專利名稱：針對粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的抗體的制作方法
針對粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的抗體相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2008年4月28日提交的美國第61/048，522號臨時申請的權(quán)益，該 申請通過引用的方式并入本文中。發(fā)明背景 “粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) ”是在響應(yīng)多種炎癥介質(zhì)時由存在于造 血環(huán)境和炎癥外周部位的細胞產(chǎn)生的小糖蛋白。GM-CSF能夠刺激來自骨髓細胞的嗜中性粒 細胞、巨噬細胞以及混合的粒細胞-巨噬細胞集落的產(chǎn)生，并且能夠刺激來自胎兒肝臟祖 細胞的嗜酸性集落的形成。GM-CSF還能夠刺激成熟粒細胞和巨噬細胞的功能性活動，以及 抑制粒細胞和巨噬細胞的凋亡。已提出GM-CSF在多種疾病的發(fā)病機理中起作用。因此需要靶向GM-CSF的額外治 療。本發(fā)明提供了改良的抗-GM-CSF抗體，例如，用于治療GM-CSF為致病機制的一部分的疾病。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了抗-GM-CSF抗體，例如，人工程化的(humaneered)抗體， 以及利用所述抗體治療疾病的的方法，對這些疾病而言，抑制GM-CSF受體信號傳導(dǎo)是理 想的。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了抗-GM-CSF抗體，其包括含⑶R3結(jié)合特 異性決定簇RQRFPY或RDRFPY、J節(jié)段和V-節(jié)段的重鏈可變區(qū)，其中J-節(jié)段包含與人 JH4 (YFDYffGQGTLVTVSS)至少95%的一致性，以及V-節(jié)段包含與人種系VHl 1-02或VHl 1-03序列至少90%的一致性；或者含⑶R3結(jié)合特異性決定簇的重鏈可變區(qū)，該特異性決 定簇包括RQRFPY。在一些實施方案中，J節(jié)段包含YFDYWGQGTLVTVSS。在一些實施方案中， CDR3包含RQRFPYYFDY或RDRFPYYFDY。在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)CDRl或CDR2能夠 是人種系VHl序列；或者⑶Rl和⑶R2能夠是人種系VHl。在一些實施方案中，抗體包含人 重鏈可變區(qū)⑶Rl或⑶R2，或者⑶Rl和⑶R2兩者，如在

圖1中列出的Vh區(qū)所示。在一些實 施方案中，本發(fā)明的抗體的V-節(jié)段具有圖1所示的Vh V節(jié)段序列。在一些實施方案中，本 發(fā)明的抗體包含的Vh具有圖1列出的VH# 1，VH#2, VH#3, VH#4或VH#5序列。本發(fā)明還提供了例如，具有上段中描述的重鏈可變區(qū)的抗-GM-CSF抗體，，其中該 抗體包括含⑶R3結(jié)合特異性決定簇FNK或FNR的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，這種 抗體包含人種系JK4區(qū)。在一些實施方案中，抗體八區(qū)⑶R3包含QQFN(K/R)SPLT.，例如 QFNKSPLT。在一些實施方案中，輕鏈可變區(qū)包含圖1所示的八區(qū)的⑶Rl或⑶R2，或者⑶Rl 和⑶R2兩者。在一些實施方案中，\區(qū)包含與圖1所示的VKIIIA27V節(jié)段序列具有至少 95% —致性的V節(jié)段。在一些實施方案中，Vl區(qū)具有圖1所示的VH#1，VH#2, VH#3或VH#4 序列。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體的單價親和力優(yōu)于約ΙΟηΜ，經(jīng)常優(yōu)于(低于) 約500pM或優(yōu)于約50pM，這通過在37°C進行的表面等離子共振分析來測定，所述抗體例如 具有選自圖1中的Vh區(qū)序列區(qū)序列以及選自圖1中的八區(qū)序列的\區(qū)。因此，在一 些實施方案中，本發(fā)明的抗體的親和力(如利用表面等離子共振測量的)低于50pM，通常低于約25pM，或甚至低于約ΙΟρΜ。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗-GM-CSF具有慢解離速 率，對于與GM-CSF的單價相互作用，通過在37°C的表面等離子共振分析測定的解離速率常 數(shù)(kd)低于約ΙΟ 優(yōu)選低于5x IO-5S-1,以及最優(yōu)選低于ΙΟ、—1。在一些實施方案中，本 發(fā)明的抗體的解離速率比在相同條件下測定的參考嵌合C19/2單克隆抗體慢2至3倍，但 在測量GM-CSF活性的基于細胞測定中，中和GM-CSF活性的效能比參考抗體的效能大至少 6-10 倍。

在一些實施方案中，具有本文所述的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的本發(fā)明的抗 體是IgG。在一些實施方案中，重鏈具有恒定區(qū)，該恒定區(qū)具有SEQ ID N0:11的序列。在 一些實施方案中，輕鏈恒定區(qū)是具有SEQ ID N0:10所示序列的κ輕鏈。在一些實施方 案中，本發(fā)明的抗體具有SEQ ID NO :11所示的重鏈恒定區(qū)、具有SEQ ID N0:10所示序列 的輕鏈κ恒定區(qū)以及選自圖1所示的重和輕鏈可變區(qū)的重鏈和輕鏈可變區(qū)，例如，抗體重 鏈和輕鏈可變區(qū)包含來自圖1所列序列的下述組合的一個a)VH#2，VK#3 ；b)VH#l, VK#3 ； c)VH#3, VK#1 ；d) VH#4, VK#3 ；e)VH#4, VK#4 ；f) VH#4, VK#2 ；g) VH#5, VK#1 ；h) VH#5, VK#2 ；i) VH#3,VK#4 ；或j)VH#3，VL#3)。結(jié)合本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到本發(fā)明的抗體能 夠選自圖1所列的Vh區(qū)和\區(qū)的任一組合。 在一些實施方案中，Vh區(qū)或八區(qū)序列，或者Vh區(qū)和\區(qū)兩者氨基酸序列都在N末 端包含甲硫氨酸。在另外方面，本發(fā)明提供了治療患者的方法，所述患者患有其中抑制GM-CSF是理 想的疾病，該方法包括給予患者治療有效量的前述權(quán)利要求中任一項的抗體。在一些實施 方案中，所述患者患有骨質(zhì)減少癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、多發(fā)性硬化、銀屑病、慢性阻塞 性肺疾病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、阿耳茨海默氏病、心衰、缺血事件導(dǎo)致的心肌缺損或 糖尿病。附圖簡述圖1提供了抗GM-CSF抗體的示例性的Vh區(qū)或\區(qū)序列。圖2.通過在37°C的表面等離子共振分析(Biacore 3000)測定的GM-CSF與 Abl(A)或Ab2(B)的結(jié)合。Abl和Ab2被捕獲在Biacore芯片上固定的抗Fab多克隆抗體上。 如所顯示的，不同濃度的GM-CSF注射在表面上方。假定1 1相互作用，使用Scrubber2 軟件進行整體擬合分析(Global fit analysis)。圖3. Abl和Ab2與糖基化的和非糖基化的GM-CSF結(jié)合。通過ELISA測定與人293 細胞表達的糖基化的GM-CSF或大腸桿菌(E.coli)中表達的非糖基化的GM-CSF的結(jié)合。 顯示了來自單次試驗的代表性的結(jié)果(試驗1)。將從1500ng/ml開始的Abl和Ab2的兩 倍稀釋液應(yīng)用到GM-CSF包被的孔中。每一點代表一式三份測定的平均值士標準誤。利用 Prism 5. 0 軟件(Graphpad)進行 Sigmoidal 曲線擬合。圖4.證實Abl和Ab2與共享表位結(jié)合的競爭性ELISA。用50ng/孔重組GM-CSF 包被的ELISA板用不同濃度的抗體(Ab2、Abl或同種型對照抗體)以及50nM生物素化Ab2 孵育。利用中性親和素(neutravidin)-HRP偶聯(lián)來測定生物素化的抗體結(jié)合。對與GM-CSF 的結(jié)合的競爭進行1小時(A)或進行18小時(B)。每一點代表一式三份測定的平均值士 標準誤。利用Prism 5. O軟件(Graphpad)進行Sigmoidal曲線擬合。圖5. GM-CSF誘導(dǎo)的IL-8表達的抑制。不同量的每種抗體與0. 5ng/ml GM-CSF孵育，以及與U937細胞孵育16小時。通過ELISA測定分泌到培養(yǎng)物上清的IL-8。發(fā)明詳述如本文所用的，“抗體”指蛋白，該蛋白在功能上被定義為結(jié)合蛋白，在結(jié)構(gòu)上被定 義為包含氨基酸序列，該序列被本領(lǐng)域技術(shù)人員公認為來自產(chǎn)生抗體的動物的免疫球蛋白 編碼基因的框架區(qū)?？