專利名稱：：人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的抗體中和劑的制作方法人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的抗體中和劑本發(fā)明涉及抗體及其片段，其能中和人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的活性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含該抗體及其片段的藥物組合物以及該抗體及其片段用于制備治療各種病癥的藥物的用途。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，最初被描述成粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞的體外生長(zhǎng)和分化的有效刺激物，它是約23kDa的糖蛋白，帶有4個(gè)a螺旋束結(jié)構(gòu)，其能結(jié)合由屬于1類細(xì)胞因子受體家族的亞基構(gòu)成的異二聚化的受體。它刺激諸如巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和提呈抗原的樹突狀細(xì)胞成熟，增加它們?cè)诳垢腥痉矫娴墓δ苣芰?。在小鼠中的基因消除?shí)驗(yàn)，即靜默或敲除感興趣的基因(本文中的GM-CSF)的實(shí)驗(yàn)，顯示GM-CSF對(duì)于維持一些巨噬細(xì)胞群(如涉及清除肺中表面活性劑和應(yīng)答某些種類的感染或免疫應(yīng)答的那些)的功能活性來說是必需的。盡管GM-CSF對(duì)嗜中性白細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、以及較次要的紅細(xì)胞類和巨核細(xì)胞的先祖細(xì)胞在體外有有效的刺激活性，而用基因敲除小鼠得到的體內(nèi)結(jié)果提示GM-CSF的主要生理作用是維持或刺激成熟的巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的功能活性并刺激向免疫系統(tǒng)進(jìn)行抗原提呈。后一作用通過直接對(duì)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生起作用而達(dá)成，也通過增加II類主要組織相容性復(fù)合物和Fc受體在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上的表達(dá)而達(dá)成。GM-CSF刺激嗜中性白細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、和單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的功能活性。這些包括增強(qiáng)趨化活性，增加細(xì)胞粘附分子的表達(dá)和增加與表面的粘附性，和增加吞噬活性以及抑制和延緩這些細(xì)胞的凋亡。嗜中性白細(xì)胞代表了抗入侵防御的第一線。通過包括GM-CSF的原炎性刺激物能延緩嗜中性白細(xì)胞程序性死亡，確保在正確的時(shí)間和位置使炎癥消退。GM-CSF也能刺激這些細(xì)胞的能力來介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性，并殺死在細(xì)胞內(nèi)的微生物，并對(duì)這些細(xì)胞起"引發(fā)"效果以增強(qiáng)它們對(duì)接下來的氧化爆發(fā)(oxidativeburst)(超氧化物陰離子的產(chǎn)生)刺激的應(yīng)答、脫粒并釋放抗微生物劑、并具有化學(xué)趨化作用。另外，GM-CSF刺激次級(jí)細(xì)胞因子和介質(zhì)從這些細(xì)胞釋放，包括從嗜中性白細(xì)胞中釋》文IL-1、G-CSF、M-CSF、和白細(xì)胞三烯，以及從巨噬細(xì)胞中釋放IL-1、TNF、IL-6，G-CSF、M-CSF、和前列腺素。從以上清楚可知，GM-CSF在活化和維持對(duì)抗感染所必需的細(xì)胞群中起關(guān)鍵的作用。可是，在某些情況下，活化這些細(xì)胞群是不合需要的。例如，當(dāng)未出現(xiàn)病原體的時(shí)候，活化以上細(xì)胞系在許多情況下導(dǎo)致急性和/或慢性炎癥病情，在極端情況下可危及生命。相似地，過表達(dá)GM-CSF可導(dǎo)致過量免疫活化，造成炎癥。在這種情況下，需要中和GM-CSF的活性，從而消除或至少減輕這些炎癥病癥的癥狀。這種中和活性的例子存在于現(xiàn)有技術(shù)中。例如發(fā)現(xiàn)了，中和抗GM-CSF抗體能在外周血樣品中增加嗜曙紅細(xì)胞凋亡率(Kankaanranta等(2000)JournalofAllergyandClinicalImmunology106，77-83)。由于i曾力口p耆曙纟工纟田胞存活與哮喘相關(guān)，因而預(yù)計(jì)增加嗜曙紅細(xì)胞凋亡能減輕哮喘癥狀。在慢性炎性疾病中，如。孝喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和多發(fā)性硬化，GM-CSF的水平會(huì)局部增加并在某些情況下全身性增加，而且與這些疾病中的炎癥過程相關(guān)。因此，本發(fā)明的目的是改進(jìn)對(duì)以前技術(shù)已知的增加了的和/或不希望的GM-CSF活性進(jìn)行中和的模式。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及人單克隆抗體或其片段，其特異結(jié)合并中和靈長(zhǎng)類GM-CSF。本文中所用的術(shù)語"特異結(jié)合"或相關(guān)表述，如"特異的結(jié)合"、"特異地結(jié)合，，、"特異結(jié)合物"等，指人單克隆抗體或其片段區(qū)分出靈長(zhǎng)類GM-CSF和任何數(shù)量的其他不同于靈長(zhǎng)類GM-CSF的潛在抗原的能力如此之高，從多種作為潛在結(jié)合配偶體的不同抗原的匯聚物中，僅結(jié)合或僅顯著結(jié)合靈長(zhǎng)類GM-CSF。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，"顯著，，結(jié)合靈長(zhǎng)類GM-CSF，是指在從作為潛在結(jié)合配偶體的同樣可接觸的多種不同抗原的匯聚物中，比任何其他不同于靈長(zhǎng)類GM-CSF的抗原高至少10倍、優(yōu)選50倍、最優(yōu)選100倍或更高頻率(在動(dòng)力學(xué)意義上)地結(jié)合靈長(zhǎng)類GM-CSF的時(shí)候。這些動(dòng)力學(xué)測(cè)量可在Biacore設(shè)備上進(jìn)行。本文中所用的"中和"、"中和劑"、"中和"和其語法上相關(guān)的變體指部分或完全減弱GM-CSF的一種或多種生物學(xué)效應(yīng)。該GM-CSF的一種或多種生物學(xué)效應(yīng)的部分或完全減弱可由修飾、阻斷和/或消除GM-CSF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)而造成，如例如在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞、細(xì)胞增殖或釋放可溶性物質(zhì)、上或下調(diào)細(xì)胞內(nèi)基因活化所顯示的，例如導(dǎo)致除了GM-CSF之外的配體的表面受體表達(dá)的那些。