極化cd4+t細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種極化CD4+T細(xì)胞的方法，包括以下步驟：得到CD4+T細(xì)胞；進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，加入SDF-1α和IL-2，刺激CD4+T細(xì)胞，培養(yǎng)1—8天，CD4+T細(xì)胞向Th1方向極化；或者進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，加入SDF-1α和IL-4，刺激CD4+T細(xì)胞，培養(yǎng)1—8天，CD4+T細(xì)胞向Th2方向極化。本發(fā)明通過(guò)IL-2或IL-4聯(lián)合SDF-1α誘導(dǎo)Th細(xì)胞極化方向，使CD4+T細(xì)胞向Thl或Th2方向極化。其中CXCR4與SDF-1α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能増強(qiáng)TCR介導(dǎo)的Thl和Th2細(xì)胞活化，Th極化方向受IL-2或IL-4與SDF-1α協(xié)同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
【專利說(shuō)明】極化CD4W細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種極化CD4+T細(xì)胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 化細(xì)胞極化是一個(gè)多信號(hào)參與的復(fù)雜過(guò)程，如TCR活化信號(hào)、輔助受體W及細(xì)胞 因子、趨化因子等，對(duì)其相關(guān)研究已逐步深入到轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控水平。國(guó)內(nèi)外 己有較多研究探討單一細(xì)胞因子或趨化因子對(duì)化細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)機(jī)制。己有研究表明，外 源性IL-2或IL-4可使CD4+T前體細(xì)胞向Thl或化2細(xì)胞極化，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激發(fā)有賴 結(jié)合于受體胞內(nèi)域的非受體型蛋白酪氨酸激酶（Syk、ZAP70等）。CXCR4是Thl細(xì)胞和化2 細(xì)胞均表達(dá)的趨化因子受體，其配體為SDF-I a (基質(zhì)細(xì)胞源因子）（或CX化12)，二者結(jié)合 不僅可促T細(xì)胞遷移，還可提供T細(xì)胞共刺激和極化信號(hào)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的極化CD4+T細(xì)胞的方法。
[0004] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0005] 一種極化CD4+T細(xì)胞的方法，包括W下步驟：
[000引 得到CD4+T細(xì)胞；
[0007] 進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，加入SDF-I a和rhIL-2,刺激CD4+T細(xì)胞，培養(yǎng)1一8天，CD4+T細(xì)胞 向Thl方向極化。
[0008] 或者，包括W下步驟：
[000引 得到CD4+T細(xì)胞；
[0010] 進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，加入SDF-I a和IL-4,刺激CD4+T細(xì)胞，培養(yǎng)1一8天，CD4+T細(xì)胞向 Th2方向極化。
[0011] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)CD4+T細(xì)胞細(xì)胞密度為2xlO^L，0. 5ml/孔，所 述SDF-I a的加入量為50-100ng，所述rhlk2的加入量為5-lOng。
[0012] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)CD4+T細(xì)胞細(xì)胞密度為2xl(yVL，0. 5ml/孔，所 述SDF-I a的加入量為50-100ng，所述rhlk4的加入量為5-lOng。
[0013] 本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究積累，發(fā)現(xiàn)通過(guò)聯(lián)合細(xì)胞因子和趨化因子協(xié) 同作用使化細(xì)胞進(jìn)行極化。W往的研究表明，外源性IL-2可使CD4+T前體細(xì)胞向Thl細(xì) 胞極化；外源性IL-4可使CD4+T前體細(xì)胞向化2細(xì)胞極化。SDF-I a可提供T細(xì)胞共刺激 和極化信號(hào)。但單一細(xì)胞因子或趨化因子并不代表整個(gè)機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)，僅能作為其中一部 分，細(xì)胞因子和趨化因子間也存在交互作用。而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，單純使用IL-2或者IL-4極 化CD4+T前體細(xì)胞不能提供其所需的共刺激和極化信號(hào)，因此聯(lián)合細(xì)胞因子和趨化因子共 同調(diào)節(jié)化細(xì)胞極化具有重要意義，通過(guò)二者聯(lián)合使用，可W使CD4+T前體細(xì)胞表達(dá)趨化因 子受體，并與其配體SDF-I a結(jié)合，從而順利完成極化過(guò)程。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞IFN-YmRNA(A)和比-4mRNA做表達(dá)，其中圖 A.圓形；標(biāo)準(zhǔn)DNA模板
[0015] H角形；resting CB CD4+T 細(xì)胞
[001引菱形；經(jīng)比-2 (lOug/L)和SDF-I a (lOOug/L)刺激的細(xì)胞 [0017]方形：經(jīng) IL-4(10ug/L)和 SDF-I a (lOOug/L)刺激的細(xì)胞 [001引圖B.圓形；標(biāo)準(zhǔn)DNA模板
