專利名稱：治療丙型肝炎病毒相關(guān)性疾病的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域，具體地說是一種針對丙型肝炎病毒(hepatitisC virus，HCV)的反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)的序列與結(jié)構(gòu)及其成為治療HCV相關(guān)性疾病、減小HCV相關(guān)性疾病危害性的新型藥物。
丙型肝炎是由HCV引起的一種嚴(yán)重威脅人類健康的重要傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計，全世界約有1.7億HCV攜帶者，其中95％以上分布在發(fā)展中國家。我國健康人群和散發(fā)性急性病毒性肝炎病例中HCV感染率分別達(dá)2.2％和2.15％以上，與血液接觸頻繁的人群丙肝流行率可高達(dá)60％以上，屬丙型肝炎的高發(fā)區(qū)(康來儀等。中華傳染病雜志，1997，1571-75)。丙型肝炎慢性化率高達(dá)85％以上，其中20％的患者在10年內(nèi)發(fā)展為肝硬化，且與肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)(Seeff.Hepatology，1997，26(Suppl 1)21S-28S.Di Bisceglie AM，et al.Hepatology，1997，26(Suppl 1)34S-38S)。目前尚無有效的丙肝預(yù)防疫苗和特異性治療藥物。α-干擾素是目前最常用的抗HCV藥物，在嚴(yán)格選擇適應(yīng)證的患者中，有效率僅15-25％，且有明顯副作用(Dusheiko G.Hepatology，1997，26(Suppl 1)112S-1218S)。因此，急需尋求特異高效的抗HCV藥物。
ASODN是研究細(xì)胞與病毒基因功能的重要工具，另一方面，由于ASODN與特定基因按堿基配對原理結(jié)合即雜交，從而抑制該基因表達(dá)，因此被認(rèn)為是理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物(Milligan JF，et al.J Med Chem，1993，361923-1937.Askari FK，et al.New Engl J Med，1996，334316-318)。實驗研究表明ASODN能有效地抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞中艾滋、肝炎等病毒的復(fù)制。I-III期臨床資料顯示ASODN對艾滋、巨細(xì)胞及乳頭瘤等病毒感染疾病有較好的療效。ASODN還可特異性抑制細(xì)胞粘附分子，對Crohn’s病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、腎移植排斥等免疫反應(yīng)性疾病有顯著的療效。此外，初步研究證明ASODN對心血管及腫瘤等疾病也有一定的應(yīng)用前景。針對腫瘤相關(guān)基因BCL2、c-myb、Ras、Bgl-2、Raf、PKC-a、P53及Bcl-ABL的ASODN也已進(jìn)入I-II期臨床觀察(Bennett CF.Science，1996，271434.Bomm D.Lancet，1996，347820.Edgington SM.Nature Biotechnology，1997，15519-524.Zurer P.ChemEngineer News，1997，35-39.)。由于ASODN作用的高度特異性，因此被認(rèn)為是極具潛力的抗病毒和抗腫瘤新藥。近年來逐漸成為國內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)界注意的焦點，國外已有一些著名制藥企業(yè)已將反義藥物作為其新藥研究開發(fā)的重點方向之一。美國基因工程通訊還將反義核酸列為90年代十大熱門生物技術(shù)之一。目前已申請有關(guān)專利200余篇，包括抗病毒、抗腫瘤ASODN序列及不同的修飾方法等。有關(guān)丙型肝炎的反義寡核苷酸已有兩家申請專利(專利號WO 94/05813；WO95/30746)。
HCV基因組為一單股正鏈RNA，長約9.4kb，含5’與3’NCR及一個大的開讀框，只有一個起始密碼子，編碼一個大的多聚蛋白前體，在細(xì)胞及病毒蛋白酶作用下，從5’端到3’端依次產(chǎn)生C、E1、E2、NS2-NS5蛋白。不同國家、不同地區(qū)HCV基因組存在明顯的異質(zhì)性。其5’NCR在所有病毒分離株中是最保守的區(qū)域，由341個核苷酸組成，形成了復(fù)雜的二、三級結(jié)構(gòu)，有4個莖環(huán)結(jié)構(gòu)包括多聚蛋白翻譯起始位點，含帽非依賴性mRNA翻譯所必需的IRES。HCV5’NCR在HCV RNA翻譯與復(fù)制過程中可能發(fā)揮重要的調(diào)控功能(徐東剛等.國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊，1995，17180-182.Major ME，et al.Hepatology，1997，251527-1538.)。從HCV分子生物學(xué)特征來看，HCV可能是ASODN的理想作用靶標(biāo)。ASODN作用靶序列的明確是ASODN研究的關(guān)鍵步驟，ASODN必須與靶mRNA雜交，才能發(fā)揮活性，這明顯受靶mRNA在細(xì)胞內(nèi)的空間結(jié)構(gòu)影響，盡管計算機(jī)已預(yù)測了HCV5’NCR及翻譯起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)圖，成為ASODN設(shè)計的重要依據(jù)，但由于靶mRNA在細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)難以預(yù)測，因此，所設(shè)計的ASODN能否接近靶序列，有待在體內(nèi)、外對ASODN作進(jìn)一步的活性篩選與評價。
本發(fā)明的目的在于尋找特異高效的新型抗HCV藥物即對HCV基因具有較好抑制活性的ASODN及能改善其生物活性的化學(xué)修飾衍生物。