贵w能夠由一個或多個基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片 段編碼的多肽組成。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因， 以及多種免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為Y、μ、α、δ或ε，其依 次分別定義免疫球蛋白類型IgG，IgM, IgA, IgD和IgE。已知典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位包含四聚體。每個四聚體由兩對完全相 同的多肽鏈組成，每對具有一條“輕”(約25kD)和一條“重”鏈(約50-70kD)。每條鏈的 N末端確定了約100-110或更多的氨基酸的可變區(qū)，其主要負責(zé)抗原識別。術(shù)語可變輕鏈 (Vl)和可變重鏈(Vh)分別指這些輕鏈和重鏈。此處使用的術(shù)語“抗體”還包括保留結(jié)合特異性的抗體片段。例如，有許多表征清 楚的抗體片段。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)的二硫鍵近C-端消化抗體，以產(chǎn)生F(ab) ! 2，F(xiàn)ab的二聚體，該二聚體自身是通過二硫鍵連接到VH-CHl的輕鏈。該F(ab) ! 2能夠在 溫和條件下被還原，以破壞在鉸鏈區(qū)的二硫鍵，從而將(Fab' )2 二聚體轉(zhuǎn)化為Fab'單體。 該Fab'單體本質(zhì)上是帶有部分鉸鏈區(qū)的Fab(對于其他抗體片段的更具體的描述，參見 Fundamental Immunology (基礎(chǔ)免疫學(xué)),W. E. Paul, ed.，Raven Press, N. Y. (1993))。盡 管根據(jù)完整抗體的消化定義了多種抗體片段，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到能夠以化學(xué)方式或 通過利用重組DNA方法學(xué)從頭合成片段。因此，此處使用的術(shù)語“抗體”包括通過完整抗體 的修飾產(chǎn)生的或利用重組DNA方法學(xué)合成的抗體片段。本發(fā)明的抗體還包括多種對形式，包括單鏈抗體(以單多肽鏈存在的抗體)， 諸如單鏈Fv抗體(sFv或scFv)，其中可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)連接在一起(直接地或通 過肽連接子)以形成連續(xù)的多肽。單鏈Fv抗體是共價連接的VH-\，其可以-和V^編 碼序列的核酸表達，所述Vh-和編碼序列直接連接的或通過肽編碼連接子連接(例如， Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci USA，85 :5879_5883，1988)。雖然 Vh 和 Vl 作為單多肽 鏈相互連接，但Vh和\結(jié)構(gòu)域的結(jié)合是非共價的?？贵w還可以是另一片段形式，諸如二硫 化物穩(wěn)定的Fv(dSFv)。還可以例如利用重組技術(shù)產(chǎn)生其他片段作為可溶蛋白或作為從展示 方法獲得的片段?？贵w還可以包括雙抗體和微型抗體。本發(fā)明的抗體還包括諸如來自駱駝科動物抗體的重鏈二聚體。由于駱駝科動物 體內(nèi)的重鏈二聚體IgG的Vh區(qū)不必與輕鏈之間形成疏水作用，因此，通常接觸輕鏈的重鏈 中的該區(qū)在駱駝科動物體內(nèi)被改變?yōu)橛H水性氨基酸殘基。重鏈二聚體IgG的Vh結(jié)構(gòu)域被 稱為VHH結(jié)構(gòu)域。另外，用于本發(fā)明的抗體包括單域抗體(dAbs)和納米抗體(參見例如 Cortez-Retamozo, et al, Cancer Res. 64 :2853_2 857,2004)。如本文所用的，“V-區(qū)”指抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含框架1、⑶R1、框架2、 ⑶R2和框架3節(jié)段，包括⑶R3和框架4，這些節(jié)段作為B細胞分化期間重鏈和輕鏈V區(qū)基 因重排的結(jié)果被加到V-節(jié)段上。本文使用的“V-節(jié)段”指由V基因編碼的V-區(qū)(重或輕 鏈)的區(qū)。重鏈可變區(qū)的V-節(jié)段編碼FRl-⑶R1-FR2-⑶R2和FR3。出于本發(fā)明的目的，輕 鏈可變區(qū)的V-節(jié)段被定義為通過FR3延伸至到⑶R3。
如本文所用的，術(shù)語“J-節(jié)段”指編碼的可變區(qū)的亞序列，其包含⑶R3的C末端部 分和FR4。內(nèi)源性J-節(jié)段由免疫球蛋白J基因編碼。如本 文所用的，術(shù)語“互補性決定區(qū)(CDR) ”指每條鏈上的三個高變區(qū)，其中斷由輕 和重鏈可變區(qū)確立的四個“框架”區(qū)。這些⑶R主要負責(zé)結(jié)合到抗原表位。從N末端開始 順序編號，每條鏈的幾個⑶R(⑶Rs)通常稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3，以及通常被其中有特定 ⑶R的鏈所確定。因此，例如，Vh⑶R3位于它被發(fā)現(xiàn)的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域；而Vl⑶Rl是 來自它被發(fā)現(xiàn)的抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDRl。不同輕或重鏈的框架區(qū)的序列在同一物種內(nèi)是相對保守的?？贵w的框架區(qū)是組成 型輕和重鏈的組合框架區(qū)，用于在三維空間定位和排列⑶Rs。CDRs和框架區(qū)的氨基酸序列可以利用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的不同的定義 來確定，例如Kabat、Chothia、國際免疫遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(IMGT)和AbM(參見例如Johnson et al, supra ；Chothia & Lesk，1987，Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins (用于免疫球蛋白高變區(qū)的極限結(jié)構(gòu)式).J. Mol. Biol. 196， 901-917 ；Chothia C. et al. ,1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions(免疫球蛋白高變區(qū)的構(gòu)象).Nature 342,877-883 ；Chothia C. et al.，1992， structural repertoire of the human VH segments (人 VH 節(jié)段的結(jié)構(gòu)集合)· J. Mol. Biol. 227,799-817 ；Al-Lazikani et al，J. Mol. Bioll997，273 (4))?？乖Y(jié)合位點的定 義還在下列文章中被描述Ruiz et al. , IMGT，國際免疫遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫。Nucleic Acids Res. 28，219-221 (2000)；以及Lefranc，Μ.-P. IMGT，國際免疫遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫。Nucleic Acids Res. Jan 1 ；29 (1) 207-9 (2001) ；MacCalIum et al, Antibody-antigen interactions Contact analysis and binding site topography ( -