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員能理解的是，存在多種模式來確定試劑(例如所論及的抗體或其片段)是否能被劃分為中和劑。例如，這一般可通過如下標(biāo)準(zhǔn)體外測(cè)試來實(shí)現(xiàn)在第一個(gè)增殖實(shí)驗(yàn)中，其增殖程度已知取決于GM-CSF活性的細(xì)胞系，和一系列含各種濃度的GM-CSF—起孵育，孵育后測(cè)定細(xì)胞系的增殖程度。通過這種測(cè)量，確定出能使細(xì)胞半最大增殖程度的GM-CSF濃度。然后進(jìn)行第二個(gè)增殖實(shí)驗(yàn)，其在每一系列樣品中利用第一個(gè)增殖實(shí)驗(yàn)中所用的相同數(shù)量的細(xì)胞、以上確定的GM-CSF濃度、以及此次使用各種濃度的懷疑是GM-CSF中和劑的抗體或其片段。再測(cè)量細(xì)胞增殖以確定足以導(dǎo)致半最大生長(zhǎng)抑制的抗體或其片段的濃度。如果得到的生長(zhǎng)抑制相對(duì)于抗體(或其片段)濃度的圖是S形的，使得隨著抗體(或其片段)濃度增加而降低細(xì)胞增殖，則在一定程度上導(dǎo)致抗體依賴性生長(zhǎng)抑制，即以某種程度中和了GM-CSF活性。在這種情況下，抗體或其片段可被認(rèn)為是本發(fā)明范圍內(nèi)的"中和劑"。其增殖程度已知取決于GM-CSF活性的細(xì)胞系的一個(gè)例子是TF-1細(xì)胞系，其如Kitamura，T.等(1989).JCellPhysiol140,323-34所述。如所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，細(xì)胞增殖的程度不是確立中和能力的唯一參數(shù)。例如，測(cè)定其分泌水平依賴于GM-CSF的信號(hào)傳遞分子(如細(xì)胞因子)的水平，可用于鑒定可疑的GM-CSF中和劑?？捎糜诖_定所論及的抗體或其片段是否是靈長(zhǎng)類GM-CSF活性的中和劑的細(xì)胞系的其他例子包括AML-193(Lange,B.等(1987).Blood70,192-9);GF-D8(Rambaldi,A.等(1993).Blood81，1376-83);GM/SO(Oez，S.等(19卯).ExperimentalHematology18，1108-11);M07E(Avanzi,G.C.等(19卯).JournalofCellularPhysiology145,458-64);TALL-103(Valtieri,M.等(1987).JournalofImmunology138,4042-50);UT-7(Komatsu,N.等(1991).CancerResearch51，341-8)。本發(fā)明所述的人抗體或其片段是單克隆的。本文中所用的術(shù)語"單克隆的"應(yīng)被理解為具有其現(xiàn)有技術(shù)中所述的典型含義，即產(chǎn)生于產(chǎn)抗體的細(xì)胞(如B細(xì)胞)的單克隆中、并識(shí)別所結(jié)合抗原上的單個(gè)表位的抗體(或其相應(yīng)片段)。尤其難于制備單克隆的人抗體。與用永生化的細(xì)胞系融合鼠B細(xì)胞相反，融合人B細(xì)胞和永生化的細(xì)胞系是不可行的。因此，本發(fā)明的的單克隆性質(zhì)使其尤其適于用作治療劑，這是因?yàn)樵摽贵w將作為單一、均一的分子種類而存在，其可以被很好地表征并重復(fù)制備并純化。這些因素產(chǎn)生的產(chǎn)物，其生物活性可被高精度地預(yù)測(cè)出，如果要使該分子被管理部門批準(zhǔn)可以向人給藥治療，則這是非常重要的。尤其重要的是，本發(fā)明所述的單克隆抗體(或相應(yīng)片段)是人抗體(或相應(yīng)片段)。為了使抗體試劑能向人給藥治療，很有利的是，該抗體是人源的。在向人患者給藥后，人抗體或其片段將最可能不引發(fā)患者免疫系統(tǒng)的強(qiáng)免疫原性應(yīng)答，即不會(huì)被識(shí)別為"外來的，，非人蛋白。這指不產(chǎn)生宿主(即患者)抗體來抗該治療性抗體，否則宿主抗體就會(huì)阻斷治療性抗體的活性和/或加速患者身體清除治療性抗體，由此阻止其發(fā)揮其所希望的治療效應(yīng))。本文中所用的術(shù)語"人，，抗體應(yīng)被理解為指本發(fā)明的抗體或其片段，其包含包含于人生殖系抗體群內(nèi)的一種或多種氨基酸序列。因此為了在本文中定義，抗體、或其片段可被認(rèn)為是人的，如果它由這種一種或多種人生殖系氨基酸序列組成，即如果所論及的抗體或其片段的一種或多種氨基酸序列與表達(dá)的一種或多種人生殖系氨基酸序列一致?？贵w或其片段也可以看成是人的，如果它由如下序列組成所述序列與其最接近的人生殖系序列的差別不超過由于體高變所帶來的差別。另外，許多非人哺乳動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，如小鼠和大鼠)抗體包含VHCDR3氨基酸序列，其預(yù)計(jì)也存在于表達(dá)的人抗體群中。預(yù)計(jì)存在于表達(dá)的人群(repertoire)中的人或非人源的一個(gè)或多個(gè)任何這種序列也可被認(rèn)為是符合本發(fā)明目的的"人"的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式，靈長(zhǎng)類GM-CSF是人(/7owos，/era)GM-CSF或非人靈長(zhǎng)類GM-CSF。非人靈長(zhǎng)類GM-CSF的尤其優(yōu)選的變體包括長(zhǎng)臂猿(zwmwcwco"cofor,也被稱為西方黑紋長(zhǎng)臂猿)GM-CSF和獼猴科猴子的GM-CSF,例如恒河猴(Macacamw/a〃a)GM-CSF和食蟹猴(Macac"/osc/ciJar^)GM-CSF。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，人單克隆抗體或其片段在人和至少一種上迷猴物種之間顯示出交叉反應(yīng)性。這對(duì)于要向人受試者給藥治療的抗體分子是尤其有益的，這是因?yàn)樵摽贵w通常將在行政審批前必須經(jīng)歷大量試驗(yàn)，其中某些早期試驗(yàn)涉及非人動(dòng)物物種。為了進(jìn)行這些測(cè)試，一般希望用與人遺傳上高度相似的非人物種，這是因?yàn)橛纱双@得的結(jié)果一般將高度預(yù)示出將相同分子向人給藥時(shí)所預(yù)期的相應(yīng)結(jié)果?？墒?，這種基于動(dòng)物試驗(yàn)的預(yù)測(cè)能力至少部分取決于分子的相似性，預(yù)測(cè)能力是非常高的。如本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，當(dāng)抗體分子與人和另一種很相關(guān)的物種中的相同抗原交叉反應(yīng)時(shí)，可以使用該相同抗體分子在人中以及在該很相關(guān)的物種中、例如在一種上述猴物種中進(jìn)行試驗(yàn)。這增加了測(cè)試本身的效率以及這些試驗(yàn)在該抗體在人(從治療角度最終興趣所在的物種)行為方面的預(yù)測(cè)能力。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式，人單克隆抗體可以是IgG抗體。現(xiàn)有公知的是，IgG不僅包含負(fù)責(zé)具有高度區(qū)別性的抗原識(shí)別和結(jié)合的可變抗體區(qū)，而且包含通常在內(nèi)源產(chǎn)生的抗體上出現(xiàn)的重和輕抗體多肽鏈的恒定區(qū)，在某些情況下，甚至在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上帶有碳水化合物修飾。