本發(fā)明的主要內(nèi)容是，根據(jù)從中國患者血清中克隆及序列分析獲得的HCV5′NCR全長序列，部分C基因序列(25個氨基酸)，參考其計算機(jī)預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)，采用計算機(jī)輔助設(shè)計了15條S-ASODNs、三條正義寡核酸及1條隨機(jī)序列(見表1)。采用PE公司產(chǎn)391A型自動DNA合成儀合成并在合成時進(jìn)行硫表1 硫代反義寡核苷酸序列及性質(zhì)序號 名稱 HCV靶位 長度 特 序列5’-3’(nt)(nt) 性1 HCV41 21-41 21A AGT GAT TCA TGG TGG AGT GTC2 HCV65 45-65 21A GAA GAC AGT AGT TCC TCA CAG3 HCV88 68-88 21A CCA TGG CTA GAC GCT TTC TGC4 HCV123 103-12321A GGG GTC CTG GAG GCT GCA CGA5 HCV173 153-17321A TTC CGG TGT ACT CAC CGG TTC6 HCV217 196-21722A CAT TGA GCG GGT TGA TCC AAG A7 HCV243 223-24321A CGT GGG GGC ACG CCC AAA TCT8 HCV279 257-27923A GCC TTT CGC CAC CCA ACA CTA CT9 HCV313 293-31322A GCA CTC GCA AGC ACC CTA TCA G10HCV363 341-36323A GAG GTT TAG GAT TCG TGC TCA TG11HCV349 327-34923A GTG CTC ATG GTG CAC GGT CTA CG12HCV373 351-37323A GTT TTT CTT TGA GGT TTA GGA TT13HCV345 324-34522A TCA TGG TGC ACG GTC TAC GAG A14HCV358 339-35820A TTA GGA TTC GTG CTC ATG CT15HCV352 333-35220A TTC GTG CTC ATG GTG CAC GG16HCV279s 257-27923S AGT AGT GTT GGG TCG CGA AAG GC17HCV363s 341-36323S CAT GAG CAC GAA TCC TAA ACC TC18HCV349s 327-34923S CGT AGA CCG TGC ACC ATG AGC AC19NS - 21R GCA GAG GTG AAA AAG TTG CATA反義；S正義；R隨機(jī)序列代修飾。經(jīng)Micro Pure II反相純化柱(Solid Phase Sciences)純化備用。建立HCV5’NCR調(diào)控?zé)晒馑孛富蛟贖epG2細(xì)胞中的瞬間表達(dá)系統(tǒng)及HCV RNA 5’NCR調(diào)控?zé)晒馑孛富虻霓D(zhuǎn)基因細(xì)胞模型HepG2.9706。采用該兩種體外活性評價模型，對上述ASODNs進(jìn)行篩選及評價。在瞬間表達(dá)系統(tǒng)中，5條S-ASODN即HCV65、HCV279、HCV363、HCV349及HCV352在25-100nmol/L濃度范圍內(nèi)，對HCV調(diào)控基因具有特異性的劑量依賴性抑制活性。當(dāng)濃度為100nmol/L時，這些ASODN的抑制率基本在80％以上。在穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞模型中進(jìn)一步論證了HCV363、HCV349及HCV279對HCV調(diào)控基因仍具有明顯的抑制活性。此外，對具有較好抑制活性的HCV363序列進(jìn)行了多種化學(xué)修飾并分析了不同修飾對ASODN體外穩(wěn)定性及對HCV5’NCR調(diào)控基因的抑制活性的影響。結(jié)果證明硫代修飾ASODN穩(wěn)定性及細(xì)胞內(nèi)的抑制活性最好。
根據(jù)本發(fā)明，針對HCV 5’NCR第二莖環(huán)結(jié)構(gòu)IIa(HCV 65)、第三莖環(huán)結(jié)構(gòu)IIId(HCV279)和翻譯起始區(qū)(HCV363及HCV349)的ASODNs能特異性抑制HCV調(diào)控基因的功能，有可能成為治療及預(yù)防HCV相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。
根據(jù)本發(fā)明，HCV65的長度為21個核苷酸，HCV279、HCV363及HCV349的長度均為23個核苷酸。反義寡核苷酸的長度與其細(xì)胞通透性、與靶序列結(jié)合親和性及作用特異性等因素相關(guān)。HCV65、HCV279、HCV349及HCV363的長度根據(jù)實驗確定，本發(fā)明包含了與HCV65、HCV279、HCV349及HCV363具有相同序列的任何長度寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，HCV65、HCV279、HCV349及HCV363可用于抑制I、II、III及IV型HCV RNA。因其所互補(bǔ)的序列在各型中是保守的區(qū)域。
根據(jù)本發(fā)明，為增強(qiáng)反義寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及組織靶向性等，本發(fā)明包含了HCV65、HCV279、HCV349及HCV363的各種化學(xué)修飾，例如硫代修飾、半乳糖直接修飾、親脂性分子或pH敏靶向脂質(zhì)體修飾等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明優(yōu)選的抗HCV反義寡核苷酸序列為HCV363。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物可按本領(lǐng)域已知方法配成非腸道給藥的制劑。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物治療組成可應(yīng)用單獨的有效成分或組合物形式包括聯(lián)合其它反義寡核苷酸及衍生物形式。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的治療組成，依不同情況包括特定藥物的藥物動力學(xué)、藥代動力學(xué)、給藥模式、給藥途經(jīng)、受者的年令、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質(zhì)、程度及治療時限等，以適宜的劑量給藥。
本發(fā)明的實施對嚴(yán)重危害人類健康的丙型肝炎及其相關(guān)疾病的治療具有重要的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。結(jié)合附表