結(jié)合位點布局)，J. Mol. Biol.，262 (5) ,732-745(1996)；以及 Martin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA,86,9268-9272 (1989) ；Martin, et al, Methods Enzymol，203，121 — 153， (1991) ；Pedersen et al, Immimomethods, 1,126, (1992)；以及 Rees et al, In Sternberg M. J.E. (ed.), Protein Structure Prediction (蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測)· Oxford University Press, Oxford,141-172 1996)?！氨砦弧被颉翱乖瓫Q定簇”指抗原上與抗體結(jié)合的位點。表位可以通過連續(xù)的氨基 酸或經(jīng)由蛋白三級折疊緊靠的非連續(xù)的氨基酸形成。暴露于變性劑時，通過連續(xù)的氨基酸 形成的表位通常被保留，而通過三級折疊形成的表位通常在用變性劑處理時消失。表位在 獨特的空間構(gòu)象中通常包括至少3個，以及更通常地至少5個或8-10個氨基酸。確定表 位空間構(gòu)象的方法包括例如X射線晶體學(xué)和二維核磁共振。參見例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (分子生物學(xué)方法中的表位分析操作)， Vol. 66，Glenn Ε. Morris, Ed(1996)。本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語“結(jié)合特異性決定簇”或“BSD”指在CDR區(qū)內(nèi)用于確 定抗體結(jié)合特異性所必需的最小的連續(xù)或非連續(xù)氨基酸序列。在本發(fā)明中，該最小結(jié)合特 異性決定簇位于抗體重鏈和輕鏈的⑶R3序列的部分或全長內(nèi)。如本文所用的，“抗GM-CSF抗體”或“GM-CSF抗體”可互相替換使用，指結(jié)合到 GM-CSF并抑制GM-CSF受體活性的抗體?？梢岳迷u價GM-CSF結(jié)合和/或功能的多種本 領(lǐng)域公認的測定方法來鑒定這類抗體。例如，可以利用諸如ELISA測定的結(jié)合測定，其測量GM-CSF與α受體亞單位結(jié)合的抑制。也方便地應(yīng)用關(guān)于GM-CSF受體信號傳導(dǎo)的基于細胞 的測定，諸如確定GM-CSF依賴的細胞系響應(yīng)有限量的GM-CSF時的增殖率的測定，如同測量 細胞因子產(chǎn)生的量的測定，例如響應(yīng)GM-CSF接觸時的IL-18產(chǎn)生。 如本文使用的，“中和抗體”指與GM-CSF結(jié)合并抑制通過GM-CSF受體的信號傳導(dǎo) 或抑制GM-CSF與其受體結(jié)合的抗體。如本文所使用的，“粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF) ”指小的天然存在的 具有內(nèi)部二硫鍵的糖蛋白，分子量為約23kDa。在人類，它是由位于人類第5號染色體上的 細胞因子簇內(nèi)的基因編碼。人類基因和蛋白的序列是已知的。該蛋白具有N-末端信號序 列和C-末端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Rasko and Gough In :The Cytokine Handbook (細胞因子手 冊)，A. Thomson, et al, Academic Press, New York(1994)，第 349-369 頁)。其三維結(jié)構(gòu) 與白介素的結(jié)構(gòu)相似，盡管氨基酸序列并不相似。GM-CSF在響應(yīng)由存在于造血環(huán)境中和炎 癥周圍部位的許多炎癥介質(zhì)時產(chǎn)生。GM-CSF能夠刺激來自骨髓細胞的嗜中性粒細胞、巨噬 細胞和混合的粒細胞_巨噬細胞集落的生成，并能夠刺激嗜酸性粒細胞集落從胎兒肝臟祖 細胞形成。GM-CSF也能夠刺激成熟的粒細胞和巨噬細胞的一些功能性活動并抑制粒細胞和 巨噬細胞的凋亡。術(shù)語“平衡解離常數(shù)”或“親和力”縮寫為(Kd)，指除以結(jié)合速率常數(shù)(ka，時間_1， Μ"1)的解離速率常數(shù)(kd，時間―1)。平衡解離常數(shù)可以利用本領(lǐng)域已知的任一方法測量。本 發(fā)明的抗體是高親和力抗體。這種抗體具有優(yōu)于(低于)約ΙΟηΜ，通常優(yōu)于約500pM或優(yōu)于 約50pM的單價親和力，這通過在37°C進行的表面等離子共振分析來測定。因此，在某些實 施方案中，本發(fā)明的抗體具有低于50pM，通常低于約25pM、或甚至低于IOpM的親和力(如 利用表面等離子共振所測量的)。在一些實施方案中，本發(fā)明的GM-CSF具有慢解離速率，對于與GM-CSF的單價相互 作用，通過在37°C的表面等離子共振分析測定的解離速率常數(shù)(kd)低于約ΙΟ—4。1，優(yōu)選低 于δχΙΟ、—1，以及最優(yōu)選低于ΙΟ、—1。如本文所用的，“人源化抗體(humanized antibody)，，指將來自供體抗體的CDRs 移植到人框架序列的免疫球蛋白分子。人源化抗體還可以在框架序列中包含供體來源的 殘基。人源化抗體還可以包含人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。人源化抗體還可以包 含既不是在受體抗體也不是在輸入的CDR或框架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。人源化能夠利用本 領(lǐng)域所熟知的方法來實現(xiàn)(例如，Jones et al, Nature 321 522~525 ； 1986 ；Riechmann et al. , Nature 332 323~327,1988 ；Verhoeyen et al, Science239 1534-1536,1988)； Presta, Curr. Op. Struct. Biol 2 :593_596，1992 ；U. S. Patent No. 4，816，567)，包括諸如〃 超人化(superhumanizing)“抗體(Tan et al, J. Immunol 169 1119，2002)和〃表面重塑 (resurfacing)“(例如，Staelens et al, MoL Immunol 43 1243, 2006 ；and Roguska et al, Proc. Natl Acad. Sci USA 91:969,1994)的技術(shù)。本發(fā)明上下文中的“人工程化”抗體(“humaneered” antibody)指具有參照抗體 結(jié)合特異性的工程化人抗體。用于本發(fā)明的“人工程化”抗體具有包含從供體免疫球蛋白 衍生的最小序列的免疫球蛋白分子。通常地，抗體通過將編碼來自參照抗體重鏈CDR3區(qū)的 結(jié)合特異性決定簇(BSD)的DNA序列連接到人Vh節(jié)段序列，以及將來自參照抗體輕鏈CDR3 BSD連接到人\節(jié)段序列被“人工程化”?！癇SD”指介導(dǎo)結(jié)合特異性的⑶R3-FR4區(qū)，或該區(qū)的一部分。因此，結(jié)合特異性決定簇可以是⑶R3-FR4、⑶R3、⑶R3的最小必需結(jié)合特異性 決定簇(其指當(dāng)存在于抗體V區(qū)時賦予結(jié)合特異性的任一小于CDR3的區(qū))、D節(jié)段(關(guān)于 重鏈區(qū))，或賦予參照抗體結(jié)合特異性的CDR3-FR4的其他區(qū)。人工程化的方法在公開號為 20050255552的美國專利申請和公開號為20060134098的美國專利申請中被提供。本文使用的“人”抗體包括人源化和人工程化抗體，以及利用已知技術(shù)獲得的人單 克隆抗體。當(dāng)術(shù)語“雜種”被用于提及核酸或蛋白的部分時，表示該核酸或蛋白包含兩個或多 個序列，這些序列通常不是在自然界發(fā)現(xiàn)的彼此有相同親緣關(guān)系的序列。例如，該核酸通常 以重組方式產(chǎn)生，其具有兩個或多個序列，例如來自被排列以產(chǎn)生新的功能性核酸的無關(guān) 聯(lián)的基因。類似地，雜種蛋白指通常不是在自然界發(fā)現(xiàn)的彼此有相同親緣關(guān)系的序列的兩 個或多個序列。 當(dāng)用術(shù)語“重組的”提及例如細胞、核酸、蛋白或載體時，指所述細胞、核酸、蛋白或 載體已經(jīng)通過引入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白被修飾，或者指所述細胞來自進 行過如此修飾的細胞。因此，例如，重組的細胞表達不在細胞的天然形式(非重組的)內(nèi)存 在的基因或表達否則會異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。本文所用術(shù)語“重組的 核酸”指正常不在自然界存在的形式的核酸，其最初一般通過例如利用聚合酶和核酸內(nèi)切 酶操縱核酸在體外形成。以這種方式，實現(xiàn)不同序列的可操作連接。因此出于本發(fā)明的目 的，線性形式的分離的核酸，或者通過連接正常不相連的DNA分子在體外形成的表達載體 都被認為是重組的?？梢岳斫?，一旦重組的核酸被制備并重新導(dǎo)入宿主細胞或有機體，它會 以非重組形式復(fù)制，即，利用宿主細胞的體內(nèi)細胞機制而不是體外操縱；然而，出于本發(fā)明 的目的，這類核酸，一旦被重組制備，盡管隨后非重組復(fù)制，仍然被認為是重組的。類似地， “重組蛋白”是利用重組技術(shù)制備的蛋白，即，通過上文所述的重組核酸的表達。當(dāng)提及蛋白或肽時，短語“特異性(或選擇性)結(jié)合”到抗體或“特異性(或選擇 性)與…免疫反應(yīng)”指抗體結(jié)合感興趣蛋白的結(jié)合反應(yīng)。在本發(fā)明中，抗體結(jié)合感興趣抗原 如GM-CSF的親和力優(yōu)于它對其它抗原的親和力至少100倍。用于兩個或更多個多肽(或核酸)序列時，術(shù)語“一致的”或“一致性”百分比指兩 個或多個序列或子序列相同或者具有特定百分比的相同氨基酸殘基或(核苷酸)(即，當(dāng)在 比較窗(comparison window)或指定區(qū)域比較并對齊以進行最大的對應(yīng)時，在特定的區(qū)域 有約 60% 的一致性，優(yōu)選 70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%， 97%,98%,99%或更高的一致性)，如使用下述的帶缺省參數(shù)的BLAST或BLAST 2. 