一種單純皰疹病毒胸苷激酶突變體及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，公開了包含該核苷酸序列的重組載體、重組菌，以及SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列編碼的單純皰疹病毒胸苷激酶突變體及其制備方法和用途。本發(fā)明單純皰疹病毒胸苷激酶突變體可以有效治療實體瘤，安全性好，臨床應(yīng)用前景良好。
【專利說明】一種單純皰疹病毒胸苷激酶突變體及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種單純皰疹病毒胸苷激酶突變體及其制備 方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是嚴重威脅人類健康的疾病之一，人類全身腫瘤中90%以上常見的惡性腫 瘤都是實體瘤；隨著環(huán)境污染的加劇，其發(fā)病率逐年上升。實體瘤的傳統(tǒng)治療方法以手術(shù)、 化療及放療為主，但腫瘤的轉(zhuǎn)移率和治療后的復(fù)發(fā)率都較高，生存率仍不理想。因此，結(jié)合 最新的腫瘤生理學(xué)和醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究成果，進一步研究開發(fā)新型高效的實體瘤治療方 法，具有重要的社會經(jīng)濟意義。
[0003] 利用自殺基因治療實體瘤是近年來腫瘤基因治療的研究熱點。所謂自殺基因治療 腫瘤就是用基因工程技術(shù)將特定的外源基因?qū)肽[瘤宿主細胞或腫瘤組織中，該外源基因 表達的蛋白質(zhì)能夠?qū)o毒的前體藥物分解成對腫瘤細胞有毒性的藥物成分，直接殺死腫瘤 細胞，從而達到治療腫瘤的目的。然而，目前基因治療面臨的關(guān)鍵問題是如何解決載體的安 全性和靶向性問題，選擇一個高效、安全、特異性強的載體，是實現(xiàn)目的基因在腫瘤細胞中 特異表達的前提。
[0004] 單純皰疫病毒胸苷激酶基因（herpessimplexvirusthymidine kinase，HSV-TK)/更昔洛韋（ganciclovir，GCV)是目前研究最早最徹底的，安全性較高，廣 泛用于腫瘤基因治療的自殺基因系統(tǒng)之一。目前研究認為該自殺基因治療腫瘤的機制有兩 個：一是自殺效應(yīng)，即HSV-TK編碼由376個氨基酸組成的胸甘激酶，導(dǎo)入腫瘤細胞后，這 種胸苷激酶將無毒的更昔洛韋（GCV)磷酸化成單磷酸更昔洛韋，再進一步磷酸化為三磷酸 更昔洛韋后，摻合到新合成的腫瘤細胞DNA鏈中，使DNA鏈斷裂且抑制DNA聚合酶活性， 從而干擾DNA合成導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。另外一種是TK-GCV系統(tǒng)引發(fā)的"旁觀者效應(yīng)"，所 謂"旁觀者效應(yīng)"即是轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細胞被敏感藥物殺死的同時，周圍未被轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細胞 也被殺死的現(xiàn)象。HSV-TK/GCV系統(tǒng)通過這種獨特的自殺效應(yīng)或"旁觀者效應(yīng)"能選擇性地 殺死腫瘤細胞，保護正常組織細胞，從而避免傳統(tǒng)的化療等治療方法對人體帶來的傷害。自 1986年Moolten首先報道腺病毒介導(dǎo)的HSV-TK基因可使腫瘤獲得對某些藥物的敏感性以 來，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)將腺病毒介導(dǎo)的HSV-TK基因應(yīng)用于肝癌、胃癌、舌癌、前列腺癌、黑色 素瘤等實體瘤的基因治療的實驗研究，并取得了可喜進展。
[0005] 然而，HSV-TK的天然底物是細胞中廣泛存在的胸腺嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸。 因此，利用天然的tk基因作為腫瘤靶向基因治療的候選基因，在實際應(yīng)用中必然存在細胞 內(nèi)豐富的天然的胸腺嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸與GCV相互競爭TK活性部位的弊端。從而 在實際應(yīng)用中會減小GCV與TK的作用幾率而減弱其治療效果，或者為了達到預(yù)期的治療效 果而不得不增加GCV的劑量，增加治療成本和藥物的副作用。
[0006] 因此，采用天然的單純皰疹病毒胸苷激酶治療腫瘤，存在療效不佳、副作用大的弊 端。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種單純皰疹病毒胸苷激酶的突變體及其制備 方法和用途。
[0008] 本發(fā)明提供了一種如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。
[0009] 還提供了一種重組載體，它包含SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述的 重組載體是重組PET32質(zhì)?；蛘咧亟MpBES載體。
[0010] pBES載體，記載于專利號為ZL200710092976. 6的專利文件中。
[0011] 還提供了一種重組菌，它包含前述的重組載體。優(yōu)選地，所述的重組菌為重組大腸 桿菌或者重組雙歧桿菌。