本發(fā)明的具體實施方法圖1 HCV5’NCR調(diào)控?zé)晒馑孛副磉_(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建圖2 HCV5’NCR-C片段的PCR擴(kuò)增ADNA標(biāo)準(zhǔn)(pBR 344/Hinf I)，BPCR產(chǎn)物圖3 pHCV-luc09與pGL3熒光素酶在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)1. HepG2細(xì)胞(0.11±0.02)，2. pHCV-luc09(1141.9±151.1)3. pGL 3(5716.0±435.1)圖4 HCV5’NCR調(diào)控?zé)晒馑孛阜€(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建圖5 HepG2.9706細(xì)胞內(nèi)HCV片段的PCR及RT-PCR檢測MDNA標(biāo)準(zhǔn)(100bp DNA Ladder，)1-3分別為第15代細(xì)胞RNA、RNA(無反轉(zhuǎn)錄酶)及DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物4-6分別為第60代細(xì)胞RNA、RNA(無反轉(zhuǎn)錄酶)及DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物7HepG2細(xì)胞RNA擴(kuò)增產(chǎn)物，8HepG2細(xì)胞DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，9水圖6 HepG2.9706細(xì)胞熒光素酶表達(dá)的動力學(xué)曲線A第15代HepG2.9706細(xì)胞，B第60代HepG2.9706細(xì)胞圖7 ASODN對HCV調(diào)控基因抑制的序列特異性圖8 翻譯起始區(qū)S-ASODN序列的優(yōu)化圖9 S-ASODNs對HCV調(diào)控基因的劑量依賴性抑制活性圖10 S-ASODNs對HCV調(diào)控基因的特異性抑制活性圖11 HCV連續(xù)7天用藥對HCV調(diào)控基因的影響圖12 停藥后HCV363對HCV調(diào)控基因的持續(xù)性作用實施例一材料與方法1. HCV-RNA 5’NCR-C區(qū)片段的制備(見圖1)1.1模板pHCV376(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院王升啟博士構(gòu)建)含有HCV-RNA 5’NCR及C區(qū)部分序列(第25-400nt)。1.2引物設(shè)計與合成根據(jù)中國人HCV基因組(II型)序列，設(shè)計合成一對引物，上游引物H1(5’GCATCAAGCTTGCCAGCCCCCGATTGGGGGCGACACTCCACCATGAATCA3’，50個nt)含有HindIII酶切位點及HCV基因組1-39位核苷酸(nt)，下游引物H2(5’AACGATCTGACCACCACCCCGGAACTTGACGTCCTGTGGGCGGCGGTTG3’，49個nt)位于HCV基因組第419-386位核苷酸，引物采用PE公司產(chǎn)391A型自動DNA合成儀合成。1.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20μl，含10×PCR緩沖液2μl(Promega公司產(chǎn)品)，dNTPs 0.2mmol/L，MgCl21.5mmol/l，引物H1及H2各0.1μg，pHCV376 0.1μl，Taq酶0.5U(Promega公司產(chǎn)品)，石臘油20μl。PCR反應(yīng)條件為94℃變性30秒；72℃延伸40秒；60C退火10秒；循環(huán)35次后72C延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5％低溶點瓊脂糖凝膠電泳分離并用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Promega)純化。純化產(chǎn)物用Klenow大片段(華美生物工程公司)處理后進(jìn)行純化及HindIII酶切。2. HCVRNA 5’NCR調(diào)控?zé)晒馑孛副磉_(dá)質(zhì)粒(pHCV-luc09)構(gòu)建如圖1所示將pGL3載體采用NcoI(Promega)酶切，綠豆核酸酶(華美生物工程公司)削平，再用HindIII酶切。每次酶切后均用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提及乙醇沉淀。最后用0.8％低溶點瓊脂糖凝膠電泳純化，去除切割下的小片段。載體與5’NCR-C片段的連接及轉(zhuǎn)化參照《分子克隆》，插入片段與載體的摩爾比為6∶1，感受態(tài)細(xì)胞為Promega公司產(chǎn)品。3.克隆鑒定3.1 PCR鑒定在pGL3 Control Vector上5’NCR-C插入片段兩側(cè)各合成1條引物，上游引物G1序列為5’AGAAGTAGTGAGGAGGCTT T3’(20nt)，下游引物G2序列為5’AGAATGGCGCCGGGCCTTTC3’(20nt)，用PE公司產(chǎn)391A型自動DNA合成儀合成。采用不同的引物組合進(jìn)行菌體PCR擴(kuò)增鑒定。載體引物G1-G2組合，鑒定是否為陽性克隆。載體5’端引物G1與插入片段3’端引物H2組合及載體3’端引物G2與插入片段3’端引物H2組合，鑒定插入片段的方向。3.2序列分析采用Promega公司W(wǎng)izard Minipreps DNA Purification System試劑盒，按操作說明進(jìn)行質(zhì)粒提取。采用雙脫氧鏈終止法及fmol DNA SequencingSystem(Promega公司)按說明書操作進(jìn)行序列分析。4.質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)4.1細(xì)胞培養(yǎng)HepG2肝癌細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與流行病研究所王海濤研究員惠贈。采用DMEM培養(yǎng)基含10％小牛血清，青霉素10OU/ml，鏈霉素100ug/ml，在37℃，5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)及傳代。4.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞接種于24孔板(Costar)，0.5×105/孔，70-80％細(xì)胞融合后，采用脂質(zhì)體Lipofectin(1mg/mL，Life Technologies公司產(chǎn)品)試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染并按說明書操作。每次實驗均做雙孔。4.3熒光素酶活性檢測采用熒光素酶測定試劑盒(Lucifer-ase Assay System，Promega)及推薦的操作步驟進(jìn)行。化學(xué)發(fā)光儀為LKB公司的Wallac 1250Luminometer，輸出值為毫伏(MV)。4.4轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化取不同劑量(2-10μl)的Lipofectin及pHCV-luc091μg混合后與細(xì)胞一起孵育5h進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以確定Lipofectin的最佳濃度。