[0019] 方形；resting CB CD4+T 細(xì)胞
[0020] 菱形；經(jīng)比-2 (lOug/L)和 SDF-I a (lOOug/L)刺激的細(xì)胞
[0021] H角形：經(jīng)比-4(10ug/L)和 SDF-I a (l〇〇ug/L)/CX化12 刺激的細(xì)胞；
[0022] 圖2為比-2/比-4和SDF-I a協(xié)同誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞Syk和ZAR70的磯酸化。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 1. CD4+T細(xì)胞的獲得
[00巧]1. 1取新鮮廝帶血（肝素抗凝20u/ml)+生理鹽水照1 ;1稀釋；
[0026] 1. 2在50ml離也管中預(yù)先加入淋己細(xì)胞分離液15ml，再加入稀釋好的廝帶血 25ml ；
[0027] 1. 3小也的將稀釋后的血液加到分離液的上面；
[0028] 1.4 離也；轉(zhuǎn)速；1500r/min，溫度 20°C- 28°C，時(shí)間；20min ;
[0029] I. 5離也管內(nèi)順次為血漿---單個(gè)核細(xì)胞層一一分離液一一紅細(xì)胞；
[0030] 1. 6用移液管吸出單個(gè)核細(xì)胞層，重息于2-5倍體積的生理鹽水中；
[00引]1. 7 離也：轉(zhuǎn)速：2000 - 2300r/min，時(shí)間；lOmin，溫度；4°C ;
[0032] 1.8離也后，棄上清液，細(xì)胞沉淀重息于Iml完全培養(yǎng)基中（含10% FCS的 RPM-1640 培養(yǎng)液）。
[0033] 2. (SD巧?1 a (基質(zhì)細(xì)胞源因子）聯(lián)合IL-2^L-4極化CD4+T細(xì)胞
[0034] 2. 1調(diào)整細(xì)胞密度為2x1〇7L，放入48孔培養(yǎng)板，0. 5ml/孔；
[0035] 2. 2分8組給予刺激，分別為
[0036] rh比-2(5ng/孔）；
[0037] rh比-4 (5ng/孔）；
[0038] rh比-2 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）；
[0039] rh比-4 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）；
[0040] rh比-2 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 化加g/ 孔）；
[0041] rh比-4 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 化加g/ 孔）；
[0042] rh比-2 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 的二抗化加g/ 孔）；
[0043] rh比-4 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 的二抗化加g/ 孔）。
[0044] 2. 337°C，5% C〇2的飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，于培養(yǎng)第1，2, 4, 8天收集細(xì)胞用 于檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子。
[0045] 3.檢測(cè)CD4+T細(xì)胞極化狀態(tài)
[0046] 3. I流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Thl和Th2型細(xì)胞因子表達(dá)
[0047] 將收集的細(xì)胞分為兩組，用IntraPrepTM(Coulte-ImmunoTech公司）試劑盒固定 細(xì)胞后，第1組加入鼠抗人IFN-Y抗體，室溫賠育15min，PBS洗涂2次后，加入FITC標(biāo)記 的羊抗鼠二抗室溫賠育15min。第2組加入鼠抗人比-4抗體，室溫賠育15min，PBS洗涂2 次后，加入PE標(biāo)記的羊抗鼠抗體室溫賠育15min。再次洗涂細(xì)胞，加入含0. 5%甲酵的PBS 制成細(xì)胞息液，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)。
[0048] 流式細(xì)胞結(jié)果表明，rhIL-2+SDF-l a刺激后，CD4+T細(xì)胞分泌IFN- Y逐漸増加， 呈時(shí)間依賴性，第8天最多，為胞內(nèi)細(xì)胞因子的84. 0%;IL-4分泌逐漸減少，第8天最少，為 0. 2%。而在rhIL-2+SDF-la+Ab(CXCR4小鼠單抗）協(xié)同刺激情況下，IFN-Y分泌逐漸減 少，第8天最少，為0.4% ;IL-4分泌亦逐漸減少，第8天最少，為1.6%。rhIL-4+SDF-la 刺激后，CD4+T細(xì)胞分泌IL-4逐漸増加，第8天最多，為90. 3% ;IFN- Y分泌逐漸減少，第 8天最少，為0. 1 %。rhIL-4+SDFla+Ab (CXCR4小鼠單抗）協(xié)同刺激情況下，IL-4分泌逐漸 減少，第8天最少，為0.6% ;IFN-Y分泌百分比逐漸減少，第8天最少，為2. 8%。
[0049] 3. 2實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)胞內(nèi)Thl和化2型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)
[0050] 2xl06個(gè)新鮮分離CD4+T細(xì)胞提取總RNA，寡聚d (T) 12-18和SuperscriptII逆轉(zhuǎn) 錄酶反轉(zhuǎn)錄RNAW合成cDNA第一鏈，實(shí)時(shí)定量RT-PCR在ABIPRISM7700SequenceDetector Systems (Pekin Elmer Applied Bi-systems)中完成。
[0051] IFN- Y和比-4的特異性引物為：
[0052] IFN-Y sense:5-TGTAAGCCCCCA GAA-ACA-GAAAG-3,（沈Q ID NO. 1);