這樣的糖基化一般是IgG型的標(biāo)志，而且部分這些恒定區(qū)組成了完整抗體的所謂Fc區(qū)，已知其能在體內(nèi)引發(fā)出各種效應(yīng)器功能。另外，F(xiàn)c區(qū)介導(dǎo)IgG與Fc受體的結(jié)合，由此延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期并輔助IgG向Fc受體增加的地方——發(fā)炎的組織歸巢。有益的是，IgG抗體是IgGl抗體或IgG4抗體，這些形式是優(yōu)選的，這是因?yàn)樗鼈兊捏w內(nèi)活性機(jī)制被特別好地理解并表征了。對(duì)于IgGl抗體，尤其是這樣子的。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式，人單克隆抗體的片段可以是scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fv、VHH抗體、雙抗體、串聯(lián)的雙抗體、Fab、Fab，或F(ab)2。這些形式通常可被分成兩個(gè)亞型，即由單多肽鏈組成的那些，和包含至少2條多肽鏈的那些。前一亞型的成員包括scFv(包含一個(gè)VH區(qū)和一個(gè)VL區(qū)，它們通過多肽接頭連接成單多肽鏈)；單結(jié)構(gòu)域抗體(包含單個(gè)抗體可變區(qū))，如VHH抗體(包含單VH區(qū))。后一亞型的成員包括Fv(包含一個(gè)VH區(qū)和一個(gè)VL區(qū)，形成分開的多肽鏈，它們非共價(jià)地相互連接)；雙抗體(包含2條非共價(jià)連接的多肽鏈，其中每一條包含2個(gè)抗體可變區(qū)-通常每條多肽鏈有一個(gè)VH和一個(gè)VL-這兩條多肽鏈以頭對(duì)尾構(gòu)型排列而形成二價(jià)抗體分子)；串聯(lián)的雙抗體(雙特異性單鏈FV抗體，其包含具有兩種不同特異性的4個(gè)共價(jià)相連的免疫球蛋白可變VH和VL區(qū)，形成上述雙抗體兩倍大的同二聚體)；Fab(作為一條多肽鏈包含完整的抗體輕鏈，其自身包含了VL區(qū)和完整的輕鏈恒定區(qū)，而且作為另一條多肽鏈，包含一部分抗體重鏈，其包含完整的VH區(qū)和部分重鏈恒定區(qū)，所述2條多肽鏈通過鏈內(nèi)二硫鍵而在分子間相連)；Fab，(如同以上Fab，除了進(jìn)一步還原了包含在抗體重鏈上的二硫鍵)；和F(ab)2(包含2個(gè)Fab，分子，每個(gè)Fab，分子與另一個(gè)Fab，分子通過鏈內(nèi)二硫鍵相連)。一般而言，上文所述類型的抗體片段給設(shè)計(jì)，例如需要在特定緊急情況下臨時(shí)治療給藥的抗體的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)帶來了很大的柔性。例如，可期望減小給藥的抗體大小，從而在治療已知很少有血管分布的組織(例如，關(guān)節(jié))時(shí)增加組織穿透程度。在某些情況下，也可期望增加治療性抗體被清除出身體的速率，所述速率一般通過減少給藥的抗體大小來加速。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式，所述人單克隆抗體或其片段可以呈現(xiàn)為單價(jià)單特異性的；多價(jià)單特異性的，尤其是二價(jià)單特異性的；或多價(jià)多特異性的，尤其是二價(jià)雙特異性的形式。一般而言，多價(jià)單特異性的，尤其是二價(jià)單特異性的抗體，如上文所述的完整人igG，可給它帶來治療優(yōu)勢(shì)，即親合(avidity)效應(yīng)——即相同抗體與相同抗原(本文中的靈長(zhǎng)類GM-CSF)的多個(gè)分子結(jié)合一一可增強(qiáng)該抗體起到的中和作用。本發(fā)明的抗體片段的幾種單價(jià)單特異性形式如上所述(例如，scFv、Fv、VHH或單結(jié)構(gòu)域抗體)。多價(jià)多特異性的，尤其是二價(jià)雙特異性形式的本發(fā)明的人單克隆抗靈長(zhǎng)類GM-CSF抗體，可包括完整的IgG，其中一個(gè)結(jié)合臂結(jié)合靈長(zhǎng)類GM-CSF，而其另一個(gè)結(jié)合臂結(jié)合不同于靈長(zhǎng)類GM-CSF的另一抗原。其他多價(jià)多特異性的，尤其是二價(jià)雙特異性形式，優(yōu)選為人單鏈雙特異性抗體，即重組人抗體構(gòu)建體，其包含2個(gè)上述scFv實(shí)體，通過現(xiàn)有通常已知的小的插入性多肽間隔區(qū)連成一個(gè)連續(xù)的多肽鏈(例如參見WO99/54440,其涉及抗CD19x抗CD3雙特異性單鏈抗體)。在本文中，雙特異性單鏈抗體的范圍內(nèi)所涵蓋的雙特異性單鏈抗體的一個(gè)scFv部分將特異結(jié)合如上所提及的靈長(zhǎng)類GM-CSF，而該雙特異性單鏈抗體的另一個(gè)scFv部分將結(jié)合另一個(gè)確定具有治療利益的抗原。根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式，人單克隆抗體或其片段可以是衍生化的，例如用有機(jī)聚合物，例如用一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇("PEG，，)和/或聚乙烯吡咯烷酮("PVP")分子?，F(xiàn)有已知的是，這種衍生化有益于調(diào)節(jié)抗體或其片段的藥效學(xué)性質(zhì)。尤其優(yōu)選的是衍生為PEG-馬來酰亞胺的PEG分子，其能以位點(diǎn)特異性方式通過半胱氨酸的巰基來與抗體或其片段綴合。在這些中，尤其優(yōu)選的是20kD和/或40kD的PEG-馬來酰亞胺，其可以是分支或直鏈的形式。尤其有益的是增加較小的人抗靈長(zhǎng)類GM-CSF抗體片段(如scFv片段)的有效分子量，其通過將后者與一個(gè)或多個(gè)PEG分子(尤其是PEG-馬來酰亞胺)偶聯(lián)而獲得。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式，人單克隆抗體或其片段特異結(jié)合人或非人靈長(zhǎng)類GM-CSF的表位，尤其是不連續(xù)表位，所述GM-CSF包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/或氨基酸第65-77位(GLR/QGSLTKLKGPL)。上述氨基酸序列第65-77位中的第67位的可變性反映出了作為一方面的人和長(zhǎng)臂猿GM-CSF(其中第67位是R)與作為另一方面的獼猴科猴子(例如獼猴和恒河猴)(其中第67位是Q)之間在靈長(zhǎng)動(dòng)物GM-CSF的這部分中的異質(zhì)性。本文中所用的人和非人靈長(zhǎng)類GM-CSF的編號(hào)指成熟的GM-CSF的，即不帶有其17個(gè)氨基酸信號(hào)序列的GM-CSF(上述人和非人靈長(zhǎng)類物種的成熟的GM-CSF的總長(zhǎng)度都是127個(gè)氨基酸)。人GM-CSF和長(zhǎng)臂猿GM-CSF的序列如下APARSPSPSTQPWEHVNAIQMRRLLN潔Z7TAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMM某些獼猴科成員(例如恒河猴和食蟹猴)的GM-CSF序列如下APARSPSPGTQPWEHVNAIQEARRLLN雄DTAAE廳KTVEVVSEMFDLQEPSCLQTRLELYKQGLQGSLTKLKGPLTMM上述本發(fā)明的人單克隆抗體(或其片段)所結(jié)合的最小表位(更好是不連續(xù)表位)在以上GM-CSF序列中用粗體字表示。本文中所用的術(shù)語"不連續(xù)表位，，應(yīng)被理解為是給定多肽鏈(本文中的成熟的人和非人靈長(zhǎng)類GM-CSF)中至少2個(gè)不相鄰的氨基酸序列區(qū)段(stretch)，其與同時(shí)并特異地(如上所定義)與抗體結(jié)合。