取不同濃度pHCV-luc09質(zhì)粒(0.25-4μg)及Lipofectin 6μl，混合后孵育5h轉(zhuǎn)染，以確定最佳質(zhì)粒濃度。采用不同孵育時間(2-12h)及Phcv-luc09 1μg和Lipofectin 6μl進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以確定最佳孵育時間。結(jié)果1. HCV-RNA 5’NCR-C片段的特異性根據(jù)設(shè)計的引物，PCR產(chǎn)物(5’NCR-C片段)的擴(kuò)增長度為430bp，實際擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖電泳分析與設(shè)計長度一致(圖2)，由此獲得含有5’NCR完整序列及C區(qū)5’端25個密碼子的目的基因片段，其上游含有HindIII酶切位點。2. HCV-RNA 5’NCR-C片段克隆的鑒定2.1陽性克隆鑒定轉(zhuǎn)化菌落共35個，分別挑取少許菌體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽性克隆的限制擴(kuò)增片段長度為509bp，結(jié)果顯示8個克隆擴(kuò)增出與設(shè)計長度一致的陽性條帶即509bp條帶。2.2克隆方向鑒定采用引物G1與H2，G2與H2組合對8個陽性克隆進(jìn)行菌體PCR擴(kuò)增，G1與H2組合的擴(kuò)增片段長度為469bp，出現(xiàn)陽性條帶為正向插入，陰性結(jié)果為反向插入，G2與H2組合的擴(kuò)增片段長度為464bp，出現(xiàn)陽性條帶為反向插入，陰性結(jié)果為正向插入，實際結(jié)果表明8個陽性克隆均為正向插入，這與所設(shè)計的定向克隆相一致。2.3序列分析鑒定分別提取兩個質(zhì)粒(pHCV-luc09)及(pHCV-luc13)進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明pHCV-luc09的插入片段5’NCR-C序列與中國人HCV序列一致，但其3’端缺失了15個核苷酸，5’NCR-C片段第419位核苷酸C取代了A，兩端與載體連接處序列與所設(shè)計的相一致，即熒光素酶基因的起始密碼子被去除。而pHCV-luc13的插入片段5’NCR-C 3’端缺失20個核苷酸。2.4質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)8個陽性克隆提取的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞，通過化學(xué)發(fā)光的方法檢測熒光素酶活性的表達(dá)，結(jié)果表明8個質(zhì)粒中僅有一個質(zhì)粒能夠表達(dá)熒光素酶活性稱為pHCV-luc09，其絕對值達(dá)1141.9±151.1MV(細(xì)胞對照為0.1l±0.02MV)(圖3)，是pGL3報告載體熒光素酶活性的20％，其余7個質(zhì)粒基本上不表達(dá)熒光素酶活性。當(dāng)質(zhì)粒用量為1μg，Lipofectin用量為6μl，Lipofectin-質(zhì)粒復(fù)合物與細(xì)胞孵育4h時，pHCV-luc09在HepG2細(xì)胞中可獲得最佳轉(zhuǎn)染效果，此時酶活性測定值最高可達(dá)1126.8MV。實施例二材料與方法1.質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定1.1 HCVRNA 5’NCR調(diào)控?zé)晒馑孛副磉_(dá)質(zhì)粒(pHCV-neo4)構(gòu)建如圖4所示pHCV-luc09經(jīng)Hind III(華美生物工程公司產(chǎn)品)酶切，klenow(Biolabs產(chǎn)品)補(bǔ)平(完全補(bǔ)平或部分補(bǔ)平)，再用Xba I(Biolabs產(chǎn)品)酶切，低溶點瓊脂糖凝膠(Promega產(chǎn)品)電泳分離純化，獲得目的基因片段即HCV5’NCR-C與luc的融合基因片段。pCI-neo表達(dá)載體(Promega產(chǎn)品)進(jìn)行NheI(Biolabs產(chǎn)品)酶切，klenow補(bǔ)平(完全補(bǔ)平或部分補(bǔ)平)，再用Xba I酶切及低溶點瓊脂糖凝膠電泳純化，去除切割下的小片段。目的基因片段與pCI-neo載體的連接及轉(zhuǎn)化參照《分子克隆》，插入片段與載體的摩爾比為3∶1，JM109感受態(tài)細(xì)胞及T4 DNA連接酶為Promega產(chǎn)品。1.2克隆鑒定a. PCR鑒定在pCI-neo載體上插入片段上游合成1條引物P1，序列為5’TAATACGACTCACTATAGGG3’(20mer)，另一條引物G2互補(bǔ)于插入片段的HCV5’NCR-C基因的3’端，序列為5’AACGATCTGACCACCACCCCGGAACTTGACGTCCTGTGGGCGGCGGTTG3’(49mer)，用PE公司產(chǎn)391A型自動DNA合成儀合成。通過引物P1與G2進(jìn)行菌體PCR擴(kuò)增，鑒定陽性克隆。b.表達(dá)活性鑒定采用Promega WizardMinipreps DNA Purification System試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行l(wèi)uc表達(dá)活性鑒定。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時，HepG2肝癌細(xì)胞接種于24孔板(Costar)，細(xì)胞密度5×104/孔，70-80％細(xì)胞匯合后，采用脂質(zhì)體Lipofectin(1mg/mL，GIBCO/BRL，LifeTechnolog ies公司產(chǎn)品)試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染并按說明書操作。熒光素酶活性檢測方法同前。c.質(zhì)粒大小及酶切鑒定將構(gòu)建的質(zhì)粒與pCI-neo載體電泳分析，通過質(zhì)粒大小鑒定陽性克隆。選擇構(gòu)建質(zhì)粒上唯一的Xba I和Nhe I位點進(jìn)行酶切反應(yīng)及1％瓊脂糖凝膠電泳，通過電泳條帶的大小鑒定插入片段的正確性。Xba I位點在質(zhì)粒構(gòu)建過程中重建，而pCI-neo載體上Nhe I位點在質(zhì)粒構(gòu)建過程中被破壞，但HCV 5’NCR內(nèi)存在一個Nhe I位點。