專(zhuān)利名稱(chēng)：用于循環(huán)性巨噬細(xì)胞的性質(zhì)確定和/或分類(lèi)的方法以及施行該方法的分析安排的制作方法
用于循環(huán)性巨噬細(xì)胞的性質(zhì)確定和/或分類(lèi)的方法以及施
行該方法的分析安排本分案申請(qǐng)是基于申請(qǐng)?zhí)枮?3816702.6，申請(qǐng)日為2003年6月2日，發(fā)明名稱(chēng)為 “用于循環(huán)性巨噬細(xì)胞的性質(zhì)確定和/或分類(lèi)的方法以及施行該方法的分析安排”的原始中 國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及通過(guò)非細(xì)胞自身抗原的用于循環(huán)性巨噬細(xì)胞的性質(zhì)確定和/或分類(lèi) 的方法，以及施行這樣的方法的分析安排。從 Sinha, Wi1 son, Gleason Immunoelectron microscopiclocation of prostatic-specific antigen in human prostate by theprotein A—gold complex, Cancer, 1987,60,1288-91中已知，來(lái)自前列腺組織的細(xì)胞的電子顯微鏡檢查的實(shí)施，其中 根據(jù)所引用的文獻(xiàn)將前列腺的正常組織、前列腺癌組織和前列腺增生組織與金標(biāo)記的PSA 抗體進(jìn)行溫育。檢查表明金顆粒存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)顆粒、RES和溶酶體中。隨著增加的 腫瘤的終末分化，更多的金顆粒出現(xiàn)在膜結(jié)構(gòu)中。這認(rèn)為是下列情況的標(biāo)志，即PSA(前列 腺特異性抗原)隨著增加的腫瘤細(xì)胞的終末分化而存留于膜結(jié)構(gòu)中。該檢查的另一個(gè)方面 為在粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中同樣檢測(cè)出金顆粒。在流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢查中，在循環(huán)血中發(fā)現(xiàn)PSA陽(yáng)性的細(xì)胞。但是在之前已知的 檢查中，只有巨噬細(xì)胞的表面因PSA而被染上顏色。在巨噬細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PSA分子的mRNA這一事實(shí)導(dǎo)致這樣的單一結(jié)論，即只吸 收了 PSA分子，而不涉及消除微轉(zhuǎn)移。參見(jiàn)Brandt，Griwatz, Brinkmann Circulating prostate-specific antigen/CD14-double-positive cells ；abiomarker indicating low risk for hematogeneousmetastasis of prostate cancer, J. Natl. Cancer Inst.1997 ； 89，174。眾所周知，聚集在較有序或較無(wú)序的細(xì)胞群中的組織組成細(xì)胞的惡性變化稱(chēng)為腫 瘤。這些腫瘤細(xì)胞無(wú)視組織的排列，無(wú)限制地生長(zhǎng)，和通過(guò)大小的增加以及浸潤(rùn)入其他的周 圍組織、器官中而擴(kuò)張，或者跨越組織界限而進(jìn)入血管系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)中。一旦腫瘤到達(dá)血管系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)，那么此處的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群會(huì)通過(guò)這些系 統(tǒng)游離開(kāi)，并作為子腫瘤即轉(zhuǎn)移灶而在身體的其他部位附著。在此存在這樣的危險(xiǎn)，即轉(zhuǎn)移 灶繼續(xù)生長(zhǎng)并掠奪身體的能量，直至身體衰亡和被其疾病所擊倒。在這種腫瘤的形成期間，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生用于促進(jìn)其生長(zhǎng)的物質(zhì)。另外，可作為腫瘤 生長(zhǎng)指示物的物質(zhì)可被釋放出來(lái)。后者稱(chēng)為腫瘤標(biāo)記。但是這些標(biāo)記對(duì)于腫瘤不是特異的， 而只有血液中所測(cè)量的濃度的數(shù)量，因?yàn)榻】档募?xì)胞也能夠釋放這些物質(zhì)。因此，腫瘤標(biāo)記 不能用于檢測(cè)腫瘤，而只能用于疾病或治療過(guò)程的監(jiān)測(cè)。腫瘤的一個(gè)特殊標(biāo)記為前列腺特 異性抗原(PSA)，從血液中的一定濃度開(kāi)始其就表明有前列腺癌。但是，前列腺的良性增大 也可以引起血液中PSA值的升高。迄今，腫瘤疾病主要通過(guò)給出圖像的方法來(lái)診斷，例如超聲波或計(jì)算機(jī)斷層攝影 術(shù)、乳腺造影法等等。可是，只有根據(jù)含有腫瘤的組織樣品才能作出最終的確定，并確定治 療過(guò)程。