根據(jù)該定義，該同時(shí)的特異結(jié)合可以是針對(duì)線形的GM-CSF多肽的。在本文中，可以設(shè)想成熟的GM-CSF多肽形成了延伸的環(huán)，在環(huán)的一個(gè)區(qū)域中以上面粗體字所指示的2個(gè)序列排成排，例如或多或少互相平行和彼此接近。在該狀態(tài)下，它們特異并同時(shí)與本發(fā)明的抗體片段結(jié)合。根據(jù)該定義，以上所示的成熟GM-CSF的2個(gè)序列段的同時(shí)特異結(jié)合也可以采取抗體與構(gòu)象表位結(jié)合的形式。在本文中，成熟的GM-CSF已經(jīng)形成了其通常在體內(nèi)所形成的三級(jí)構(gòu)象(Sun，H.W.,J.Bernhagen，等(1996).ProcNatlAcadSciUSA93,5191-6)。在該三級(jí)構(gòu)象中，成熟的GM-CSF多肽鏈以如下方式折疊使以上所示的2條序列區(qū)段處于空間相鄰的位置，例如在成熟、折疊的GM-CSF的特定區(qū)域的外表面，在此它們根據(jù)周圍的多肽序列背景下的其三維構(gòu)象來被識(shí)別。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，以上(不連續(xù))表位還包含氨基酸第28-31位(LSRD)，其在以上人和非人靈長(zhǎng)類GM-CSF序列中以斜體表示。在尤其優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，以上(不連續(xù))表位中的任一個(gè)還包含氨基酸第32-33位(TA)和/或氨基酸第21-22位(EA)，其中每個(gè)區(qū)段分別是以上人和非人靈長(zhǎng)類GM-CSF序列中下劃了線的。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式，人單克隆抗體或其片段在其重鏈可變區(qū)中包含CDR3，所述CDR3包含選自由SEQIDNO:l-13或56之任一所列的那些所組成的組的氨基酸序列。優(yōu)選的是人單克隆抗體或其片段，其包含如SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重《連可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:1所示的重《連可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:2所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:3所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重《連可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重《連可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:4所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:5所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:6所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:7所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重4連可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:8所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:9所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:IO所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:11所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:12所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重《連可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:13所示的重鏈可變區(qū)CDR3序列；或包含如SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列、如SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列和如SEQIDNO:56所示的重《連可變區(qū)CDR3序列。更優(yōu)選的是，CDR1、CDR2和CDR3序列的以上14個(gè)組合之任一存在于人單克隆抗體或其片段中，該人單克隆抗體或其片段進(jìn)一步在其輕鏈可變區(qū)中包含含SEQIDNO:16所示氨基酸序列的CDR1、含SEQIDNO:17所示氨基酸序列的CDR2、和含SEQIDNO:18所示氨基酸序列的CDR3。根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式，本發(fā)明的人單克隆抗體或其片段在其輕鏈可變區(qū)中包含如SEQIDNO.19所示的氨基酸序列。優(yōu)選的是人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:20所示氨基酸序列的；或人單克隆抗體或其片段，輕4連可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:21所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:22所示氨基酸序列的；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:23所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:24所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:25所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重《il可變區(qū)包含如SEQIDNO:26所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:27所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:28所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:29所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:30所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:31所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:32所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:33所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:52所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.19所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:53所示氨基酸序列。