2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)克隆的篩選HepG2細(xì)胞以3×105密度接種于60mm培養(yǎng)皿(Costar產(chǎn)品)，60-70％細(xì)胞匯合后，采用脂質(zhì)體lipofectin(1mg/ml，GIBCO/BRL)進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染并按說明書操作，24小時后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞按1∶10傳代，同時加G418 700μg/ml(GIBCO產(chǎn)品)進(jìn)行篩選，每3天換液1次，4周后，進(jìn)行陽性克隆的鑒定。3.陽性克隆的鑒定3.1表達(dá)熒光素酶的活性鑒定在顯微鏡下挑取單個細(xì)胞克隆至24孔板(Costar)培養(yǎng)，培養(yǎng)液中G418含量減小至400μg/ml，每孔細(xì)胞100％匯合后，進(jìn)行熒光素酶活性檢測，方法同前。3.2 DNA整合的鑒定取高水平表達(dá)熒光素酶活性的細(xì)胞(第15代與第60代)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)HCV片段的擴(kuò)增。約3×105細(xì)胞用PBS(PH7.3)洗二次，加100μl含酚裂解液裂解細(xì)胞，加50μl氯仿?lián)u勻，12000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘，DNA用乙醇沉淀，75％乙醇洗滌后用10μl水溶解，取1μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20μl，擴(kuò)增試劑為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院HCV-RNA PCR試劑盒中的PCRmix，Taq酶為Promega產(chǎn)品，擴(kuò)增條件為94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循環(huán)35次。擴(kuò)增引物位于HCV 5’NCR內(nèi)，限制性擴(kuò)增片段長220bp。3.3 mRNA轉(zhuǎn)錄的鑒定取高水平表達(dá)熒光素酶活性的細(xì)胞(第15代與第60代)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)HCV片段相應(yīng)mRNA的檢測。采用TRIZOL試劑(GIBCO)，按說明書操作，分離提取細(xì)胞(約5×105)總RNA，并用RQ1 DNase(1u/μl，Promega)進(jìn)一步處理以去除可能殘留的DNA，取1μl(1μg/μl)總RNA溶解于19μl PCR混合物并加入酶混合物0.5μl(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院HCV-RNA PCR試劑盒中的產(chǎn)品)，42℃反轉(zhuǎn)錄40分鐘后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件同上。同時設(shè)不加反轉(zhuǎn)錄酶僅加Taq酶的反應(yīng)管為對照，設(shè)β2珠蛋白mRNA為內(nèi)參照，其限制性擴(kuò)增片段長317bp。3.4轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的表達(dá)動力學(xué)及穩(wěn)定性檢測第15代轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與第60代轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分別以7×104/孔接種24孔板，每24小時各取4孔細(xì)胞檢測其熒光素酶活性，觀測144小時。掊養(yǎng)細(xì)胞每天換液1次，培養(yǎng)液為含2％胎牛血清及G418μg/ml的DMEM。結(jié)果1構(gòu)建質(zhì)粒的鑒定由于Hind III與Nhe I酶切反應(yīng)后產(chǎn)生的末端有部分互補(bǔ)性，因此，在klenow補(bǔ)平兩個末端時采用了部分補(bǔ)平或完全補(bǔ)平的策略，結(jié)果提示部分補(bǔ)平與完全補(bǔ)平末端的連接效率均很高。1.1 PCR鑒定隨機(jī)挑取20個轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行鑒定，根據(jù)設(shè)計的引物，陽性克隆的限制擴(kuò)增片段長度為463bp，結(jié)果顯示20個轉(zhuǎn)化菌落中，15個克隆擴(kuò)增出與設(shè)計長度一致的陽性條帶。1.2表達(dá)活性鑒定取4個陽性克隆(4、5、8、9號)提取質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示4個質(zhì)粒均能表達(dá)熒光素酶活性，分別為3267、2388、306、2150(MV)。1.3大小鑒定4個質(zhì)粒與pCI-neo載體對照電泳顯示遷移速率存在差異。pCl-neo載體為5474bp，構(gòu)建的質(zhì)粒大小應(yīng)為7522bp，4個質(zhì)粒的遷移速率應(yīng)較pCl-neo載體緩慢，實際結(jié)果與此相一致。1.4酶切鑒定4號質(zhì)粒(稱為pHCV-neo4)經(jīng)Xba I及Nhe I酶切后應(yīng)產(chǎn)生1821bp及5701bp兩個片段，實際結(jié)果與理論值相一致。2 HCV 5’NCR轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型的建立選擇pHCV-neo4轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，挑取了150個克隆進(jìn)行熒光素酶活性檢測，最終獲得1個熒光素酶活性表達(dá)為1443MV的細(xì)胞株，稱為HepG2.9706。對HepG2.9706進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)HCV片段的PCR擴(kuò)增，獲得220bp的陽性條帶，而對照HepG2細(xì)胞則陰性(圖5)。由HepG2.9706細(xì)胞分離RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測，HepG2.9706出現(xiàn)317bp(內(nèi)參照)及220bp(目的基因)條帶，而HepG2細(xì)胞僅出現(xiàn)317bp條帶，表明HepG2.9706細(xì)胞內(nèi)含有目的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA(圖5)。由于不加反轉(zhuǎn)錄酶的HepG2.9706反應(yīng)管未見特異性條帶，從而排除了DNA污染的可能。