腫瘤疾病引起人體自身的免疫系統(tǒng)的對(duì)抗。這種免疫系統(tǒng)由一系列執(zhí)行不同任務(wù) 的不同細(xì)胞類(lèi)型組成。其中，巨噬細(xì)胞具有這樣的任務(wù)，即識(shí)別某些病樣物質(zhì)，吞噬之，并將 其分解成其組分。隨后，將被吞噬的細(xì)胞的片段呈遞在其他免疫細(xì)胞的表面上，因此這使得 能夠識(shí)別應(yīng)當(dāng)進(jìn)攻的結(jié)構(gòu)。存在迫切的需求以在早期階段施行循環(huán)性巨噬細(xì)胞的性質(zhì)確定，而無(wú)須進(jìn)行人體 的直接檢查。本發(fā)明的任務(wù)在于提供使得能夠施行循環(huán)性巨噬細(xì)胞(PBMC)的性質(zhì)確定和/或 分類(lèi)的方法以及分析安排。根據(jù)本發(fā)明，由于能夠在循環(huán)性巨噬細(xì)胞中檢測(cè)被吞噬的腫瘤細(xì)胞的抗原或片 段，因此能夠施行直接和特異的腫瘤檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明，抽取全血樣品，隨后進(jìn)行梯度離心以分離巨噬細(xì)胞。然后將巨噬細(xì)胞 穿孔，并施行使用至少一種經(jīng)挑選的抗體的細(xì)胞內(nèi)染色。隨后，使用本身已知的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)以在單一水平上記錄細(xì)胞性質(zhì)。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)使得能夠在液體流中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分析細(xì)胞的物理和分子性 質(zhì)。具體地而言，借助于熒光染料標(biāo)記的試樣如抗體而在單一水平上測(cè)定細(xì)胞或細(xì)胞群體 的性質(zhì)并記錄。在此，使用熒光染料標(biāo)記的抗體的抗原-抗體反應(yīng)是基礎(chǔ)。為了分析，將單個(gè)懸浮 液的細(xì)胞通過(guò)流體動(dòng)力聚焦(hydrodynamischeFokussierung)導(dǎo)向具有合適波長(zhǎng)的激光 束。在通過(guò)單色激光束相應(yīng)地激發(fā)熒光染料的電子時(shí)，這些電子躍遷至較高的能量水平。在 激光脈沖之后，電子返回其初始水平，同時(shí)以光子的形式釋放出能量。用光檢測(cè)器記錄下的 所述發(fā)射出的光子密度與每個(gè)細(xì)胞所結(jié)合的抗體數(shù)量成比例。另外，通過(guò)光衍射和散射可 進(jìn)一步獲得關(guān)于細(xì)胞大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)即細(xì)胞質(zhì)的顆粒性以及細(xì)胞核大小的信息。使用前列腺特異性抗原、細(xì)胞角蛋白抗體和/或上皮膜抗原作為經(jīng)挑選的抗體。然后根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)在巨噬細(xì)胞中進(jìn)行PSA抗體染色就能夠確定被吞噬的物質(zhì) 是否與前列腺相關(guān)。用于施行該方法的分析安排包括用于肝素化所抽取的血液的試劑、用于分離巨噬 細(xì)胞的梯度離心機(jī)、用于細(xì)胞穿孔的試劑、用于使用熒光染料標(biāo)記的抗體對(duì)經(jīng)預(yù)處理的細(xì) 胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色的裝置和用于測(cè)定各自分離并經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)并且具有 計(jì)算機(jī)支持的評(píng)價(jià)單元的流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x，該分析安排用于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的目的。在下文中將依靠實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。在血液抽取和染色的步驟中，從例如6ml全血開(kāi)始進(jìn)行肝素化。借助于梯度離心 分離單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。在下一步驟中，進(jìn)行細(xì)胞的甲醛固定和皂草苷處理以達(dá)到穿孔的目的。隨后是使用例如下表中的經(jīng)挑選的抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色的步驟。PSA 抗體 Ab-I (Clone ER-PRS)全細(xì)胞角蛋白-FITC上皮膜抗原(CloneE 29)同型對(duì)照 IgGl (Clone DAK-GO1)第二抗體FITC山羊抗小鼠(DAKO)