根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式，本發(fā)明的人單克隆抗體或其片段在其輕鏈可變區(qū)中包含如SEQIDNO.54所示的氨基酸序列。優(yōu)選的是人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:20所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:21所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:22所示氨基酸序列的；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:23所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:24所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:25所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:26所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:27所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:28所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:29所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:30所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:31所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:32所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:33所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:52所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.54所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:53所示氨基酸序列。根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式，本發(fā)明的人單克隆抗體或其片段在其輕鏈可變區(qū)中包含如SEQIDNO.55所示的氨基酸序列。優(yōu)選的是人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDN0.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:20所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:21所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:22所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:23所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:24所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:25所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:26所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:27所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:28所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:29所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:30所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:31所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:32所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:33所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:52所示氨基酸序列；或人單克隆抗體或其片段，輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO.55所示氨基酸序列，重鏈可變區(qū)包含如SEQIDNO:53所示氨基酸序列。優(yōu)選的具體實(shí)施方式提供了人單克隆抗體或其片段，在其輕鏈可變區(qū)中包含含如SEQIDNO.16所示氨基酸序列的CDRl區(qū)、具有如SEQIDNO.17所示氨基酸序列的CDR2區(qū)和具有如SEQIDNO.18所示氨基酸序列的CDR3，并在其重鏈可變區(qū)中包含含如SEQIDNO.14所示氨基酸序列的CDRl區(qū)、具有如SEQIDNO.15所示氨基酸序列的CDR2區(qū)和具有如SEQIDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或56之任一所示氨基酸序列的CDR3。在另一優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，人單克隆抗體在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:35所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:36所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:37所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:38所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:39所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:40所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:41所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:42所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:43所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:44所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:45所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:46所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:47所示的氨基酸序列；或在其輕鏈中包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列并在其重鏈中包含如SEQIDNO:48所示的氨基酸序列。