β2珠蛋白mRNA作為內(nèi)參照，在相同的反應(yīng)條件下，與特異性目的基因同時擴(kuò)增。經(jīng)凝膠成像儀(Bio-RAD Gel Doc 1000)對擴(kuò)增產(chǎn)物密度定量，發(fā)現(xiàn)目的基因mRNA水平約為β2珠蛋白mRNA水平的51％。結(jié)果證實轉(zhuǎn)基因確實存在于HepG2.9706細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制及表達(dá)，且表達(dá)水平相對較高。HepG2.9706接種24孔板，能夠持續(xù)地表達(dá)熒光素酶活性，24小時時，熒光素酶活性表達(dá)最高，達(dá)952MV，隨后稍有下降，培養(yǎng)144小時后，熒光素酶活性仍有716MV(圖6)。以上均為HepG2.9706細(xì)胞建立早期(第15代)細(xì)胞的鑒定結(jié)果，為觀測HepG2.9706細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性，對第60代HepG2.9706細(xì)胞進(jìn)行了mRNA、DNA及熒光素酶活性表達(dá)檢測，結(jié)果顯示第60代HepG2.9706細(xì)胞內(nèi)mRNA及DNA仍陽性，與第15代細(xì)胞基本一致(圖5)，第60代HepG2.9706細(xì)胞熒光素酶活性表達(dá)較高，接種24小時，可達(dá)2247MV，1-4天內(nèi)熒光素酶活性變化較第15代細(xì)胞明顯，隨后趨于穩(wěn)定。實施例三材料與方法1. S-ASODN的設(shè)計和合成根據(jù)從中國患者血清中克隆及序列分析獲得的HCV5’NCR全長序列，部分C基因序列(25個氨基酸)，參考其計算機(jī)預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)，采用計算機(jī)輔助設(shè)計了15條S-ASODNs、三條正義寡核酸及l(fā)條隨機(jī)序列(見表1)。所有寡核苷酸均采用PE公司產(chǎn)391A型自動DNA合成儀合成并在合成時進(jìn)行硫代修飾。合成完畢濃氨水55℃切割并脫保護(hù)15小時后，經(jīng)Micro Pure II反相純化柱(Solid Phase Sciences)純化，紫外(Beckman DU640)定量后真空(Oligo Prep OPl20，SAVANT)干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩?.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞接種于96孔板(NUNC)，1×104細(xì)胞/孔，37℃，5％CO2孵育18-20小時，80-90％細(xì)胞匯合后，在無血清狀態(tài)下，采用脂質(zhì)體lipofectin(GIBCO，1mg/ml)試劑并參照說明書操作進(jìn)行pHCV-neo4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。每孔細(xì)胞用質(zhì)粒0.1μg，脂質(zhì)體lμg，總體積l00μl。轉(zhuǎn)染時，在消毒的1.5ml離心管中，質(zhì)粒0.1μg與脂質(zhì)體1μg分別用無血清DMEM培養(yǎng)基12.5μl稀釋，室溫放置30分鐘后，將脂質(zhì)體與質(zhì)粒溶液混勻，室溫下再置30分鐘，以便形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物，然后加入無血清DMEM培養(yǎng)基75μl。培養(yǎng)細(xì)胞用無血清DMEM培養(yǎng)基洗二次，每孔細(xì)胞加入總體積100μl的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液，作用5小時，換含l0％小牛血清的DMEM生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，檢測熒光素酶活性。3. S-ASODN活性評價將S-ASODN分別與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞，方法同上。以不加S-ASODN的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染為陽性對照。每次實驗中，每一S-ASODN均設(shè)3孔，結(jié)果取其平均值。4.熒光素酶活性檢測熒光素酶活性檢測采用熒光素酶測定試劑盒并參考其推薦的操作步驟進(jìn)行。待測細(xì)胞用PBS(pH7.3)洗二次，每孔細(xì)胞加1×細(xì)胞裂解液20μl，室溫下裂解10分鐘，加熒光素酶作用底物50μl，混勻，立即在多標(biāo)記檢測儀(VICTORTMWallac1420MULTILABEL COUNTER)上測1秒鐘發(fā)光強(qiáng)度，輸出值為CPS。結(jié)果1. S-ASODN抑制HCV調(diào)控基因的有效靶序列及劑量依賴性從表2中可見，12條S-ASODN中，有6條即HCV65、HCV88、HCV279、HCV313、HCV363及HCV349對HCV調(diào)控基因的抑制活性超過50％，濃度在25-l00nmol/L范圍內(nèi)時，具有明顯的劑量依賴性。HCV88與HCV313的抑制活性相對較低，IC50值分別為101.1nmol/L與74.7nmol/L，在l00nmol/L濃度時，其抑制率分別為50.2％與63.2％。HCV65、HCV279、HCV363及HCV349的抑制活性較強(qiáng)，IC50值分別為44.7nmol/L、50.2nmol/L、36.3nmol/L及41.6nmol/L，在l00nmol/L濃度時，其抑制率分別為88.8％、81.9％、82.8％及87.8％。另外6條S-ASODN未見明顯的抑制活性，且無劑量依賴性關(guān)系，其中4條S-ASODN可見促進(jìn)熒光素酶表達(dá)的作用。ASODN的GC含量與其活性之間無明顯關(guān)系。2. S-ASODN抑制HCV調(diào)控基因的序列特異性選擇S-ASODN HCV279、HCV363與HCV349靶序列的正義寡核苷酸HCV279s、HCV363s與HCV349s及無關(guān)序列NS與pHCV-neo4共轉(zhuǎn)染，同時將S-ASODN HCV279、HCV363