然后，將相應(yīng)的直到分析才再次固定的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行更詳細(xì)的檢查。選通單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，即只有一部分測(cè)量結(jié)果用于評(píng)價(jià)，并進(jìn)行預(yù)選擇。然后，通過(guò)柱狀圖分析來(lái)評(píng)價(jià)同型對(duì)照和染色，并給出例如以百分比表示的陽(yáng)性 細(xì)胞數(shù)量。其表明，對(duì)于患有擴(kuò)散型前列腺瘤的患者，當(dāng)用細(xì)胞角蛋白進(jìn)行巨噬細(xì)胞的染色 時(shí)，在相應(yīng)的人的循環(huán)免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)組織細(xì)胞的組成結(jié)構(gòu)部分。因?yàn)檫@些組成成分不是 免疫細(xì)胞的原始內(nèi)容物，所以他們一定是通過(guò)吞噬作用而被納入的。由于細(xì)胞角蛋白的納 入曲線過(guò)程明顯與同型的不同，因此可以排除非特異的作用。巨噬細(xì)胞中的PSA染色證明，經(jīng)吞噬的物質(zhì)一定與前列腺組織相關(guān)，因?yàn)樵撎禺?性標(biāo)記也是可檢測(cè)的?？傊?，通過(guò)使用所述的方法和附屬的分析安排，能夠得到用于循環(huán)性巨噬細(xì)胞的 性質(zhì)確定和分類(lèi)的新型方法，其中分類(lèi)使得能夠指出可能的前列腺相關(guān)內(nèi)容物。
權(quán)利要求
用于循環(huán)性巨噬細(xì)胞和/或外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的性質(zhì)確定和/或分類(lèi)的方法，其具有下列步驟-抽取全血以及進(jìn)行梯度離心以分離巨噬細(xì)胞，-將巨噬細(xì)胞穿孔，-用至少一種經(jīng)挑選的抗體進(jìn)行所述細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)染色，以及-進(jìn)行所述經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)量分析，并隨后對(duì)于更多的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)，
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，使用前列腺特異性抗原(PSA)、細(xì)胞角蛋白和 /或上皮膜抗原作為所述經(jīng)挑選的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，在施行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)之后進(jìn)行同型對(duì)照 和染色的柱狀圖分析。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其用于在人體外檢測(cè)通過(guò)吞噬作用而納 入的擴(kuò)散型前列腺瘤的組織細(xì)胞部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，通過(guò)所述巨噬細(xì)胞中的所述PSA染色確定被吞 噬的物質(zhì)是否與前列腺相關(guān)。
6.用于施行根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法的分析安排，其包括用于肝素化 所抽取的血液的試劑、用于分離巨噬細(xì)胞的梯度離心機(jī)、用于細(xì)胞穿孔的試劑、用于使用熒 光染料標(biāo)記的抗體對(duì)所述經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色的裝置和用于測(cè)定各自分離并 經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)并且具有計(jì)算機(jī)支持的評(píng)價(jià)單元的流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x，該分析 安排用于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的目的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于循環(huán)性巨噬細(xì)胞的性質(zhì)確定和/或分類(lèi)的方法以及分析安排。將抽取的全血進(jìn)行梯度離心以分離巨噬細(xì)胞。然后將巨噬細(xì)胞穿孔，并施行使用至少一種經(jīng)挑選的抗體的細(xì)胞內(nèi)染色。然后，經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析使得能夠進(jìn)行隨后的細(xì)胞內(nèi)容物的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)。選擇PSA、細(xì)胞角蛋白和/或上皮膜抗原作為抗體。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101813694SQ20091020885
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2003年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月26日
發(fā)明者拉爾夫·赫維希 申請(qǐng)人:拉爾夫·赫維希