專利名稱：腺病毒－胸苷激酶基因構(gòu)型及其獲得方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因構(gòu)型，特別是一種腺病毒-胸苷激酶基因構(gòu)型及其獲得方法和應(yīng)用。
眾所周知，惡性腫瘤目前是危害人類健康及生命的首要疾病，每年我國死于惡性腫瘤的患者約130萬人以上。目前用于治療腫瘤的四大方法是手術(shù)、化療、放療和免疫綜合療法，它們雖可部分改善病人的預(yù)后，但尚未獲實質(zhì)性進(jìn)展，而基因治療正以巨大的生活力和嶄新的面貌出現(xiàn)，其發(fā)展代表了下世紀(jì)根治腫瘤的發(fā)展方向。
自1986年Moolten博士在偶然機會發(fā)現(xiàn)(Moolten等人，Cancer Res1986，465276)單純皰疹病毒的胸苷激酶(TK)基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞可使其對化療敏感性增加以來，人們對TK基因的抗癌作用進(jìn)行了研究，認(rèn)識到其治療腫瘤的基本原理在于胸苷激酶可將對哺乳動物細(xì)胞無毒的更昔洛韋代謝為細(xì)胞毒性產(chǎn)物，使轉(zhuǎn)染了單純瘡疹病毒胸苷激酶的腫瘤細(xì)胞在更昔洛韋的參與下自發(fā)死亡，也稱自殺效應(yīng)。
顯然，如何獲得腺病毒-胸苷激酶基因以及使其在臨床應(yīng)用上有高的轉(zhuǎn)染效率、高表達(dá)、較好的穩(wěn)定性是生物學(xué)家、醫(yī)學(xué)家共同關(guān)心的課題。
本發(fā)明目的是提供一種優(yōu)化的腺病毒-胸苷激酶基因構(gòu)型，獲得該構(gòu)型的方法以及利用上述基因構(gòu)型得到的產(chǎn)品。
為達(dá)到上述目的本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種腺病毒-胸苷激酶基因構(gòu)型，其特征在于全構(gòu)件包括腺病毒載體、胸苷激酶片斷和RSV-LTP啟動子，全構(gòu)件核苷酸長43Kb，胸苷激酶長2.8Kb，啟始片斷長18bp，其序列ATGGCTTCGTACCCCTGC。
一種獲得上述基因構(gòu)型的方法，其特征在于它包括(1)在序列為ATGGCTCGTCCCTGC啟始片斷誘導(dǎo)下，在體外與ADV載體胸苷激酶基因cDNA，經(jīng)酶切、連結(jié)、共轉(zhuǎn)染使RSV-LTP啟動子和胸苷激酶片斷插入腺病毒載體中，(2)將(1)中的初級構(gòu)件與輔助質(zhì)粒PJM17再次結(jié)合，連結(jié)成型后使構(gòu)件能在293細(xì)胞中培養(yǎng)擴(kuò)增。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1腺病毒-胸苷激酶基因構(gòu)型2DNA連接及載體構(gòu)建示意3TK基因核苷酸序列(之前應(yīng)該含有多個A及尾帶共2.8Kb)1、ADV腺病毒載體的獲得ADV即致病輕微的人體腺病毒，本項目采用的ADV是經(jīng)DNA重組技術(shù)去除基因組中Ela，E1b，E3編碼區(qū)，全長7.5Kb，成為一種復(fù)制缺陷病毒載體。采用ADV作為基因治療的載體具有以下明顯的生物學(xué)優(yōu)點(1)除淋巴細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞外具有廣泛的感染譜，其感染無須細(xì)胞處于分裂期；(2)ADV轉(zhuǎn)入細(xì)胞后以基因組外染色體的形式存在，無插入基因組導(dǎo)致突變，致癌的危險性；(3)病毒可在體外復(fù)制；(4)基因持續(xù)表達(dá)可達(dá)2-3個月等。
2、TK基因全長cDNA編碼片斷(請見附圖3)3、DNA連接及載體構(gòu)建(1)在序列為ATGGCTTCGTACCCCTGC啟始片斷的誘導(dǎo)下，在體外與PBR322載體、上述TK基因cDNA，經(jīng)酶切，所用酶為456×bal，Bg111/BamHI，BamHI連結(jié)、共轉(zhuǎn)染使RSV啟動子和胸苷激酶基因插入腺病毒PBR322載體中(見圖1、圖2)。
(2)由于上述構(gòu)件尚缺乏在體外復(fù)制擴(kuò)增能力，所以將初級構(gòu)件與輔助質(zhì)粒(PFM17)再次結(jié)合，連結(jié)成型后使構(gòu)件能在293細(xì)胞(一種人胚腎細(xì)胞)培養(yǎng)擴(kuò)增。選用293細(xì)胞(ATCC-CRL1573)作為病毒復(fù)制細(xì)胞系，此細(xì)胞系是V型ADV的轉(zhuǎn)化基因，是國際通用的繁殖分離病毒及進(jìn)行ADV滴度測定的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，此細(xì)胞系已從美國引進(jìn)。