表2 12條S-ASODN對HCV調(diào)控基因的抑制活性名稱 二級結(jié)構(gòu) GC含量(％) 抑制率(％) IC50值25nmol/L 50nmol/L 100nmol/L (nmol/L)HCV41 單鏈 50 3.917.0 -4.1＞100HCV65 莖環(huán)結(jié)構(gòu)IIa50 25.3 53.2 88.844.7HCV88 莖環(huán)結(jié)構(gòu)IIb60 24.0 34.6 50.2＞100HCV123 莖環(huán)結(jié)構(gòu)IIc75 -16.4 10.6 -48.3 ＞100HCV173 莖環(huán)結(jié)構(gòu)IIIa 60 32.2 39.1 28.1＞100HCV217 莖環(huán)結(jié)構(gòu)IIIb 55 3.99.828.2＞100HCV243 莖環(huán)結(jié)構(gòu)IIIc 70 -296.630.7＞100HCV279 莖環(huán)結(jié)構(gòu)IIId 65 14.1 50.3 81.950.2HCV313 假結(jié)結(jié)構(gòu) 65 7.128.5 63.274.7HCV363 莖環(huán)結(jié)構(gòu)IV 55 39.1 57.0 82.836.3HCV349 莖環(huán)結(jié)構(gòu)IV 70 25.4 62.0 87.841.6HCV373 單鏈 35 -17.9 5.7-8.0＞100及HCV349與不含HCV靶序列的pGL3熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染作為陰性對照實驗。從圖7可見，在25-100nmol/L濃度范圍內(nèi)，HCV279s、HCV363s、HCV349s及NS對pHCV-neo4熒光素酶活性的最高抑制率分別為51.1％、17.2％、19.6％及7.6％，HCV363s可見促進(jìn)表達(dá)的作用。圖2顯示HCV279、HCV363及HCV349對pGL3熒光素酶活性的最高抑制率分別為40.2％、43.3％及48.4％。在25-100nmol/L濃度范圍內(nèi)，均未見劑量依賴性關(guān)系。在該濃度范圍內(nèi)，S-ASODN存在輕度的非特異性作用。此外，ASODN濃度超過200nmol/L時，抑制率均超過50％，出現(xiàn)明顯的非特異性作用。3.作用于翻譯起始區(qū)S-ASODN序列的優(yōu)化參考HCV翻譯起始區(qū)二級結(jié)構(gòu)，在HCV多聚蛋白翻譯起始區(qū)324-363核苷酸區(qū)域合成了5條重疊的S-ASODN，進(jìn)行翻譯起始區(qū)的ASODN序列優(yōu)化。結(jié)果表明HCV363、HCV349與HCV352對HCV調(diào)控基因有明顯的抑制作用，在100nmol/L濃度時，抑制率分別為64.1％、69.1％與69.4％，而HCV345及HCV358則未見明顯的抑制活性，最高抑制率分別為28.7％及9.2％，見圖8。4. S-ASODN抑制HCV基因表達(dá)調(diào)控的協(xié)同作用選擇作用于HCV RNA不同區(qū)域的ASODN HCV65、HCV279及HCV363，以50nmol/L濃度，分別采用兩條ASODN組合，同時與pHCV-neo4共轉(zhuǎn)染，觀察S-ASODN的協(xié)同作用。HCV65+HCV279、HCV279+HCV363及HCV65+HCV363對HCV調(diào)控基因的抑制率分別為92.5％、85.8％及91.0％，而HCV65、HCV279及HCV363各自在100nmol/L濃度時，抑制率分別為95.7％、86.4％及90.0％。結(jié)果提示，濃度為50nmol/L的兩條ASODN協(xié)同作用與其各自在100nmol/L濃度時的作用效果相當(dāng)。實施例四材料與方法1. S-ASODN的設(shè)計和合成根據(jù)實施例三的實驗結(jié)果，選擇設(shè)計了3條S-ASODN及3條相應(yīng)的正義寡核苷酸(見表3)。所有ASODN的合成同前。
表3 硫代反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)S-ODN性質(zhì)長 度HCV靶位(nt) 序列(5’-3’)(nt)HCV363A 23 341-363GAGGTTTAGGATTCGTGCTCATGHCV349A 23 327-349GTGCTCATGGTGCACGGTCTACGHCV279A 23 257-279GCCTTTCGCGACCCAACACTACTHCV363s S 23 341-363CATGAGCACGAATCCTAAACCTCHCV349s S 23 327-349CGTAGACCGTGCACCATGAGCACHCV279s S 23 257-279AGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCA反義，S正義2. HepG2.9706細(xì)胞株及培養(yǎng)HepG2.9706細(xì)胞株系pHCV-neo4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，獲得的能夠高水平持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)熒光素酶活性的細(xì)胞株，其熒光素酶基因的表達(dá)受HCV5’NCR調(diào)控。該細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含10％胎牛血清(GIBCO)，G418ug/ml(GIBCO)，青霉素100U/ml，鏈霉素100ug/ml，在37C，5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，傳代。3. S-ASODN活性評價HepG2.9706細(xì)胞接種于48孔板(Costar)，0.8×105/孔，37C，5％CO2孵育24小時，80-90％細(xì)胞融合后，在無血清狀態(tài)下，采用脂質(zhì)體Lipofectin(GIBCO，1mg/ml)包裹S-ASODN進(jìn)行HepG2.9706細(xì)胞轉(zhuǎn)染。每孔細(xì)胞用脂質(zhì)體3μg。轉(zhuǎn)染時，在消毒的1.5ml離心管中，不同濃度S-ASODN及脂質(zhì)體3μg分別加無血清DMEM培養(yǎng)基25μl稀釋，室溫下靜置40分鐘后，將脂質(zhì)體加到S-ASODN中，輕輕混勻，室溫下置30分鐘，以便形成脂質(zhì)體-S-ASODN復(fù)合物，然后加入無血清DMEM培養(yǎng)基200μl。培養(yǎng)的HepG2.9706細(xì)胞用無血清DMEM洗二次，每孔細(xì)胞加入總體積250μl的脂質(zhì)體-S-ASODN復(fù)合物溶液，作用5小時，換含10％胎牛血清及G418的DMEM生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，檢測細(xì)胞的熒光素酶活性。每次實驗中，每一條S-ASODN及每一濃度均設(shè)3-4孔，最終結(jié)果取其平均值。4.熒光素酶活性檢測熒光素酶活性檢測采用熒光素酶測定試劑盒(Luciferase Assay System，Promega)并參考其推薦的操作步驟進(jìn)行。