以上優(yōu)選的具體實(shí)施方式提供了人單克隆抗體分子和/或其片段，其尤其益于作為靈長(zhǎng)類(尤其是人)的GM-CSF活性的中和劑。這些尤其優(yōu)選的具體實(shí)施方式所述的人單克隆抗體或其片段由于幾個(gè)原因而很有益。首先，它們高度特異地識(shí)別靈長(zhǎng)類GM-CSF,也就是說從靈長(zhǎng)類GM-CSF與其它靈長(zhǎng)類集落刺激因子(例如靈長(zhǎng)類G-CSF和M-CSF)的混合GM-CSF,而在相同環(huán)境中不識(shí)別其他集落刺激因子。這是指，這些具體實(shí)施方式所述的人單克隆抗體或其片段，在向人給藥時(shí)，將被預(yù)見到只能特異結(jié)合并中和所需的靶，而并不結(jié)合與中和其他不希望的靶。最終，這導(dǎo)致了關(guān)于體內(nèi)治療作用模式的高度可預(yù)測(cè)性。第二，這些尤其優(yōu)選的具體實(shí)施方式的結(jié)合物以非常高的親和力結(jié)合靈長(zhǎng)類GM-CSF。對(duì)于該類分子所觀察到的Kd但從約4x10一M低至約0.04xl(T9M,后者相當(dāng)于約40pM。由于在含水介質(zhì)中該分子的動(dòng)力學(xué)結(jié)合速率極大地受擴(kuò)散控制，因此不能提高到超出在生理?xiàng)l件下局部擴(kuò)散條件所能達(dá)到的速率，因此低的Kd主要由動(dòng)力學(xué)解離速率(&ff)造成，A。ff對(duì)于親和力最高的抗體結(jié)合物來說約為10-5s—'。這是指，一旦作為一方的本發(fā)明這些具體實(shí)施方式所述的人單克隆抗體或其片段與作為另一方的靈長(zhǎng)類GM-CSF之間形成復(fù)合物，就不能容易地、或至少不能迅速地分離。對(duì)于要作為生物活性中和劑的結(jié)合分子來說，這些特點(diǎn)是高度有益的，這是因?yàn)樗Ｍ闹泻托Чǔ⒅荒墚?dāng)其生物活性要被中和的分子(本文中的靈長(zhǎng)類GM-CSF)仍舊被中和性結(jié)合分子結(jié)合時(shí)才能持續(xù)。因此，仍長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合其所要結(jié)合的靶的中和性分子將繼續(xù)中和相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間。人單克隆抗體或其片段與靈長(zhǎng)類GM-CSF的高度結(jié)合親和力也具有優(yōu)勢(shì)。通常，抗體或其片段將以大小依賴性的形式從患者血流中被清除出，排出并清除較小的分子，然后是較大的。由于2種多肽(抗體或抗體片段和所結(jié)合的GM-CSF)的復(fù)合物明顯大于抗體本身，因此上述低A:。ff使得治療性中和劑比它不結(jié)合GM-CSF的情況更慢地從患者身體中被排出并清除。因此，中和活性的幅度與其體內(nèi)持續(xù)時(shí)間都增加了。最后，這些尤其優(yōu)選的具體實(shí)施方式所述的結(jié)合物所確定的中和活性出人意料地高。如將在下文中更具體地描述的，可利用TF-1生長(zhǎng)抑制測(cè)試進(jìn)行體外測(cè)量中和活性(Kitamura，T.等(1989).JCellPhysiol140,323-34)。測(cè)定IC5。值作為中和潛力的指標(biāo)，IC5()表示本發(fā)明這些具體實(shí)施方式所述的人單克隆抗體或其片段引發(fā)半最大TF-1細(xì)胞增殖抑制所需的濃度。對(duì)于本發(fā)明這些具體實(shí)施方式所述的人單克隆抗體或其片段，確定的ICso值約為3xl(r1GM、或約為0.3nM。因此，本發(fā)明這些具體實(shí)施方式所述的結(jié)合分子是靈長(zhǎng)類GM-CSF活性的很強(qiáng)有力的中和劑。然后，總之，本發(fā)明以上具體實(shí)施方式所述的人單克隆抗體或其片段顯示出對(duì)所希望的抗原的高度區(qū)分能力，非常牢固地結(jié)合該抗原并持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間，并在它所結(jié)合的長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)顯示出高度有效的中和活性。同時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間保持結(jié)合物-抗原復(fù)合物能減緩該結(jié)合物從身體中被清除，由此延長(zhǎng)所希望的體內(nèi)治療效果的持續(xù)時(shí)間。本發(fā)明的另一方面提供了人單克隆抗體或其片段，其包含與如SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一所示的氨基酸有至少70%同源性的氨基酸序列。同源性可通過標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)程序來確定，如VectorNTI(InforMax，Maryland,美國(guó))。該程序在一個(gè)氨基酸一個(gè)氨基酸的基礎(chǔ)上比較被比對(duì)的序列，并設(shè)置各種水平的比較嚴(yán)謹(jǐn)度(如等同氨基酸、保守氨基酸替換等)。作為本文中所用的術(shù)語，如果它們每一個(gè)屬于相同的化學(xué)組別，即酸性、非極性、不帶電荷的極性和堿性組，則所論及的2個(gè)氨基酸被認(rèn)為是互相"保守的替換"。例如而不限于，2個(gè)屬于非極性氨基酸組的不同氨基酸被認(rèn)為是互相"保守的替換"，即使這2個(gè)氨基酸不相同，而非極性氨基酸和堿性氨基酸不被認(rèn)為是互相"保守的替換"。Alberts,Johnson,Lewis,Raff，Roberts和Walter的"MolecularBiologyoftheCell"(第4版(2002))的第3.1節(jié)把氨基酸分成四個(gè)主要的組酸性、非極性、不帶電荷的極性和堿性。該分組方式可用于在本發(fā)明中確定特定氨基酸是否能保守替換另一個(gè)所論及的氨基酸。本發(fā)明的另一方面提供了多核苷酸分子，其具有編碼如SEQIDNO:1-48和/或52至56之任一所示氨基酸序列的核香酸序列或與其顯示出有至少70%同源性的核苷酸序列，其中同源性可通過序列比對(duì)(如上述針對(duì)氨基酸序列的)比較編碼SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一的氨基酸序列的核苷酸序列與所論及的核苷酸序列來確定，如果其與編碼SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一的相應(yīng)氨基酸序列的核苷酸序列中的相應(yīng)核苷酸是等同的，或如果所論及的序列與編碼SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一的氨基酸序列的核苷酸序列中的相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的區(qū)別形成了核苷酸三聯(lián)體，該三聯(lián)體被翻譯后會(huì)形成等同于(由于簡(jiǎn)并三聯(lián)體)SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一的相應(yīng)氨基酸序列中的相應(yīng)氨基酸或其保守替換，則所論及的序列中的核苷酸被認(rèn)為是同源的。在本文中，術(shù)語"保守的替換"如上述來理解。