0序列比 較算法或通過手工比對和目測(參見，例如NCBI萬維網(wǎng)站)所測量的。這樣的序列被稱為 “基本上一致的”。基本上一致的”序列也包括具有刪除和/或添加的序列，和具有取代的那 些，以及例如多態(tài)或等位變體的天然存在的變體，以及人工變體。如下文所述的，優(yōu)選的算 法可以解釋空位及類似情況。優(yōu)選地，蛋白序列一致性存在于至少約25個氨基酸長度的區(qū) 域，或更優(yōu)選地存在于50-100個氨基酸長度的區(qū)域，或者整個蛋白長度。如本文使用的，“比較窗”包括選自一般為20-600，通常為約50-約200，更通常 約100-約150的連續(xù)位的數(shù)目中的一個的片段的參照，其中可以將序列與具有相同數(shù) 目連續(xù)位的參照序列最佳比對后進行比較。用于比較的序列比對方法在本領(lǐng)域是公知 的。例如，可以通過Smith& Waterman，Adv. Appl. Math. 2 :482 (1981)的局部同源性算法、通過 Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol. 48 443(1970)的同源比對算法、通過Pearson & Lipman, Proc. Nat' 1. Acad. Sci USA 85 =2444(1988)的相似性檢索方法、通過這些算法的 計算機實施(Wisconsin Genetics Software Package (威斯康星遺傳學(xué)軟件包)中的GAP， BESTFIT，F(xiàn)ASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group (遺傳學(xué)計算機組)，575 Science Dr.，Madison，WI)或通過手工比對和目測(參見，例如 Current Protocols in Molecular Biology(通用分子生物學(xué)技術(shù))(Ausubel et al.，eds. 1995supplement))進行用于比較 的序列的最優(yōu)化比對。適于確定序列一致性百分比和序列相似性的優(yōu)選的算法實例包括BLAST和BLAST 2. O 算法，這些算法在 Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25 3389-3402 (1977)和 Altschul et al, J. Mol. Biol 215 :403_410 (1990)中有記載。具有本文所描述的參數(shù)的BLAST和 BLAST 2. O用于確定本發(fā)明的核酸和蛋白的序列一致性百分比。BLASTN程序(對于核苷酸 序列)使用的缺省值是字長(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N = -4以及進行雙鏈的比較。 對于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省值是字長為3和期望值(E)為10，以及BL0SUM62 得分矩陣(參見 Henikoff&HenikofT，Proc· Natl Acad. Sci. USA 89 10915 (1989))比對(B) 為50、期望值(E)為10、M = 5、N = -4以及進行雙鏈的比較。術(shù)語“分離的”、“純化的”或“生物學(xué)純的”指物質(zhì)基本上或?qū)嵸|(zhì)上沒有通常如在其 天然狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)的伴隨的組分。純度和同質(zhì)性通常利用諸如聚丙烯凝膠電泳和高效液相色 譜法的分析化學(xué)技術(shù)來確定。存在于制劑中的主要種類的蛋白是基本上純化的。術(shù)語“純 化的”在某些實施方案中表示在電泳凝膠中基本上產(chǎn)生一條帶的蛋白。優(yōu)選地，它表示蛋白 是至少85%純的，更優(yōu)選地至少95%純的，以及最優(yōu)選地至少99%純的。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可以互相替換使用，用于指氨基酸殘基的多聚 體。該術(shù)語適用于氨基酸多聚體，該氨基酸多聚體中的一個或多個氨基酸殘基是對應(yīng)的天 然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物，以及還適用于天然存在的氨基酸多聚體、包含修飾的 殘基的那些，以及非天然存在的氨基酸多聚體。術(shù)語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，此外還指在功能上與天然存在的氨 基酸類似的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些， 以及后來被修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸 類似物指與天然存在的氨基酸具有相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)例如與氫結(jié)合的α碳、羧基、氨基、R 基的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物可以具 有修飾的R基(例如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留與天然存在的氨基酸相同的基本 化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指具有與氨基酸一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)的化合物，但其功能與 天然存在的氨基酸類似。本文的氨基酸可以通過它們公知的三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委 員會推薦的單字母符號被提及。同樣地，核苷酸可以通過它們公認的單字母代碼被提及?！氨Ｊ匦孕揎椬凅w”適用于氨基酸和核酸序列。關(guān)于特定的核酸序列，保守性修飾 變體指那些編碼相同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的核酸，或者如果所述核酸不編碼氨基酸 序列，其指本質(zhì)上相同或相關(guān)的序列，例如，天然的連續(xù)的序列。由于遺傳密碼的兼并性，大 量功能相同的核酸編碼大多數(shù)蛋白。例如，密碼子GCA，GCC, GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨 酸。因此，在由密碼子指定的丙氨酸的每一位置處，該密碼子都可以改變?yōu)槊枋龅南鄳?yīng)密碼子中的另一個，而不改變編碼的多肽。這種核酸變體是“沉默變體”，其是保守性修飾的變體 的一種。本文編碼多肽的每一核酸序列也描述了所述核酸的沉默變體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員 會認識到，在某些情形下，可以修飾核酸中的每一密碼子(AUG除外，其通常是甲硫氨酸的 唯一密碼子；TGG也除外，其通常是色氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能相同的分子。因此， 編碼多肽的核酸的沉默變體經(jīng)常內(nèi)含在描述的序列中，所述序列與表達產(chǎn)物有關(guān)，而與實 際的探針序列無關(guān)。 對于氨基酸序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識到，改變、添加或刪除在編碼的序列中 的單個氨基酸或小部分氨基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白序列的個別的取代、刪除或添加是 “保守性修飾的變體”，其中所述改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上類似的氨基酸取代。提供了功能 類似的氨基酸的保守性取代表和諸如BLOSUM的取代矩陣在本領(lǐng)域中是公知的。這種保守 性修飾變體為本發(fā)明的多態(tài)性變體，種間同源體和等位體的附加，并不排除本發(fā)明的多態(tài) 性變體，種間同源體和等位體。典型的相互的保守性取代包括1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)； 2)冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K) ；5) 異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸 (W) ；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見，例如，Creighton， Proteins(1984))οI.