[0053] IFN-yantisense:5-TTGCCCATCA AGA AACAGCAG-3'（沈Q ID NO. 2);
[0054] n^-4sense:5-TCACTCTTCACTCTTTTCTTCCCC-3>GEQIDN0.3);
[00巧]IL-4antisense:5-TCTTCCCACTTTGCTGTTCCT-3'(沈Q ID NO. 4);
[0056] 目 actin sense:5-TCCTGTGGCATCCA CGAAACT-3'（沈Q ID NO. 5);
[0057] 目 antisense:5-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3,（沈Q ID NO. 6)。
[0058] 擴(kuò)増條件：5(TC 2min，95°C 10min，93°C 20s，40 個(gè)循環(huán)。
[0059] 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)新鮮分離的CD4+T細(xì)胞內(nèi)IFN- Y和比-4mRNA表達(dá)分別為 7. 3X102 和 2. 1X103 拷貝；rhIL-2+SDF-l a 刺激后 8d 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) IFN-YmRNA 為 1. 0x104 拷貝，rh比-4mRNA為3. 6X102拷貝；rh比-4+SDF-1 a刺激后8d細(xì)胞內(nèi)比-4mRNA約為 1. 3X104, IFN- Y mRNA 為 7.細(xì)101 拷貝（圖 1)。
[0060] 3. 3比-2/比-4單獨(dú)W及比-2/lk4聯(lián)合SDF-I a誘導(dǎo)Syk和ZAP-70磯酸化
[0061] ImlT肥緩沖液分別裂解步驟2中經(jīng)過(guò)rh比-2/rh比-4 W及rh比-2/rh比-4聯(lián)合 SDF-Ia協(xié)同誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞（細(xì)胞密度5x109/1)，離也（l〇〇〇〇r/min，5min)，取上清， 分別加入加g抗人Syk(e20)和ZAP-70(LR)抗體（Santa Cruz BioTech公司）4°C賠育比， 12%聚丙帰醜胺凝膠電泳。
[0062] 免疫復(fù)合物激酶分析；Syk, ZAP-70抗體免疫沉淀后，T肥緩沖液洗涂5遍，激酶緩 沖液洗涂4遍，然后重息到20ul (含IOul Y -32P) ATP激酶緩沖液中，室溫賠育30min后終 止反應(yīng)?；旌衔镏蠓?min，8% SDS-PAGE電泳，放射自顯影。
[0063] 免疫印跡：蛋白質(zhì)進(jìn)行12%聚丙帰醜胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上， 5% BSA-TBS中封閉過(guò)夜，棄封閉液，分別加入Syk、ZAF70抗體，37 C賠育比，IxTBS洗涂 10minx3 次，再加入[y-125I]p;rotein A(肥N Life Sciences 公司）37°C賠育 lh，lxTBS 洗 涂IOmin巧次，放射自顯影。
[0064] 免疫復(fù)合物激酶分析和免疫印跡顯示在IL-2和SDF-I a協(xié)同誘導(dǎo)30min后，Syk 即發(fā)生弱磯酸化，8d后Syk磯酸化明顯加強(qiáng)而穩(wěn)定；而單一 IL-2或SDF-I a刺激不能誘導(dǎo) Syk磯酸化（圖2A)。比-4和SDF-I a協(xié)同誘導(dǎo)ZAF70磯酸化的效應(yīng)與比-2和SDF-I a 協(xié)同誘導(dǎo)Syk磯酸化的作用相似，單一 IL-4或SDF-I a刺激亦不能誘導(dǎo)ZAP70磯酸化（圖 沈)。
[0065] W上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干變形和改進(jìn)，該些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)W所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種極化⑶4+T細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： 得到⑶4+T細(xì)胞； 進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，加入SDF-1 a和rhIL-2,刺激⑶4+T細(xì)胞，培養(yǎng)1一8天，⑶4+T細(xì)胞向Thl 方向極化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的極化CD4+T細(xì)胞的方法，其特征在于，進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)CD4+T細(xì)胞 細(xì)胞密度為2x109/L，0. 5ml/孔，所述SDF-1 a的加入量為50-100ng，所述rhIL-2的加入量 為 5-lOng。
3. -種極化⑶4+T細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： 得到⑶4+T細(xì)胞； 進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，加入SDF-1 a和IL-4,刺激⑶4+T細(xì)胞，培養(yǎng)1一8天，⑶4+T細(xì)胞向Th2 方向極化。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的極化CD4+T細(xì)胞的方法，其特征在于，進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)CD4+T細(xì)胞 細(xì)胞密度為2xl09/L，0. 5ml/孔，所述SDF-1 a的加入量為50-100ng，所述rhIL-4的加入量 為 5-lOng。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK104357392SQ201410629285
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月7日
【發(fā)明者】鄒漢東, 于兆學(xué), 夏凡 申請(qǐng)人:廣州潔漢貿(mào)易有限公司