆流聚能式超聲參數(shù)：功率500w、頻率40khz、間歇比5s∶5s、超聲處理腔體積50ml，處理液總體積500ml。

（3）低聚肽的制備

同對(duì)照例1步驟4。

生物量和多肽含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：枯草芽孢桿菌生物量測(cè)定為1.8×10¹⁰cfu/ml，多肽含量測(cè)定為45.2mg/ml。

實(shí)施例4：

（1）發(fā)酵種子液配制

同對(duì)照例1步驟1。

（2）枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵

將裝有豆粕培養(yǎng)基的三角瓶中接種10%枯草芽孢桿菌種子液，放置于200r/min，36℃搖床培養(yǎng)9h進(jìn)入微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期后，將其置于掃頻超聲水槽中，且超聲水槽里的水與三角瓶中菌液液面齊平（圖2）。掃頻超聲處理0.5h后，再于搖床培養(yǎng)14h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后期，再進(jìn)行逆流聚能式超聲處理1h（圖3），將培養(yǎng)基在55℃溫度恒溫6h。

掃頻發(fā)散式超聲參數(shù)：功率密度60w/l、頻率24±2khz、間歇比5s∶5s。

逆流聚能式超聲參數(shù)：功率500w、頻率40khz、間歇比5s∶5s、超聲處理腔體積50ml，處理液總體積500ml。

（3）低聚肽的制備

同對(duì)照例1步驟4。

生物量和多肽含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：枯草芽孢桿菌生物量測(cè)定為2.1×10¹⁰cfu/ml，多肽含量測(cè)定為47.6mg/ml。

實(shí)施例5：

（1）發(fā)酵種子液配制

同對(duì)照例1步驟1。

（2）枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵

將裝有豆粕培養(yǎng)基的三角瓶中接種10%枯草芽孢桿菌種子液，放置于200r/min，36℃搖床培養(yǎng)9h進(jìn)入微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期后，將其置于掃頻超聲水槽中，且超聲水槽里的水與三角瓶中菌液液面齊平（圖2）。掃頻超聲處理0.75h后，再于搖床培養(yǎng)14h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后期，再進(jìn)行逆流聚能式超聲處理1h（圖3），將培養(yǎng)基在55℃溫度恒溫6h。

掃頻發(fā)散式超聲參數(shù)：功率密度60w/l、頻率24±2khz、間歇比5s∶5s。

逆流聚能式超聲參數(shù)：功率500w、頻率40khz、間歇比5s∶5s、超聲處理腔體積50ml，處理液總體積500ml。

（3）低聚肽的制備

同對(duì)照例1步驟4。

生物量和多肽含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：枯草芽孢桿菌生物量測(cè)定為2.5×10¹⁰cfu/ml，多肽含量測(cè)定為48.6mg/ml。

實(shí)施例6：

（1）發(fā)酵種子液配制

同對(duì)照例1步驟1。

（2）枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵

將裝有豆粕培養(yǎng)基的三角瓶中接種10%枯草芽孢桿菌種子液，放置于200r/min，36℃搖床培養(yǎng)9h進(jìn)入微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期后，將其置于掃頻超聲水槽中，且超聲水槽里的水與三角瓶中菌液液面齊平（圖2）。掃頻超聲處理0.5h后，再于搖床培養(yǎng)14h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后期，再進(jìn)行逆流聚能式超聲處理1h（圖3），將培養(yǎng)基在55℃溫度恒溫4h。

掃頻發(fā)散式超聲參數(shù)：功率密度60w/l、頻率24±2khz、間歇比5s∶5s。

逆流聚能式超聲參數(shù)：功率500w、頻率40khz、間歇比5s∶5s、超聲處理腔體積50ml，處理液總體積500ml。

（3）低聚肽的制備

同對(duì)照例1步驟4。

生物量和多肽含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：枯草芽孢桿菌生物量測(cè)定為2.2×10¹⁰cfu/ml，多肽含量測(cè)定為44.9mg/ml。

由以上對(duì)照例和實(shí)施例結(jié)果可知，對(duì)照例1中進(jìn)行常規(guī)處理的液態(tài)發(fā)酵，多肽含量為25.4mg/ml；對(duì)照例2中在穩(wěn)定期后期進(jìn)行逆流式超聲處理后，多肽含量為32.4mg/ml；對(duì)照例3中在對(duì)數(shù)期中期進(jìn)行掃頻超聲處理，對(duì)數(shù)期后期進(jìn)行逆流式超聲處理后，多肽含量為17.9mg/ml；對(duì)照例4中在對(duì)數(shù)期中期進(jìn)行掃頻超聲處理，在穩(wěn)定期中期進(jìn)行逆流式超聲處理，多肽含量為29.6mg/ml；而在6個(gè)實(shí)施例中，均是在對(duì)數(shù)期中期進(jìn)行掃頻超聲處理，然后在穩(wěn)定期后期進(jìn)行逆流式超聲處理后，多肽含量明顯得到提高，最低的36.4mg/ml，比對(duì)照例中最高的含量還高出較多，測(cè)得最高的含量為55.3mg/ml，比對(duì)照例高出3倍多。