引言本發(fā)明涉及以高親和力與GM-CSF結(jié)合的抗體，并且是GM-CSF的拮抗劑。該抗體 包含與人種系序列具有高度一致性的可變區(qū)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明抗體的 CDRH3中的BSD序列包含氨基酸序列RQRFPY或RDRFPY。CDRL3中的BSD包含F(xiàn)NK或FNR。完整的V區(qū)通過如下方式產(chǎn)生其中，BSD形成部分⑶R3，另外的序列用于完成 ⑶R3和添加FR4序列。通常，⑶R3除BSD之外的部分和完整的FR4由人種系序列組成。在 一些實施方案中，除BSD之外的CDR3-FR4序列與人種系序列的差異在每條鏈上不超過2個 氨基酸。在一些實施方案中，J節(jié)段包含人種系J節(jié)段。例如，可以通過公眾可用的國際免 疫遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(IMGT)和基于V的數(shù)據(jù)庫(V-base)(萬維網(wǎng)vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk) 確定人種系序列。人種系V節(jié)段的集合由51個重鏈V區(qū)、40個κ輕鏈V節(jié)段和31個λ輕鏈V 節(jié)段組成，產(chǎn)生共計3，621個種系V區(qū)對。另外還有針對這些V節(jié)段的大多數(shù)的穩(wěn)定等 位變體，但這些變體對種系集合的結(jié)構(gòu)多樣性的貢獻是有限的。所有人種系V節(jié)段基因 的序列都是已知的，并可以在由英國劍橋蛋白質(zhì)工程MRC中心(MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,United Kingdom)提供的基于V的數(shù)據(jù)庫中獲取(還參見Chothia et al,1992, J Mol Biol 227 776-798 ；Tomlinson et al，1995，EMBO J 14:4628-4638; Cook et al(1995)Immunol. Today 16:237-242 and Williams et al,1996, J Mol Biol 264 -.220-232)。本文所描述的抗體或抗體片段能夠在原核或真核微生物系統(tǒng)中、或者在諸如哺乳 動物細胞的更高級的真核生物細胞中表達。本發(fā)明中所用的抗體可以是任何形式。例如，在一些實施方案中，該抗體可以是 包含恒定區(qū)，例如人的恒定區(qū)的完整抗體，或者可以是完整抗體的片段或衍生物，例如Fab， Fab'，F(xiàn) (ab ‘ ) 2，scFv, Fv,或者是單域抗體，例如納米抗體或駱駝科動物抗體。
II.重鏈本發(fā)明的抗-GM-CSF抗體的重鏈包含具有下列元件的重鏈V區(qū)1)包含F(xiàn)R1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人重鏈V節(jié)段序列
2)包含氨基酸序列R (Q/D) RFPY的CDRH3區(qū)3)由人種系J基因節(jié)段提供的FR4。

圖1中顯示了支持結(jié)合到GM-CSF的V節(jié)段序列及前面所述的⑶R3-FR4節(jié)段及互 補的\區(qū)的實例。例如，該V節(jié)段可以來自人的VHl亞類。在一些實施方案中，該V節(jié)段 是人VhI亞類節(jié)段，其與種系節(jié)段VHl 1-02或VHl 1-03具有高度氨基酸序列一致性，例如至 少80 %、85 %或90 %或更高的一致性。在一些實施方案中，該V節(jié)段與VHl 1-02或VHl 1-03 的區(qū)別不超過15個殘基，以及優(yōu)選地不超過7個殘基。本發(fā)明的抗體的FR4序列由人的JHl、JH3、JH4、JH5或JH6基因種系節(jié)段提供，或 者由與人種系JH節(jié)段具有高度氨基酸序列一致性的序列提供。在一些實施方案中，J節(jié)段 是人種系JH4序列。⑶RH3還包含來自人的J節(jié)段的序列。通常地，除去BSD的⑶RH3-FR4序列與人種 系J節(jié)段的區(qū)別不超過2個氨基酸。在典型的實施方案中，CDRH3中的J節(jié)段序列來自用 于FR4序列的同樣的J節(jié)段。由此，在一些實施方案中，該⑶RH3-FR4區(qū)包含BSD和完整的 人JH4種系基因片段。CDRH3和FR4序列的示例性組合如下所示，其中BSD用粗體表示，人 種系J片段JH4殘基用下劃線表示。CDR3R (Q/D) RFPY YFDYffGQGTLVTVSS在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體包含的V節(jié)段與種系節(jié)段VH1-02或VH1-03、或 與圖1所示的Vh區(qū)的一個V節(jié)段如VH# 1，VH#2, VH#3, VH#4或VH#5的V節(jié)段部分具有至 少 90% —致性，或至少 91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或 100% 的一致性。在一些實施方案中，Vh區(qū)的V節(jié)段具有如圖1所示的⑶Rl和/或⑶R2。例如，本 發(fā)明的抗體可以具有包含序列GYYMH或NYYIH的CDRl ；或包含序列WINPNSGGTNYAQKFQG或 WINAGNGNTKYSQKFQG 的 CDR2。在特定的實施方案中，抗體具有來自圖1所示的Vh區(qū)V節(jié)段的一個的⑶Rl和 CDR2，以及包含R(Q/D)RFPY如RDRFPYYFDY或RQRFPYYFDY的CDR3。因此，在一些實施方 案中，本發(fā)明的抗GM-SCF抗體可以例如，具有包含序列R (Q/D) RFPYYFDYffGQGTLVTVSS的 ⑶R3-FR4以及如圖1所示的⑶Rl和/或⑶R2。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體的Vh區(qū)具有含結(jié)合特異性決定簇R(Q/D)RFPY 的⑶R3、來自人種系VHl節(jié)段的⑶R2或來自人種系VHl的⑶R1。在一些實施方案中，⑶Rl 和⑶R2都來自人種系VHl節(jié)段。III.輕鏈本發(fā)明的抗-GM-SCF抗體的輕鏈包含具有下列元件的輕鏈V區(qū)1)包含F(xiàn)R1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人輕鏈V節(jié)段序列2) CDRL3 區(qū)，其包含序列 FNK 或 FNR，例如 QQFNRSPLT 或 QQFNKSPLT3)由人種系J基因節(jié)段提供的FR4。
八區(qū)包含V λ或VK V節(jié)段。圖1中提供了支持結(jié)合的V κ序列及互補的Vh區(qū)的 實例。八區(qū)⑶ R3序列包含J節(jié)段衍生的序列。在典型的實施方案中，⑶RL3中的J節(jié)段 序列來自用于FR4的同樣的J節(jié)段。由此，在一些實施方案中，該序列與人κ種系V節(jié)段 和J節(jié)段序列的差異可以不超過2個氨基酸。在一些實施方案中，該CDRL3-FR4區(qū)包含BSD 和完整的人JK4種系基因節(jié)段。用于κ鏈的示例性CDRL3-FR4組合如下所示，其中最小的 必需結(jié)合特異性決定簇用粗體顯示，JK4序列用下劃線表示。CDR3QQ FNR SPLTFGGGTKVEIK
QQ FNK SPLTFGGGTKVEIKVk節(jié)段通常屬于VKIII亞類。在一些實施方案中，該節(jié)段具有與人種系VKIII亞 類至少80%的序列一致性，例如與人種系VKIIIA27序列至少80%的一致性。在一些實施方 案中，Vk節(jié)段與VKIIIA27的差異可以不超過18個殘基。在其他實施方案中，本發(fā)明的抗 體的八區(qū)V節(jié)段與圖1中所示的\區(qū)的人1^￥節(jié)段序列，例如￥1(#1，￥1(#2，￥1(#3或￥1(#4的 V節(jié)段序列具有至少85%的一致性，或至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%， 98%，99% 或 100% 的一致性。在一些實施方案中，八區(qū)的V節(jié)段具有如圖1所示的⑶Rl和/或⑶R2。例如，本 發(fā)明的抗體可以具有CDRl序列RASQSVGTNVA或RASQSIGSNLA ；或CDR2序列STSSRAT。在特定的實施方案中，本發(fā)明的抗-GM-CSF抗體可以具有顯示在圖1中所示的八 區(qū)的一個V節(jié)段中的⑶Rl和⑶R2組合，以及包含F(xiàn)NK或FNR的⑶R3序列，例如⑶R3可以 是QQFNKSPLT或QQFNRSPLT。在一些實施方案中，這種抗-GM-CSF抗體可以包含F(xiàn)R4區(qū)，該 FR4區(qū)是FGGGTKVEIK。因此本發(fā)明的抗-GM-CSF抗體可以包含例如，來自圖1所示的一個 Vl 區(qū)的 CDRl 和 CDR2，以及為 FGGGTKVEIK 的 CDR3-FR4 區(qū)。IV. GM-CSF抗體的制備本發(fā)明的抗體可以包含圖1所示的Vh區(qū)VH#1，VH#2, VH#3, VH#4或VH#5的任一 個。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以包含圖1所示的\區(qū)VK#1，VK#2，VK#3或VK#4 的任一個。在一些實施方案中，抗體具有圖1所示的Vh區(qū)VH#1，VH#2，VH#3, VH#4或VH#5 ； 以及如圖1所示的\區(qū)VK#1，VK#2, VK#3或VK#4?？梢詼y試抗體以確定該抗體保留拮抗GM-CSF活性的活性。拮抗劑活性能夠利用 多種指標來確定，包括增殖測定。利用評價GM-CSF功能的多種測定來評價抗GM-CSF抗體。 例如，對于GM-CSF受體信號傳導(dǎo)，方便地利用基于細胞的測定，諸如確定GM-CSF依賴的細 胞系響應(yīng)有限量的GM-CSF的增殖率的測定。人TF-I細胞系適合用于這種測定。參見， Krinner et al，(2007)Mol. Immunol。給予治療疾病(對疾病而言，抑制GM-CSF是理想的) 的抗體優(yōu)選保留嵌合c 19/2抗體拮抗活性的至少約50%，或至少約75%，80%，90%，95% 或100%，例如W003/068920，其具有鼠單克隆抗體LMM102的可變區(qū)和CDRsjnfi Kabat所 定義的CDRHl DYNIHCDRH2 YIAPYSGGTGYNQEFKNCDRH3 RDRFPYYFDY