待測細(xì)胞用PBS(pH7.3)洗二次，加1×細(xì)胞裂解液25μl，室溫下裂解10分鐘，將細(xì)胞裂解物移至小離心管中進(jìn)行離心，去除細(xì)胞碎片，取上清20μ1，加熒光素酶作用底物100μl，立即混勻，在化學(xué)發(fā)光儀上測10秒鐘發(fā)光強(qiáng)度。結(jié)果1. S-ASODNs對HCV基因調(diào)控抑制的劑量依賴性三條S-ASODNs分別取0.1mol/L，0.3μmol/L，0.5μmol/L三個濃度，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，對HepG2.9706細(xì)胞作用24小時，以不加S-ASODN的HepG2.9706細(xì)胞為對照?；钚詸z測結(jié)果表明三條S-ASODN對HCV基因調(diào)控均有劑量依賴性抑制活性(圖9)。當(dāng)濃度為0.5μmol/L時，HCV363、HCV349及HCV279抑制活性分別為42％、37％及58％。2. S-ASODNs對HCV基因調(diào)控抑制的特異性S-ASODNs及相應(yīng)的硫代正義寡核苷酸以0.5μmol/L濃度，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，連續(xù)3天分別作用于HepG2.9706細(xì)胞，活性檢測結(jié)果顯示HCV363、HCV349及HCV279對HCV基因調(diào)控的抑制率分別為61％，55％及48％，而相應(yīng)正義寡核苷酸對HCV基因調(diào)控不僅無抑制活性，反而呈現(xiàn)促進(jìn)作用(圖10)。3.連續(xù)給藥對S-ASODN抑制活性的影響分別取HCV363及HCV363s 0.2μmol/L，0.4μmol/L，0.8μmol/L三個濃度，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，連續(xù)7天作用于HepG2.9706細(xì)胞，從圖11可見HCV363呈現(xiàn)劑量依賴特異性抑制活性。當(dāng)濃度為0.8μmol/L時，HCV363抑制率可達(dá)81％，而HCV363s僅為19％，后者顯示輕度的非特異性抑制作用。4. S-ASODN抑制作用的持續(xù)性HCV363以0.5μmol/L濃度，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，連續(xù)3天作用于HepG2.9706細(xì)胞，于停藥后24小時，48小時，72小時，96小時，120小時及144小時后，分別測熒光素酶活性，從圖12可見隨著時間延長，HCV調(diào)控基因活性逐漸恢復(fù)。
權(quán)利要求
1.與丙型肝炎病毒5’非編碼區(qū)及翻譯起始區(qū)互補(bǔ)的寡核苷酸，其長度是10-30個堿基并包含下列序列的寡核苷酸硫代反義寡核苷酸序列及性質(zhì)序號 名稱 HCV靶位 長度 特性 序列5’-3’(nt)(nt)1 HCV4121-41 21 A AGT GAT TCA TGG TGG AGT GTC2 HCV6545-65 21 A GAA GAC AGT AGT TCC TCA CAG3 HCV8868-88 21 A CCA TGG CTA GAC GCT TTC TGC4 HCV123 103-12321 A GGG GTC CTG GAG GCT GCA CGA5 HCV173 153-17321 A TTC CGG TGT ACT CAC CGG TTC6 HCV217 196-21722 A CAT TGA GCG GGT TGA TCC AAG A7 HCV243 223-24321 A CGT GGG GGC ACG CCC AAA TCT8 HCV279 257-27923 A GCC TTT CGC GAC CCA ACA CTA CT9 HCV313 293-31322 A GCA CTC GCA AGC ACC CTA TCA G10HCV363 341-36323 A GAG GTT TAG GAT TCG TGC TCA TG11HCV349 327-34923 A GTG CTC ATG GTG CAC GGT CTA CG12HCV373 351-37323 A GTT TTT CTT TGA GGT TTA GGA TT13HCV345 324-34522 A TCA TGG TGC ACG GTC TAC GAG A14HCV358 339-35820 A TTA GGA TTC GTG CTC ATG GT15HCV352 333-35220 A TTC GTG CTC ATG GTG CAC GG
2.根據(jù)權(quán)利要求書1中的寡核苷酸，其最佳序列為HCV363、HCV349、HCV279及HCV65。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1中的寡核苷酸，經(jīng)不同化學(xué)修飾后，可以用于治療丙型肝炎及相關(guān)性疾病。
4.權(quán)利要求書3中的寡核苷酸的化學(xué)修飾物可以是硫代修飾、半乳糖修飾、親脂性分子及pH敏靶向脂質(zhì)體等修飾物。
5.權(quán)利要求4中經(jīng)化學(xué)修飾后的寡核苷酸可以制成各種不同的劑型，通過不同的給藥途經(jīng)用于I、II、III及IV型丙型肝炎及其相關(guān)性疾病的治療。
全文摘要
本發(fā)明是根據(jù)丙型肝炎病毒基因結(jié)構(gòu)設(shè)計、合成的五種反義寡核苷酸,可用于抑制丙型肝炎病毒基因的表達(dá)。本發(fā)明采用丙型肝炎病毒基因5’非編碼區(qū)調(diào)控?zé)晒馑孛富蛟贖epG2細(xì)胞中的瞬間表達(dá)系統(tǒng)及丙型肝炎病毒基因5’非編碼區(qū)調(diào)控?zé)晒馑孛富虻霓D(zhuǎn)基因細(xì)胞模型HepG2.9706,對15條互補(bǔ)于丙型肝炎病毒5’非編碼區(qū)及翻譯起始區(qū)的反義寡核苷酸進(jìn)行了活性篩選及評價,首次發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)于丙型肝炎病毒基因5’末端特定功能區(qū)域的寡核苷酸HCV279、HCV349、HCV363、HCV65、HCV313及其化學(xué)修飾物在培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型中能有效地抑制丙型肝炎病毒基因的表達(dá)。故本發(fā)明涉及到針對丙型肝炎病毒的反義寡核苷酸的序列與結(jié)構(gòu)及其成為治療丙型肝炎病毒有關(guān)性疾病、減小丙型肝炎病毒相關(guān)性疾病危害性的新型藥物。
文檔編號C12N15/11GK1253138SQ98124388
公開日2000年5月17日 申請日期1998年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月9日
發(fā)明者王升啟, 王小紅, 朱寶珍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所