[0012] 本發(fā)明單純皰疹病毒胸苷激酶突變體，它由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列編碼。 它的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種制備前述單純皰疹病毒胸苷激酶突變體的方法，包含如下步 驟：
[0014] i、取權(quán)利要求5所述的重組大腸桿菌組菌，接種到添加有終濃度為100μg/ml的 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C、250r/min搖床培養(yǎng)12h;
[0015] ii、取步驟i的菌液按I:100的接種量轉(zhuǎn)接至LA培養(yǎng)基中，37°C、200r/min搖床 中培養(yǎng)，至OD6tltl值達到0. 6?0. 8時，加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，37°C誘導(dǎo)表達5h;
[0016] iii、離心，得菌體，裂解，取上清，分離純化，即得。
[0017] 步驟iii中，所述分離純化采用His-tag磁珠純化試劑盒分離純化。
[0018] 本發(fā)明還提供了前述核苷酸序列重組載體、重組菌、單純皰疹病毒胸苷激酶突變 體在制備治療抗腫瘤藥物中的用途。
[0019] 本發(fā)明還提供了前述重組雙歧桿菌與更昔洛韋在制備聯(lián)合用藥物中的用途。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種聯(lián)合用藥物，它包含不同規(guī)格的單位制劑，用于同時、分別或 者依次給重組雙歧桿菌與更昔洛韋，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0021] 與天然的單純皰疹病毒胸苷激酶相比，本發(fā)明單純皰疹病毒胸苷激酶突變體 (mTK)，對GCV的代謝活性不變，而對天然胸腺嘧啶核苷酸代謝活性大幅度降低，用于腫瘤 治療時，一方面，減小了天然胸腺嘧啶核苷酸對mTK的競爭性干擾，增強了mTK與GCV的作 用機會，另一方面，其結(jié)果必然是在不增加GCV劑量的前提下，達到增強GCV殺傷癌細胞的 作用效果，減少藥物劑量和副作用，安全性好；本發(fā)明含有單純皰疹病毒胸苷激酶突變體 mtkl608基因片段的重組雙歧桿菌（雙歧桿菌-mTK1608)，與含有天然單純皰疹病毒胸苷激 酶基因片段的重組雙歧桿菌相比，抑制腫瘤的效果更佳，臨床應(yīng)用前景良好。
[0022] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1本發(fā)明中TK及其突變體蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果。說明：1、蛋白質(zhì)Marker; 2、pET32-TK全菌蛋白；3、純化的mTK1608;
[0024] 圖2本發(fā)明的mTK1608突變體對天然底物和GCV的代謝活性檢測結(jié)果。
[0025] 圖3本發(fā)明中制作的裸鼠直結(jié)腸癌（C〇1〇320)移植模型，說明1、首次注射PBS的 裸鼠；2、首次注射雙歧桿菌-TK的裸鼠；3、首次注射雙歧桿菌-mTK1608的裸鼠。
[0026] 圖4本發(fā)明中mTK1608作用實體瘤模型后凋亡標志物的Westernblot檢測結(jié)果。
[0027] 圖5本發(fā)明雙歧桿菌pBES_mtkl608/GCV治療系統(tǒng)治療裸鼠實體瘤模型后的效果 檢測。

【具體實施方式】
[0028] 實驗材料和試劑：
[0029]pBEX-LTB質(zhì)粒由重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室構(gòu)建；原核表達載 體pET32a，E.coliT0P10、E.coliBL21(DE3)由重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教 研室保存；雄性裸鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。T4連接酶，Taq普通酶，SalI， BamHI，蛋白質(zhì)Marker，DNAMarker，PlasmidMinikitI，Cycle-PureKit，膠回收試劑 盒，IPTG，卡那霉素，氨芐青霉素，BCA蛋白濃度測定試劑盒，PMSF等試劑。
[0030] 實施例1本發(fā)明單純皰疹病毒胸苷激酶突變體的制備
[0031] 1、重組表達
[0032]I. 1基因克隆
[0033]a、合成重組目的基因：
[0034] (1)天然tk基因：化學(xué)合成方法合成GenBank號為AB032875的HSV-Itk基因，其 核苷酸序列如SEQNO:1所示：
[0035] atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60 ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120 cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180 gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240 gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300 tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360 atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420 cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480 ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540 agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600 acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660 cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctagccg cgattcgccg cgtttacggg 720 ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780 cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840 cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900 aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960 cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020 ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080 atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaactg a 1131
[0036] (2)tk基因變異體1 :化學(xué)合成方法合成第160位氨基酸由異亮氨酸（I)突變?yōu)榱?氨酸（L)，第161位氨基酸由苯丙氨酸（F)突變?yōu)榱涟彼幔↙)，第167位由丙氨酸（A)突變 為酪氨酸（Y)，第168位由丙氨酸（A)突變?yōu)槔野彼幔╕)4個氨基酸殘基同時突變的突變體TK(I160L，F(xiàn)161L，A167Y，A168Y)，簡寫為mtkl608,其核苷酸序列如SEQΝ0:2 所示：
[0037] atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60 ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120 cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180 gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240 gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300 tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360 atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420 cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcctc 480 ttggaccgcc atcccatcta ctatctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540 agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600 acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660 cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctagccg cgattcgccg cgtttacggg 720 ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780 cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgcogagc cccagagcaa cgcgggccca 840 cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900 aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960 cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020 ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080
[0038] atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggGtaactg a 1131
[0039] 其氨基酸序列如SEQNO:4所示：
[0040] MASYPCHQHA SAFDQAARSR GHSNRRTALR PRRQQEATEV RLEQKMPTLL RVYIDGPHGM 60 GKTTTTQLLV ALGSRDDIVY VPEPMTYWQV LGASETIANI YTTQHRLDQG EISAGDAAW 120 MTSAQITMGM PYAVTDAVLA PHIGGEAGSS HAPPPALTLL LDRHPIYYLL CYPAARYLMG 180 SMTPQAVLAF VALIPPTLPG TNIVLGALPE DRHIDRLAKR QRPGERLDLA MLAAIRRVYG 240 LLANTVRYLQ GGGSWREDWG QLSGTAVPPQ GAEPQSNAGP RPHIGDTLFT LFRAPELLAP 300 NGDLYNWAW ALDVLAKRLR PMHVFILDYD QSPAGCRDAL LQLTSGMVQT HWTPGSIPT 360 ICDLARTFAR EMGEM 376