CDRLl KASQNVGSNVACDRL2 SASYRSGCDRL3 QQFNRSPLT?？梢岳檬熘臏y定來鑒定高親和力抗體，以確定結(jié)合活性和親和力。這種技術(shù) 包括ELISA測定，以及利用表面等離子共振或干涉測量技術(shù)測定的結(jié)合測定。例如，親和力 可以通過利用ForteBio (Mountain View, CA) Octet生物傳感器的生物膜層干涉測量技術(shù)來 確定。本發(fā)明的抗體通常以相似的親和力與糖基化和非糖基化形式的GM-CSF結(jié)合。本發(fā)明的抗體與C19/2競爭對GM-CSF的結(jié)合。本文所描述的抗體阻斷cl9/2或 與C19/2競爭對GM-CSF的結(jié)合的能力表明，該抗體與cl9/2結(jié)合相同的表位，或結(jié)合到與 C19/2結(jié)合的表位接近的表位，例如與C19/2結(jié)合的表位交疊的表位。在其他的實施方案 中，本文所述的抗體，例如圖1提供的表中所示的包含Vh和\區(qū)組合的抗體，可以被用作參 照抗體，以評價是否有另一抗體競爭對GM-CSF的結(jié)合。在測試抗體存在的情況下，如果參 照抗體對抗原的結(jié)合減少至少30%，通常至少大約40%、50%、60%或75%，以及經(jīng)常至少 約90%，則測試抗體被視為競爭性地抑制參照抗體的結(jié)合。許多測定可以應(yīng)用于評價結(jié)合， 包括ELISA，以及其他測定，諸如免疫印跡。先前已經(jīng)描述了帶有與人種系序列接近的V區(qū)序列的抗體的分離方法(公開號為 20050255552和20060134098的美國專利申請)。抗體庫可以在適合的宿主細胞中表達，包 括哺乳動物細胞、酵母細胞或原核細胞。為了在某些細胞體系中表達，可以在N-末端引入 信號肽，以將分泌導(dǎo)向細胞外介質(zhì)。有或無信號肽的抗體可以從諸如大腸桿菌(E. coli)的 細菌細胞分泌。在美國專利申請20070020685中描述了抗體片段從大腸桿菌的無信號分泌 的方法。為了生成GM-CSF-結(jié)合抗體，本發(fā)明的一個例如圖1所示的Vh區(qū)與本發(fā)明的一個 例如圖1所示的\區(qū)結(jié)合，并在合適的表達系統(tǒng)中以許多形式中的任一種表達。由此，該抗 體可以表達為scFv、Fab、Fab'(包含免疫球蛋白鉸鏈序列)、F(ab' )2(通過兩個Fab' 分子鉸鏈序列間形成二硫鍵而形成)、完整的免疫球蛋白或截短的免疫球蛋白，或在原核或 真核宿主細胞中，無論是在宿主細胞內(nèi)還是通過分泌方式，表達為融合蛋白。甲硫氨酸殘基 可以任選地存在于例如在無信號表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的多肽的N末端。本文描述的每一個
都可以與每一個\區(qū)成對，以生成抗-GM-CSF抗體。圖1中顯示了示例性的重鏈和輕鏈的 組合。本發(fā)明的抗體抑 制GM-CSF受體活化，例如通過抑制GM-CSF與受體結(jié)合，并且展示 了對GM-CSF的高親和力結(jié)合，例如500pM。在一些實施方案中，抗體具有每秒約10_4或更 小的解離常數(shù)。不被理論約束，具有較小解離常數(shù)的抗體提供改良的治療益處。例如，本發(fā) 明的抗體具有比cl9/2低三倍的解離速率，產(chǎn)生了超過10倍的有效的GM-CSF中和活性，例 如在基于細胞的測定中，諸如IL-8產(chǎn)生(參見，例如，實施例2)?？梢岳枚喾N表達系統(tǒng)，包括原核的和真核的表達系統(tǒng)來生產(chǎn)抗體。在一些實施 方案中，表達系統(tǒng)是哺乳動物細胞表達，諸如CHO細胞表達系統(tǒng)。許多這種系統(tǒng)可以從供應(yīng) 商處廣泛獲取。在抗體包含Vh和\區(qū)兩者的實施方案中，該Vh和\區(qū)可以利用單一載體 來表達，例如在雙順反子表達單元中或在不同啟動子控制下。在其他的實施方案中，該Vh* Vl區(qū)可以利用分別的載體來表達。本文所描述的Vh或\區(qū)可以在N末端任選地包含甲硫氨酸。本發(fā)明的抗體可以通過多種形式來生產(chǎn)，包括作為Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv或 dAB。本發(fā)明的抗體還能夠包括人的恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)可以是人的κ或λ恒定區(qū)。重 鏈恒定區(qū)通常是Y鏈恒定區(qū)，例如Y-l、Y-2, Y-3或Y-4恒定區(qū)。在其他的實施方案 中，該抗體可以是IgA。在本發(fā)明的一些實施方案中，抗體Vl區(qū)，例如圖1的VK#1，VK#2，VK#3或VK#4，與 人κ恒定區(qū)(例如，SEQ ID NO 10)結(jié)合以形成完整的輕鏈。在本發(fā)明的一些實施方案中，Vh區(qū)與人Y-I恒定區(qū)結(jié)合。可以選擇任何適合的 Y-If同種異型，諸如f-同種異型。因此，在一些實施方案中，抗體是具有f-同種異型恒定 區(qū)例如SEQ ID而11的化6，其具有選自￥!1#1，￥!1#2，￥!1#3，￥!1#4或￥!1#5(圖1)的VH。在一 些實施方案中，抗體具有選自兆#1，￥1(#2，￥1(#3或￥1(#4(圖1)的\。在特定的實施方案中， 抗體具有SEQ ID N0:10所列的κ恒定區(qū)，以及SEQ ID NO :11所列的重鏈恒定區(qū)，其中重鏈 和輕鏈可變區(qū)包含下述來自圖1所列的序列的組合中的一個a)VH#2，VK#3 ；b)VH#l,VK#3 ； c)VH#3, VK#1 ；d) VH#3, VL#3 ；e)VH#4, VK#4 ；f) VH#4, VK#2 ；g) VH#5, VK#1 ；h) VH#5, VK#2 ；i) VH#3, VK#4 ；或 j)VH#3，VL#3)。在一些實施方案中，例如，如果抗體是片段，該抗體能夠與另一分子偶聯(lián)，例如聚 乙二醇(聚乙二醇化)或血清蛋白，以在體內(nèi)提供延長的半衰期。抗體片段聚乙二醇化的實 例在Knight et al. Plateletsl5 :409，2004(關(guān)于阿昔單抗)；Pedley et al. ,Br. J. Cancer 70 1126，1994(關(guān)于抗-CEA 抗體)；Chapman et al, Nature Biotech. 17 :780，1999 ；以及 Humphreys, et al.，Protein Eng. Des. 20 227,2007)中被提供。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體以Fab'片段的形式存在。全長輕鏈通過將八 區(qū)融合到人κ或λ恒定區(qū)產(chǎn)生。任一恒定區(qū)可以用于任何輕鏈。然而，在典型的實施方 案中，κ恒定區(qū)與Vκ可變區(qū)聯(lián)用，以及λ恒定區(qū)與Vλ可變區(qū)一起使用。Fab'的重鏈是Fd'片段，其是通過將本發(fā)明的Vh區(qū)融合到人重鏈恒定區(qū)序列， 第一恒定結(jié)構(gòu)域(CHl)和鉸鏈區(qū)產(chǎn)生的。該重鏈恒定區(qū)序列可以來自任何的免疫球蛋白種 類，但通常來自IgG，以及可以來自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。本發(fā)明的Fab'抗體還可以 是雜種序列，例如鉸鏈序列可以來自一個免疫球蛋白亞類，CHl結(jié)構(gòu)域可以來自另一亞類。V.用于治療其中GM-CSF是靶標的疾病的抗GM-CSF抗體的給藥。本發(fā)明還提供了治療患有與GM-CSF有關(guān)的疾病的患者的方法，在該疾病中，抑制 GM-CSF活性是理想的，即，該疾病中GM-CSF是治療靶標。在一些實施方案中，這種患者患有 慢性炎癥疾病，例如關(guān)節(jié)炎，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、青少年特 發(fā)性關(guān)節(jié)炎以及關(guān)節(jié)的其他炎癥疾?。