本發(fā)明的另一方面提供了藥物組合物，其包含人單克隆抗體或其片段或多核苷酸分子，所述多核苷酸分子具有編碼如SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一所示氨基酸序列、或編碼包含與SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一有至少70%同源性的氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中"同源性"與上文解釋的一樣理解。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"藥物組合物"涉及向患者(優(yōu)選人患者)給藥的組合物。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，藥物組合物包含用于非腸道、透皮、內(nèi)腔內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、膜內(nèi)和/或鼻內(nèi)給藥或直接注射入組織的組合物。尤其關(guān)注的是，所述藥物組合物通過輸注或注射向患者給藥。合適組合物的給藥由不同方式達(dá)成，如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、局部或皮內(nèi)給藥。本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。合適的藥物載體的例子是現(xiàn)有公知的，包括磷酸鹽緩沖鹽溶液、水、乳劑(如油/水乳劑)、各類保濕劑、無菌溶液、脂質(zhì)體等。包含這些載體的組合物可通過公知的常規(guī)方法來配制。這些藥物組合物可以合適的劑量向受試者給藥。劑量方案可由參與的醫(yī)生和臨床因素來確定。如現(xiàn)有醫(yī)學(xué)技術(shù)所公知的，對(duì)于任一患者的劑量取決于許多因素，包括患者的身材、身體表面積、年齡、給藥的特定化合物、性別、給藥時(shí)間和途徑、綜合健康情況、以及同時(shí)給藥的其他藥物。非腸道給藥的制劑包括無菌含水或非含水溶液、混懸液、和乳劑。非含水溶劑的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)、和可注射的有機(jī)酯(如油酸乙酯)。含水載體包括水、醇/含水溶液、乳劑或混懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。非腸道載體包括氯化鈉溶液、Ringer氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、含乳酸鹽的(lactated)Ringer氏、或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)載體包括流體和營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)充劑、電解液補(bǔ)充劑(如基于Ringer氏葡萄糖的那些)等。也可含有防腐劑和其他添加劑，例如，抗微生物、抗氧化、鰲合劑、惰性氣體等。另外，本發(fā)明的藥物組合物可包含蛋白質(zhì)載體，像諸如，血清白蛋白或免疫球蛋白，優(yōu)選是人源的。關(guān)注的是，除了(如本發(fā)明所述的)人單克隆抗體或其片段，本發(fā)明的藥物組合物還可包含其他生物活性劑，這取決于藥物組合物所需的用途。該試劑可以是作用于胃腸系統(tǒng)的藥物、起細(xì)胞抑制劑(cytostatica)作用的藥物、防止高尿酸血癥(hyperurikemia)的藥物、抑制免疫反應(yīng)的藥物(如皮質(zhì)類固醇)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的藥物、作用于循環(huán)系統(tǒng)的藥物和/或諸如細(xì)胞因子的現(xiàn)有已^口的i式齊寸。本發(fā)明的另一方面提供了人單克隆抗體或其片段如上文所述或多核苷酸分子的用途，所述多核苷酸分子包含編碼如SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一所示氨基酸序列、或編碼包含與SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一有至少70%同源性的氨基酸序列的氨基酸序列的核苦酸序列，其中"同源性"與上文解釋的一樣理解，其用于制備用于治療炎性疾病的藥物，所述藥物任選還包含一種或多種抗炎劑。炎性疾病最好是選自由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(包括對(duì)用TNF-a中和劑治療有耐受性的RA)、哮喘、多發(fā)性硬化(MS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、Crohn氏癥、特發(fā)性肺纖維變性(IPF)、炎性腸病(IBD)、色素層炎、黃斑變性、結(jié)腸炎、牛皮癬、沃勒變性、抗磷脂綜合癥(APS)、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、復(fù)發(fā)性多軟骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失敗的整形外科植入、腎小球腎炎、狼瘡或自身免疫疾病所組成的組。特別感興趣的是本發(fā)明所述的人單克隆抗體或其片段用于制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(包括對(duì)用TNF-a中和劑治療有耐受性的RA)、譯喘、MS和/或Crohn氏癥的藥物的用途。對(duì)于RA、哮喘和/或MS，有兩種流行的理論涉及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)病機(jī)理。第一種認(rèn)為，T細(xì)胞通過與還未鑒定出的抗原相互作用而是引發(fā)疾病并操控慢性炎癥過程的主要細(xì)胞。該理論基于RA滑膜中RA與II類主要組織相容性抗原、大量CD4+T細(xì)胞和非對(duì)稱的T細(xì)胞受體基因利用情況的已知關(guān)聯(lián)性。GM-CSF已知通過提高II類MHC表達(dá)增強(qiáng)抗原提呈功能，而且由T細(xì)胞產(chǎn)生了GM-CSF，根據(jù)該基于T細(xì)胞的假說表明了GM-CSF在疾病進(jìn)程中的推測(cè)的作用。第二種理論認(rèn)為，盡管T細(xì)胞對(duì)于引發(fā)疾病是重要的，然而慢性炎癥通過巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以T細(xì)胞非依賴性方式而自身永久存在。該理論基于在慢性RA中相對(duì)缺乏活化的T細(xì)胞表型而活化的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表型占優(yōu)勢(shì)。GM-CSF是巨噬細(xì)胞的有力的刺激劑，并能促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖。如ELISA或mRNA研究所測(cè)得的，已知主要由"效應(yīng)器"細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)和結(jié)締組織細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)產(chǎn)生的GM-CSF在RA滑膜和滑液中大量表達(dá)。根據(jù)RA的"巨噬細(xì)胞-成纖維細(xì)胞理論"，這2種細(xì)胞類型似乎主要負(fù)責(zé)產(chǎn)生慢性炎癥的自身永久存在狀態(tài)，其中T細(xì)胞的參與不再是關(guān)鍵的。