[0041] (3)tk基因變異體2 :化學(xué)合成方法合成第83位氨基酸由谷氨酸（E)突變?yōu)樘於?酰胺（N),第160位氨基酸由異亮氨酸（I)突變?yōu)榱涟彼幔↙)，第161位氨基酸由苯丙氨酸 (F)突變?yōu)榱涟彼幔↙)，第167位由丙氨酸（A)突變?yōu)槔野彼幔╕)，第168位由丙氨酸（A)突 變?yōu)槔野彼幔ǎ?5個氨基酸殘基同時突變的突變體11(伍831116(^，？16^167￥，4168￥)， 簡寫為mtk8360,其核苷酸序列如SEQNO:3所示：
[0042] atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60 ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120 cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180 gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240 gtacccaatc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 3GG tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360 atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420 cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcctc 480 ttggaccgcc atcccatcta ctatctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540 agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600 acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660 cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctagccg cgattcgccg cgtttacggg 720 ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780 cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840 cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900 aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 96G cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020 ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080 atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaactg a 1131
[0043] b、構(gòu)建重組表達載體
[0044] 分在在上述三個基因片段的其5-端添加BamHI酶切位點，3'端添加Sail酶 切位點，然后將合成的mtk8360基因片段克隆到pET32載體中，分別命名為pET32-tk、 pET32-mtkl608 和pET32-mtk8360。
[0045]c、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，制備重組菌
[0046] (1)將 20μ1 上述pET32-tk、pET32-mtkl608 和pET32-mtk8360 質(zhì)粒DNA分別與 50μIE.coli.ToplO感受態(tài)細胞混合，冰上放置30分鐘；
[0047] (2) 42°C熱休克90秒，立即冰浴1分鐘；
[0048] (3)取50μ1上述轉(zhuǎn)化菌液混勻后均勻涂布于LB(100ug/mLAmp)培養(yǎng)板，在恒溫 培養(yǎng)箱中37 °C倒置培養(yǎng)過夜。
[0049] (4)在LB培養(yǎng)板上挑選大小適中的菌落，通過菌落PCR初步篩選陽性克隆，之后提 取重組質(zhì)粒用BamHI和SalI做雙酶切鑒定。
[0050] (5)鑒定正確的質(zhì)粒公司測序。
[0051] 1. 2重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達
[0052](1)接種上述重組菌的單克隆于LB培養(yǎng)基（100μg/mlAmp)，37°C250r/min搖床 培養(yǎng)12h;
[0053] (2)將該菌液按I:100的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的LA培養(yǎng)基，在37°C搖床中繼續(xù)培 養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200r/min，用分光光度計進行實時檢測，當菌液0D_值達到0. 6?0. 8 (細菌對 數(shù)生長期）時加入IPTG，使其終濃度為0. 5mmol/L，37°C誘導(dǎo)表達5h。
[0054] (3)誘導(dǎo)表達的菌液在13000g下離心lOmin，棄掉上清，用細菌裂解液充分重懸菌 體，在室溫下裂解處理30min。
