本發(fā)明涉及化學(xué)合成技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種β-胸苷的合成方法。

背景技術(shù)：

β-胸苷(β-thymidine)在抗病毒藥物的生產(chǎn)和生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用中有著重要的作用，β-胸苷是合成抗愛(ài)滋病藥(aids)齊多夫定(zidovudine)和司它夫定(stavudine)的主要原料，無(wú)天然產(chǎn)物存在，其結(jié)構(gòu)如下式所示：

目前β-胸苷的合成方法主要采用化學(xué)合成法，通過(guò)溴代反應(yīng)、還原反應(yīng)以及皂化反應(yīng)制得，合成工藝如下：

該化學(xué)合成方法的成本較高，會(huì)產(chǎn)生較多的工業(yè)廢品，廢品中的溴和鎳廢物難以處理。

除了化學(xué)合成法以外，還可以通過(guò)酵母發(fā)酵法生產(chǎn)，發(fā)酵法生產(chǎn)β-胸苷雖然原輔料成本下降很多，但必須大批量連續(xù)生產(chǎn)，而產(chǎn)生的發(fā)酵液廢水處理成本也居高不下。據(jù)預(yù)測(cè)，到2019年全球胸苷市場(chǎng)總值將達(dá)到1.9億美元，因此提供一種制備成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)的β-胸苷的制備方法，具有重大的經(jīng)濟(jì)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種β-胸苷的合成方法，通過(guò)胸苷專用酶催化劑的構(gòu)建和酶工程逆向合成胸苷路線的設(shè)計(jì)，能有效縮短化學(xué)反應(yīng)步驟，去除高壓氫化等危險(xiǎn)工藝，減少使用溶劑5種以上。其方法步驟如下：

s1：5-甲基尿苷在尿苷激酶的作用下生成5-甲基尿苷單磷酸；

s2：5-甲基尿苷單磷酸在烏賊酸激酶的作用下，生成5-甲基尿苷二磷酸；

s3：5-甲基尿苷二磷酸在核糖核苷二磷酸還原酶的作用下生成胸苷二磷酸；

s4：胸苷二磷酸在胸苷酸激酶的作用下生成胸苷單磷酸；

s5：胸苷單磷酸在胸苷激酶的作用下生成β-胸苷。

本發(fā)明提供的一種β-胸苷的合成方法，在一個(gè)反應(yīng)內(nèi)使用5種酶，促進(jìn)5-甲基尿苷轉(zhuǎn)化為胸苷，研究利用兩個(gè)磷酸化步驟產(chǎn)生核苷酸，然后使用核糖核苷酸還原酶(rnr)催化核苷酸轉(zhuǎn)化為脫氧核苷酸，再經(jīng)兩步脫磷酸化產(chǎn)生胸苷。反應(yīng)流程如下：

(1)5-甲基尿苷生成5-甲基尿苷單磷酸：

(2)5-甲基尿苷單磷酸生成5-甲基尿苷二磷酸：

(3)5-甲基尿苷二磷酸生成胸苷二磷酸：

(4)胸苷二磷酸化生成胸苷單磷酸：

(5)胸苷單磷酸化生成胸苷：

工作原理：

本發(fā)明采用酶工程增加穩(wěn)定性和活動(dòng)性逆向合成胸苷，反應(yīng)的推動(dòng)力是從葡萄糖氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯和消耗adp。兩個(gè)atp消耗步驟(s1&s2)與兩個(gè)atp產(chǎn)生步驟(s4&s5)相結(jié)合?？傮w反應(yīng)是atp中性---不消耗atp，由于atp/adp步驟是循環(huán)再生的，并且葡萄糖脫氫酶(gdh)催化循環(huán)nadh。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果在于：

1、本發(fā)明提供的一種β-胸苷的合成方法，在同一反應(yīng)器中一鍋端完成全部反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單；所需大部分成本是酶、葡萄糖和5-甲基尿苷；另外雜質(zhì)是磷酸化合物，分離容易，大大降低成本，縮短生產(chǎn)步驟，減少工業(yè)廢物，無(wú)毒和環(huán)保。

2、通過(guò)胸苷專用酶催化劑的構(gòu)建和酶工程逆向合成胸苷路線的設(shè)計(jì)，能有效縮短化學(xué)反應(yīng)步驟，去除高壓氫化等危險(xiǎn)工藝，減少使用溶劑5種以上，反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的廢水減少30％以上。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解說(shuō)。

原料來(lái)源：5-甲基尿苷，連云港篤翔化工有限公司；80-90％純度三磷酸腺苷(atp)、80-90％純度黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)、mgso4、葡萄糖(glucose)、hcl、naoh、nacl、磷酸鹽緩沖液，來(lái)自任何商業(yè)來(lái)源。

實(shí)施例1

將1eq5-甲基尿苷，0.1eq三磷酸腺苷(atp)、0.1eqnadph，酶濃度黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)、酶濃度mgso4，葡萄糖脫氫酶，尿苷激酶，烏賊酸激酶，核糖核苷二磷酸還原酶，胸苷酸激酶和胸苷激酶加入磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液中含10mmnacl，使用hcl和na0h保持ph值為6，反應(yīng)溫度為20℃，反應(yīng)時(shí)間為20h。

與常用化學(xué)合成法相比，反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的廢水減少33％。

實(shí)施例2

將1eq5-甲基尿苷，0.1eq三磷酸腺苷(atp)、0.1eqnadph，酶濃度黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)、酶濃度mgso4，葡萄糖脫氫酶，尿苷激酶，烏賊酸激酶，核糖核苷二磷酸還原酶，胸苷酸激酶和胸苷激酶加入磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液中含10mmnacl，使用hcl和naoh保持ph值為7，反應(yīng)溫度為45℃，反應(yīng)時(shí)間為30h。

與常用化學(xué)合成法相比，反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的廢水減少31％。

實(shí)施例3

將1eq5-甲基尿苷，0.1eq三磷酸腺苷(atp)、0.1eqnadph，酶濃度黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)、酶濃度mgso4，葡萄糖脫氫酶，尿苷激酶，烏賊酸激酶，核糖核苷二磷酸還原酶，胸苷酸激酶和胸苷激酶加入磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液中含10mmnacl，使用hcl和naoh保持ph值為8，反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間為37h。

與常用化學(xué)合成法相比，反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的廢水減少38％。

實(shí)施例4

將1eq5-甲基尿苷，0.1eq三磷酸腺苷(atp)、0.1eqnadph，酶濃度黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)、酶濃度mgso4，葡萄糖脫氫酶，尿苷激酶，烏賊酸激酶，核糖核苷二磷酸還原酶，胸苷酸激酶和胸苷激酶加入磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液中含10mmnacl，使用hcl和naoh保持ph值為7，反應(yīng)溫度為25℃，反應(yīng)時(shí)間為10h。

與常用化學(xué)合成法相比，反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的廢水減少42％。

實(shí)施例5

將1eq5-甲基尿苷，0.1eq三磷酸腺苷(atp)、0.1eqnadph，酶濃度黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)、酶濃度mgso4，葡萄糖脫氫酶，尿苷激酶，烏賊酸激酶，核糖核苷二磷酸還原酶，胸苷酸激酶和胸苷激酶加入磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液中含10mmnacl，使用hcl和naoh保持ph值為9，反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時(shí)間為40h。

與常用化學(xué)合成法相比，反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的廢水減少36％。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。