(3)由于構(gòu)件有可能出現(xiàn)缺碼或反序而形成無功能構(gòu)件，所以需要對構(gòu)件進(jìn)行篩選，篩選過程在瓊脂膠上進(jìn)行，隨后通過酶切，RT-PCR檢測DNA測序，篩選出符合設(shè)計要求的構(gòu)型。
(4)篩選出的合格構(gòu)件接種于293細(xì)胞中培養(yǎng)(37℃，CO2)，使其大量擴(kuò)增，提取培養(yǎng)上清液，在80,000g超速離心分離出可用于治療腺病毒-胸苷激酶產(chǎn)品。
(5)對產(chǎn)品進(jìn)行CsCl氯化銫純化，應(yīng)用空斑試驗測出PFU效價，在80℃保存。
可利用腺病毒-胸苷激酶基因構(gòu)件擴(kuò)增后的上清液制取基因產(chǎn)品，根據(jù)本腺病毒-胸苷激酶基因構(gòu)建系統(tǒng)在初步臨床前預(yù)實驗中表明，無論在體外腫瘤細(xì)胞系或動物模型內(nèi)，該基因產(chǎn)品具有明確、高效抗人類腫瘤活性，安全性好，應(yīng)用方便，其中對卵巢癌的臨床前期應(yīng)用中，有效率超過70％，特別是用于多種宿主腫瘤局部直接注射，本產(chǎn)品對手術(shù)不能切除或切除不完全的局部病灶有獨到的治療效果。由于載體是一種缺陷的人體伴隨病毒，無宿主基因插入突變的危險性，因此為應(yīng)用于臨床有很好的發(fā)展前景。特別是中國人實體瘤有效好效果。
機理將胸苷激酶通過腺病毒為載體轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞中使之表達(dá)，繼之加用更昔洛韋，在其參與下，胸苷激酶轉(zhuǎn)化單磷酸核苷為三磷酸核苷，并與腫瘤新生DNA鏈結(jié)合，干擾DNA的合成而殺死腫瘤細(xì)胞，而且胸苷激酶基因抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)還能通過另一原理“旁觀者效應(yīng)”，即使僅有10％的腫病細(xì)胞轉(zhuǎn)入胸苷激酶，加入更昔洛韋后，其余90％的腫瘤細(xì)胞由于細(xì)胞間的縫隙連接也將被殺死，使其抗腫瘤效應(yīng)達(dá)到放大增效作用。
本發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明通過優(yōu)化設(shè)計，選擇無毒腺病毒載體，選定相應(yīng)功能基因片段長度等，使基因載體系統(tǒng)具有特異性，可轉(zhuǎn)染多種人體實體瘤，例如卵巢癌，宮頸癌，前列腺癌，胃腸道癌皮膚黑色素瘤及軟組織腫瘤，而且具有高抗癌作用，對卵巢癌的臨床前期應(yīng)用中，有效率超過70％，本產(chǎn)品的表達(dá)率達(dá)95％以上。
權(quán)利要求
1.一種腺病毒-胸苷激酶基因構(gòu)型，適用于人體腫瘤局部轉(zhuǎn)染，其特征在于全構(gòu)件包括腺病毒載體，胸苷激酶片斷和RSV-LTP啟動子，全構(gòu)件核苷酸長43Kb，胸苷激酶長2.8Kb，啟始片斷為18bp，其序列ATGGCTTCGTACCCCTGC。
2.一種獲得權(quán)利要求1所述基因構(gòu)型的方法，其特征在于它包括(1)在序列為ATGGCTCGTCCCTGC啟始片斷的誘導(dǎo)下，在體外與ADV載體、TK基因cDNA，經(jīng)酶切、連結(jié)、共轉(zhuǎn)染使RSV-LTP啟動子和胸苷激酶片斷插入腺病毒載體中，(2)將(1)中的初級構(gòu)件與輔助質(zhì)粒PJM17再次結(jié)合，連結(jié)成型后使構(gòu)件能在293細(xì)胞中培養(yǎng)擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獲得基因構(gòu)型的方法，其特征在于所述構(gòu)件經(jīng)篩選過程，篩選系在瓊脂膠上進(jìn)行，得到所需的正確基因構(gòu)型。
4.一種利用腺病毒-胸苷激酶基因做成治療卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、胃腸道癌、皮膚黑色素瘤及軟組織腫瘤等實體癌的制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腺病毒－胸苷激酶基因構(gòu)型及其獲得方法和應(yīng)用。全構(gòu)件包括腺病毒載體、胸苷激酶片斷和RSV－LTP啟動子,全構(gòu)件核苷酸長43Kb,胸苷激酶長2.8Kb,啟始片斷為18bp,其序列ATGGCTTCGTACCCCTGC。該產(chǎn)品是通過對人體腫瘤特別是局部實體瘤進(jìn)行轉(zhuǎn)染,在更昔洛韋的參與下,能針對特異性殺滅腫瘤細(xì)胞,可轉(zhuǎn)染各種人體實體瘤,特別對中國人有高抗癌作用。
文檔編號C12N15/54GK1254759SQ98124960
公開日2000年5月31日 申請日期1998年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月25日
發(fā)明者馬丁, 盧運萍, 王世宣, 周劍鋒, 李震中 申請人:馬丁