谎仔阅c疾病如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、巴雷特綜 合征(Barrett' s syndrome)，回腸炎、腸炎和谷蛋白敏感性腸?。缓粑到y(tǒng)的炎性病癥， 諸如哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、變態(tài)反應(yīng)性鼻炎、矽肺、慢性呼吸道阻塞性疾病、超敏反應(yīng) 肺疾病、支氣管擴張癥；皮膚的炎癥疾病，包括銀屑病、硬皮病和諸如濕疹、特應(yīng)性皮炎、蕁 麻疹和瘙癢癥的炎癥皮膚病；涉及中樞和外周圍神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的病癥包括多發(fā)性硬化、特 發(fā)性脫髓鞘性多神經(jīng)病、格-巴二氏綜合征(Guillain-Barre syndrome)、慢性炎癥性脫髓 鞘性多發(fā)性神經(jīng)病和諸如阿爾茨海默氏病的神經(jīng)變性疾病。各種其它炎癥疾病可以使用 本發(fā)明的方法治療。這些包括系統(tǒng)性紅斑性狼瘡，免疫介導(dǎo)性腎臟病，例如腎小球腎炎和脊椎關(guān)節(jié)病；帶有不良慢性炎癥成分的疾病，諸如系統(tǒng)性硬化病，特發(fā)性炎癥性肌病，肖格倫 氏綜合征(Sjogren' s syndrome)，脈管炎，肉瘤樣病，甲狀腺炎，痛風(fēng)，耳炎，結(jié)膜炎，竇炎， 肉瘤樣病，貝赫切特綜合征(Behcet' s syndrome)，肝膽管疾病諸如肝炎、原發(fā)性膽汁性肝 硬化、肉芽腫性肝炎和硬化性膽管炎。在一些實施方案中，患者患有心血管系統(tǒng)損傷后的炎 癥。多種其他的炎癥性疾病包括肺結(jié)核和慢性膽囊炎。例如在Harrison' s Principles of Internal Medicine (哈里森內(nèi)科學(xué))，第 12 版，Wilson, et al.，eds.，McGraw-Hill, Inc.)中也描述了其它慢性炎癥疾病。在一些實施方案中，用抗體治療的患者患有癌癥，其 中GM-SCF促進腫瘤或癌癥細胞生長，例如急性髓樣白血病。在一些實施方案中，用本發(fā)明 抗體治療的患者患有心衰，或具有患心衰的風(fēng)險，例如由于心血管細胞的缺血損傷，諸如缺 血性心臟病、中風(fēng)和動脈粥樣硬化導(dǎo)致。在一些實施方案中，用本發(fā)明的抗體治療的患者患 有哮喘。在一些實施方案中，用本發(fā)明的抗體治療的患者患有阿爾茨海默氏病。在一些實 施方案中，用本發(fā)明的抗體治療的患者患有骨質(zhì)減少癥，例如骨質(zhì)疏松癥。在一些實施方案 中，用本發(fā)明的抗體治療的患者患有血小板減少性紫癜。在一些實施方案中，患者患有I型 或II型糖尿病。在一些實施方案中，患者可以患有多于一種的以GM-SCF為治療靶標的疾 病，例如患者可以患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和心衰，或者骨質(zhì)疏松癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。本發(fā)明的方法包括以治療有效量給予患者作為藥物組合物的抗GM-CSF抗體，所 述方法使用適用于治療所述疾病的給藥方案?？梢耘渲朴糜诙喾N藥物遞送系統(tǒng)的組合物。 一種或多種生理學(xué)上可接受的賦性劑或載體也可以包括在用于合適制劑的組合物中。用 于本發(fā)明的合適的制劑見于Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓氏藥物科 學(xué))，第 21 版，Philadelphia, PA.Lippincott Williams&Wilkins，2005?？笹M-CSF抗體以適合注射入患者體內(nèi)的溶液形式提供，例如用于注射的無菌等 滲水溶液。將抗體以合適的濃度溶解或懸浮在可接受的載體中。在一些實施方案中，所述 載體是水性的，例如，水、鹽水、磷酸緩沖鹽等。組合物可以包含接近生理條件所需的輔助性 藥用物質(zhì)，諸如PH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑等。本發(fā)明的藥物組合物以足以治愈或至少部分阻止疾病或疾病的癥狀及其并發(fā) 癥的量給予患者，例如患有骨質(zhì)減少、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱 炎、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、心衰、心肌損害如心臟病發(fā)作后的心 肌損害、血小板減少性紫癜或糖尿病的患者。足以實現(xiàn)這一目的的量定義為“治療有效劑 量”。通過監(jiān)測患者對治療的反應(yīng)確定治療有效劑量。指示治療有銷量的典型的參考標準 (benchmark)包括患者疾病癥狀的減輕。用于這一用途的有效量取決于疾病的嚴重程度以 及患者總體健康狀況，包括諸如年齡、體重、性別、給藥途徑等其他因素?？贵w的單次或多次 給藥可以按照患者所需和耐受的劑量及頻率給予。在任一情形下，該方法提供了有效地治 療患者的足夠量的抗GM-CSF抗體。抗體可以單獨給予，或與其他治療聯(lián)合給予，以治療目的疾病?？贵w可以通過經(jīng)由包括但不限于靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)途徑的任何適合 途徑的注射或輸注給藥。在一些實施方案中，該抗體可以通過吹入法給藥。在示例性的實 施方案中，抗體可以在4°C以10mg/ml儲存在無菌等滲注射用鹽水溶液 中，并且在給予患者 前，在100ml或200ml 0. 9%的注射用氯化鈉中稀釋。在1小時的時程以0. 2-10mg/kg的劑 量通過靜脈內(nèi)輸注的方式給予抗體。在其他的實施方案中，在15分鐘-2小時的時間段，通過靜脈內(nèi)輸注的方式給予抗體。在其他的實施方案中，給藥操作通過皮下彈丸注射。選擇抗體的劑量以便為患者提供有效的治療，所述劑量為小于0. lmg/kg體重至 約25mg/kg體重的范圍，或為lmg-2g/患者的范圍。優(yōu)選地，該劑量為l_10mg/kg或大約 50mg-1000mg/患者的范圍。該劑量可以以適當(dāng)?shù)念l率重復(fù)，根據(jù)抗體的藥代動力學(xué)(例如， 抗體在循環(huán)中的半衰期)和藥效反應(yīng)(例如，抗體療效的持續(xù)時間)，該頻率可以為每天一 次至每三個月一次。在一些實施方案中，在體內(nèi)的半衰期為約7-約25天，以及在每周一次 至每三個月一次重復(fù)抗體給藥。在其他的實施方案中，大約每月一次給藥抗體。本發(fā)明的Vh區(qū)和/或\區(qū)還可以用于診斷目的。例如，Vh區(qū)和/或\區(qū)可以用 于臨床分析，例如檢測患者中的GM-CSF水平。本發(fā)明的Vh區(qū)或\區(qū)還可以用于例如生產(chǎn) 抗-Id抗體。
實施例 實施例1.工禾旱化的人杭-GM-CSF V區(qū)的鑒定。如公開號為20050255552的美國專利申請中所描述的，進行人工程化。從人V節(jié) 段文庫序列以及人種系J節(jié)段序列構(gòu)建表位_聚集的文庫，該人V節(jié)段庫序列連接到包含 ⑶RH3和⑶RL3中的BSD序列的⑶R3-FR4區(qū)。對于重鏈，使用人種系JH4序列，以及對于輕 鏈，使用人種系JK4序列。選擇支持與重組人GM-CSF結(jié)合的、來自Vhl-限制性文庫的全長人工程化的V區(qū)。 “全長”V-K文庫用作構(gòu)建如公開號為20060134098的美國專利申請所描述的“盒式”文 庫(“cassette” libraries)的基礎(chǔ)，其中只有部分鼠科cl9/2V節(jié)段最初由人序列文庫取 代。構(gòu)建了兩種類型的盒(cassette)。通過框架2區(qū)內(nèi)的交疊共有序列的橋式PCR(bridge PCR)制備V-K鏈的盒。以這種方式，構(gòu)建人V-K III同種型的“前端”和“中間”人盒式 文庫。支持與GM-CSF結(jié)合的人V-κ III盒通過集落轉(zhuǎn)移結(jié)合測定(colony-lift binding assay)來鑒定并按照ELISA中的親和力來排序。將V-κ人“前端”和“中間”盒通過橋式 PCR融合在一起，從而重構(gòu)支持GM-SCF結(jié)合活性的全長人V- κ區(qū)。因此人工程化Fabs由 支持與人GM-CSF結(jié)合的人工程化V重鏈和V- κ區(qū)組成。通過表面等離子共振技術(shù)(spr)分析確定結(jié)合活性。生物素化的GM-SCF被捕獲 在鏈霉抗生物素包被的CM5生物傳感器芯片上。從大腸桿菌表達的人工程化的Fab片段在 IOmM HEPESU50mM NaCl,0. lmg/mL BSA 和 0. 005% p20 中在 pH 7. 4 時稀釋到 30nM 的起始 濃度。利用3倍稀釋系列，將每一 Fab稀釋4次，每一濃度在37°C下測試兩次以確定與不同 密度抗原表面的結(jié)合動力學(xué)。整體擬合來自所有三個表面的數(shù)據(jù)以提取解離常數(shù)。