[0055] (4)通過離心分別收集菌液上清和沉淀，裂解處理后的標本通過12%SDS-PAGE進 行分析。
[0056] I. 3分離純化
[0057] (1)用His-tag磁珠純化試劑盒（蘇州海貍納米科技公司）中的試劑分別裂解 上述三個重組蛋白表達菌，2000rpm離心IOmin,上清液分別與Iml磁珠混合，室溫下作用 30min，置于磁性分離器分離，棄去上清液，用洗滌液洗磁珠lOmin，棄上清，用洗脫液洗滌 磁珠5min, 2000rpm離心IOmin,取上清（即純化的蛋白質(zhì)樣品），-2(TC保存?zhèn)溆脗溆谩?br> [0058] (2)將上述經(jīng)磁珠純化的重組蛋白進行SDS-PAGE檢測，確認分子量大小與理論預(yù) 測一致后，調(diào)整所有樣品的蛋白質(zhì)濃度一致，加入蛋白酶抑制劑，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0059] 2、測定
[0060] 2. 1突變體的活性檢測：
[0061] (1)將純化的TK，mTK1608,mTK8360各取200μg，分別與脫氧胸腺嘧啶核苷酸 (dTTP)，脫氧尿嘧啶核苷酸（dUTP)和GCV各200μg混合，定容到1000μ1，EP管用封口膜 密封后置于37°C水浴作用1小時。KKTC滅活lOmin，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0062] (2)將上述制備的樣品經(jīng)行離心處理（1200rpm，IOmin),取上清，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0063] (3)將上述制備的上清樣品稀釋為相當于0.5μ g/μ1、5.Oμ g/μ1和50μ g/μ1 三個稀釋度，用KromasilC18色譜柱，以甲醇-水（10:90)為流動相，流速0.8ml/min，檢 測波長252nm，柱溫25°C。
[0064] (4)比較各樣品的峰面積，以確定突變體蛋白與野生型TK對GCV和正常核苷酸的 作用力（即酶活力）。
[0065] 2. 2SDS-PAGE電泳
[0066] (1)將誘導(dǎo)表達的重組菌分別離心，將細菌沉淀和上清液分別與適量的裂解液混 合，煮沸處理5分鐘；
[0067] (2)將處理好的樣品滴加到SDS-PAGE的加樣孔，120V電泳至溴酚藍距離凝膠下端 5cm左右，停止電泳。
[0068] (3)染色，洗脫，檢測目的條帶。
[0069] 3、測定結(jié)果
[0070] 3.ISDS-PAGE分析
[0071] 如圖1所示，重組蛋白mTK1608的分子量大小與野生型TK一致，載體和重組菌構(gòu) 建成功。
[0072] 同時，泳道3可以見，凝膠中只顯示一條蛋白帶，表明分離純化所獲得的_ΤΚ1608 已得到純化。
[0073] 實驗結(jié)果說明，本發(fā)明分離得到了純品mmTK1608。
[0074] 3. 2 活性
[0075] 如下表1和圖2所示：
[0076]表ITK及其突變體作用不同底物后的底物殘留（峰面積）
[0077]

【權(quán)利要求】
1. 一種如SEQ ID NO :2所不的核苷酸序列。
2. -種重組載體，其特征在于：包含SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于：所述的重組載體是重組pET32質(zhì)粒 或者重組pBES載體。
4. 一種重組菌，其特征在于：它包含權(quán)利要求2或者3所述的重組載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于：所述的重組菌為重組大腸桿菌或者重 組雙歧桿菌。
6. -種單純皰疹病毒胸苷激酶突變體，其特征在于：它由SEQ ID NO :2所示的核苷酸 序列編碼。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的單純皰疹病毒胸苷激酶突變體，其特征在于：它的氨基酸序 列如SEQ ID NO :4所示。
8. -種制備權(quán)利要求6或7所述單純皰疹病毒胸苷激酶突變體的方法，其特征在于：包含如下步驟： i、 取權(quán)利要求5所述的重組大腸桿菌組菌，接種到添加有終濃度為100 y g/ml的氨芐 青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C、250r/min搖床培養(yǎng)12h ; ii、 取步驟i的菌液按1 :1〇〇的接種量轉(zhuǎn)接至LA培養(yǎng)基中，37°C、200r/min搖床中培 養(yǎng)，至〇D6QQ值達到0. 6?0. 8時，加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，37°C誘導(dǎo)表達5h ; iii、 離心，得菌體，裂解，取上清，分離純化，即得。
9. 權(quán)利要求1所述核苷酸序列、權(quán)利要求2或3所述重組載體、權(quán)利要求4或5所述重 組菌、權(quán)利要求6或7所述單純皰疹病毒胸苷激酶突變體在制備治療抗腫瘤藥物中的用途。
10. -種抗腫瘤藥物，其特征在于：它是以權(quán)利要求5所述重組雙歧桿菌為活性成分， 加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。
【文檔編號】C12N1/21GK104357466SQ201410629573
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月7日
【發(fā)明者】馬永平, 宋方洲, 唐偉 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)