圖1中顯示了示例性的人工程化的抗GM-CSF V區(qū)。實施例2.人工程化的GM-CSF抗體的評價本實施例評價了人工程化抗GM-CSF抗體在基于細胞的測定中與嵌合的IgGlk抗 體(Ab2)相比的結(jié)合活性和生物學(xué)效能，所述嵌合的IgGlk抗體具有來自小鼠抗體LMM102 的可變區(qū)(Nice et al,Growth Factors (生長因子)，3 159，1990)。Abl 是抗 GM-CSF 的人 工程化IgGlk抗體，與Ab2具有相同的恒定區(qū)。人GM-CSF與Abl和Ab2結(jié)合的表面等離子共振分析利用Biacore 3000儀器，表面等離子共振分析用于比較Abl和Ab2與糖基化的人GM-CSF相互作用的結(jié)合動力學(xué)和單價親和力。利用多克隆抗人F(ab' )2，將Abl或Ab2捕 獲到Biacore芯片表面。人293細胞表達的糖基化重組人GM-CSF用作分析物。在2次獨 立實驗中確定動力學(xué)常數(shù)(參見，圖2和表1)。結(jié)果表明，在該實驗中，GM-CSF以可比較的 單價親和力與Ab2和Abl結(jié)合。然而，Abl具有比Ab2低2倍的“結(jié)合速率(on-rate) ”，但 “解離速率(off-rate)，，比Ab2低約3倍。表1 圖2中由表面等離子共振分析確定的37°C的動力學(xué)常數(shù)，顯示了結(jié)合常數(shù) 00、解離常數(shù)(kd)和計算的親和力(KD)。
權(quán)利要求
1.抗GM-CSF抗體，包含Vh區(qū)，其包含⑶R3結(jié)合特異性決定簇RQRFPY或RDRFPY、J節(jié)段和V節(jié)段，其中所述J 節(jié)段包含與人JH4(YFDYWGQGTLVTVSS)至少95%的一致性，以及所述V節(jié)段包含與人種系 VHl 1-02或VHl 1-03序列至少90%的一致性；或者Vh區(qū)，其包含⑶R3結(jié)合特異性決定簇RQRFPY。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述J節(jié)段包含YFDYWGQGTLVTVSS。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的抗體，其中所述⑶R3包含RQRFPYYFDY或 RDRFPYYFDY。
4.如前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中所述Vh區(qū)⑶Rl是人種系VHl⑶Rl;所 述Vh區(qū)⑶R2是人種系VHl⑶R2 ；或者⑶Rl和⑶R2兩者都來自人種系VHl序列。
5.如前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體包含圖1所列的Vh區(qū)中顯示的 Vh CDRl，或者 Vh CDR2,或者 Vh CDRl 和 Vh CDR2 兩者。
6.如前述權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體，其中所述Vh區(qū)CDRl具有序列NYYIH或 GYYMH。
7.如前述權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體，其中所述CDR2具有序列 WINAGNGNTKYSQKFQG 或 WINPNSGGTNYAQFKQG。
8.如前述權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體，其中所述Vh區(qū)CDRl具有序列NYYIH或 GYYMH ；以及所述 Vh 區(qū) CDR2 具有序列 WINAGNGNTKYSQKFQG 或 WINPNSGGTNYAQFKQG。
9.如前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中所述V節(jié)段序列具有圖1所示的VhV節(jié) 段序列。
10.如權(quán)利要求9所述的抗體，其中所述Vh具有圖1所示的VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或 VH#5序列。
11.如前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體包含\區(qū)，所述\區(qū)包含具 有氨基酸序列FNK或FNR的CDR3。
12.如權(quán)利要求11所述的抗體，其中所述抗體包含人種系JK4區(qū)。
13.如權(quán)利要求11或權(quán)利要求12所述的抗體，其中所述\區(qū)CDR3包含QQFN(K/R) SPLT。
14.如權(quán)利要求13所述的抗體，其中所述\區(qū)⑶R3包含QQFNKSPLT。
15.如權(quán)利要求11至14中任一項所述的抗體，其中所述\區(qū)包含圖1所示的序列\(zhòng) 區(qū)的⑶Rl或⑶R2，或者⑶Rl和⑶R2兩者。
16.如權(quán)利要求15所述的抗體，其中所述\區(qū)CDRl具有序列RASQS(V/I)G(T/S)N(V/L)A。
17.如權(quán)利要求15所述的抗體，其中所述\區(qū)⑶R2具有序列STSSRAT。
18.如權(quán)利要求15所述的抗體，其中所述\區(qū)CDRl具有序列RASQS(V/I)G(T/S)N(V/ L)A ；以及所述Vl區(qū)CDR2具有序列STSSRAT。
19.如權(quán)利要求11-18中任一項所述的抗體，其中所述\區(qū)包含與圖1所示的 VKIIIA27V節(jié)段序列具有至少95% —致性的V節(jié)段。
20.如權(quán)利要求19所述的抗體，其中所述\區(qū)具有圖1所示的VK#1，VK#2,VK#3或 VK#4序列。
21.如前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體是IgG。
22.如權(quán)利要求21所述的抗體，其中所述抗體包含具有SEQID N0:11中所示的氨基 酸序列的重鏈恒定區(qū)。
23.如前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體包含具有SEQID N0:10中所 示的氨基酸序列的κ輕鏈恒定區(qū)。
24.如前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中所述Vh區(qū)或\區(qū)，或者Vh和\區(qū)兩者 的氨基酸序列在N-末端包含甲硫氨酸。
25.抗GM-CSF抗體，包含Vl區(qū)，其包含CDR3，所述CDR3包含QQFNKSPLT。
26.如權(quán)利要求25所述的抗體，其中所述Vh區(qū)或\區(qū)，或者所述Vh和\區(qū)兩者的氨 基酸序列在N-末端包含甲硫氨酸。
27.抗體，其包含圖1所示的Vh區(qū)和圖1所示的八區(qū)。
28.如權(quán)利要求27所述的抗體，其中所述抗體是IgG。
29.如權(quán)利要求27或權(quán)利要求28所述的抗體，其中所述抗體包含具有SEQID NO=Il 中所示的氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)。
30.如權(quán)利要求27-29中任一項所述的抗體，其中所述抗體包含具有SEQID N0:10中 所示的氨基酸序列的κ輕鏈恒定區(qū)。
31.如權(quán)利要求27所述的抗體，其中所述抗體具有 SEQ ID NO 11中所示的重鏈恒定區(qū)；SEQ ID NO 10中所示的輕鏈κ恒定區(qū)；以及選自圖 1 所示的 a)VH#2, VK#3 ；b)VH#l, VK#3 ；c)VH#3, VK#1 ；d)VH#4, VL#3 ；e)VH#4, VK#4 ；f) VH#4, VK#2 ；g) VH#5, VK#1 ；h) VH#5, VK#2 ； i)VH#3, VK#4 禾口 j)VH#3, VL#3 的重鏈和輕鏈可變區(qū)組合。
32.治療患者的方法，所述患者患有其中GM-CSF是治療靶標的疾病，所述方法包括給 予所述患者治療有效量的前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述疾病是骨質(zhì)減少癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、 多發(fā)性硬化、銀屑病、慢性阻塞性肺疾病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、心衰、缺血事件導(dǎo)致的 心肌損害、或者糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明涉及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的高親和力抗體，其被給予人類以治療疾病時具有降低的免疫原性，以及涉及使用這種抗體的方法。
文檔編號C07K16/22GK102037016SQ200980118423
公開日2011年4月27日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月28日
發(fā)明者克里斯托弗·R·貝炳東, 杰弗里·T·亞蘭東, 肯尼思·魯爾森 申請人:卡羅拜奧斯制藥公司