在該情景中，活化的巨噬細(xì)胞不斷分泌能維持滑膜成纖維細(xì)胞活化狀態(tài)的IL-1和TNF。成纖維細(xì)胞依次分泌大量a)細(xì)胞因子——L6、IL8和GM-CSF;b)前列腺素；和c)蛋白酶。GM-CSF反饋以促進(jìn)新補(bǔ)充的單核細(xì)胞成熟為巨噬細(xì)胞。IL-8和IL-6也對(duì)其他細(xì)胞群的補(bǔ)充和/或活化起作用，而前列腺素和蛋白酶直接用于侵蝕并摧毀附近的結(jié)締組織，如骨骼和軟骨。對(duì)于Crohn氏癥，來自酵母的重組人粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rGM-CSF)顯示出對(duì)治療中度至重度Crohn氏癥有功效(DieckgraefeBK，KorzenikJR(2002).Lancet360,1478-80)。此后，幾篇綜述性文章推測(cè)了該有力的促炎性細(xì)胞因子在該疾病(據(jù)信是有炎癥性質(zhì)的)中的治療效果。對(duì)于rGM-CSF作用模式的可能的解釋包括Crohn氏癥中的免疫缺陷成分、Th2時(shí)滯(skewing)、以及擴(kuò)增了樹突狀細(xì)胞來促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化(WilkNJ，VineyJL(2002).CurrOpinInvestDrugs3，1291-6;FolwacznyC等(2003).EurJGastroenterolHepatol15,621-6)。本發(fā)明人相信，應(yīng)采用較簡(jiǎn)單的作用模式，其同時(shí)與GM-CSF在其他促炎性疾病中的已知作用相一致。GM-CSF是已知最有力的佐劑之一，這就是為什么在大量正在進(jìn)行的免疫接種試驗(yàn)中要聯(lián)合給藥該細(xì)胞因子。同時(shí)，GM-CSF是高度免疫原性的(RagnhammarP等(1994).Blood84，4078-87)。最近期的研究(RiniB等(2005)Cytokine29，56-66)顯示在Crohn氏癥試驗(yàn)中，每天用來自酵母的rGM-CSF皮下給藥，進(jìn)行治療(DieckgraefeBK,KorzenikJR(2002).Lancet360，1478-80)，在3個(gè)月內(nèi)會(huì)使87%(13/15)的前列腺癌患者產(chǎn)生抗該細(xì)胞因子的抗體。60%的患者(9/15)會(huì)產(chǎn)生(多克隆)GM-CSF中和性抗體。在Crohn氏癥試驗(yàn)中沒有調(diào)查對(duì)GM-CSF的中和性應(yīng)答的可能性，也沒有確定療法中的GM-CSF血清水平。在本發(fā)明具體實(shí)施方式的范圍內(nèi)，預(yù)計(jì)用rGM-CSF治療的Crohn氏癥患者不僅直接應(yīng)答細(xì)胞因子的免疫刺激活性，而且在臨床上，至少部分應(yīng)答抗體應(yīng)答，該抗體應(yīng)答中和了給藥的和內(nèi)源性的GM-CSF,其已知在Crohn氏癥中過量產(chǎn)生(AgnholtJ等(2004)EurJGastroenterolHepatol16,649-55)。然后，中和性的抗GM-CSF抗體可在Crohn氏癥中具有與rGM-CSF相似的治療活性，如上文所預(yù)計(jì)的，這應(yīng)被認(rèn)為是替代療法。本發(fā)明的另一方面提供了如上文所述人單克隆抗體或其片段或多核苷酸分子的用途，所述多核苷酸分子包含編碼如SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一所示氨基酸序列、或編碼包含與SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一有至少70%同源性的氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中"同源性"與上文解釋的一樣理解，其用于制備用于治療腫瘤性疾病或延緩細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞存活或增殖的其他病癥的藥物，所述藥物任選包含一種或多種其他抗癌劑。優(yōu)選的肺瘤性疾病是癌，其中尤其優(yōu)選白血病、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌或皮膚癌。Olver等((2002)CancerChemotherPharmacol.50,171-8)在患有已知表達(dá)GM-CSF受體的實(shí)體肺瘤的患者中皮下給藥應(yīng)用了GM-CSF拮抗劑E21R，僅造成PSA血清水平暫時(shí)降低。另外，在急性髓細(xì)胞樣白血病("AML")中應(yīng)用該GM-CSF拮抗劑未顯示出臨床活性(Jakupovic等(2004)Blood103,3230-2.)。更進(jìn)一步，向AML患者應(yīng)用抗GM-CSF單克隆抗體，即使有足夠的抗體體內(nèi)血清水平和生物活性，但仍未顯示出抗白血病效應(yīng)(Bouabdallah等(1998)LeukLymphoma30,539-49)。作者因此斷定用抗GM-CSF抗體治療對(duì)AML患者是無效的。本發(fā)明現(xiàn)在將在以下非限制性的實(shí)施例和附圖中更詳細(xì)地描述，總體情況如下圖1用ELISA確定的在4或5輪噬菌體展示淘選后獲得的各種抗rhGM-CSFscFv分子的吸收強(qiáng)度(與結(jié)合強(qiáng)度成正比例)圖2基于流式細(xì)胞計(jì)的測(cè)試所確定的各種抗rhGM-CSFscFv和其他測(cè)試分子的平均熒光強(qiáng)度(與中和強(qiáng)度成反比)圖3利用抗rhGM-CSFscFv分子5-306進(jìn)行的TF-1增殖抑制測(cè)試的結(jié)果圖4用ELISA確定的在4或5輪噬菌體展示淘選后獲得的各種人抗rhGM-CSFscFv分子的吸收強(qiáng)度(與結(jié)合強(qiáng)度成正比)圖5利用各種有代表性的人抗rhGM-CSFscFv擊中分子(hit)進(jìn)行的TF-1增殖抑制測(cè)試的結(jié)果圖6人單克隆抗體對(duì)人GM-CSF和其他人集落刺激因子的結(jié)合特異性圖7表征人單克隆抗GM-CSF抗體和其片段動(dòng)力學(xué)結(jié)合的表面等離子共振測(cè)量圖8A非人靈長(zhǎng)類GM-CSF和人GM-CSF的序列比對(duì)圖8B表示人單克隆抗GM-CSF片段與人GM-CSF結(jié)合的肽斑點(diǎn)的放射圖圖9利用各種有代表性的人抗rhGM-CSFscFv抗體片段進(jìn)行的TF-1增殖抑制測(cè)試的定性結(jié)果圖10利用各種有代表性的人抗rhGM-CSFIgG和相應(yīng)scFv片段進(jìn)行的TF-1增殖抑制測(cè)試的定量結(jié)果圖11利用各種有代表性的人抗rhGM-CSFscFv抗體片段進(jìn)行的IL8產(chǎn)量測(cè)試的定量結(jié)果圖12利用各種有代表性的人抗macGM-CSFIgG和相應(yīng)scFv片段進(jìn)行的TF-1增殖抑制測(cè)試的定量結(jié)果圖13顯示出抗GM-CSF抗體IgGB對(duì)重組人GM-CSF和來自各種非靈長(zhǎng)類物種的GM-CSF結(jié)合的選擇性的比較結(jié)合研究結(jié)果圖14調(diào)查抗GM-CSF抗體IgGB的中和能力對(duì)GM-CSF糖基化的依賴性的測(cè)試結(jié)果圖15抗GM-CSF抗體IgGB對(duì)GM-CSF介導(dǎo)的嗜曙紅細(xì)胞存活影響的研究結(jié)果圖16抗GM-CSF抗體IgGB對(duì)GM-CSF介導(dǎo)的嗜曙紅細(xì)胞活化影響的研究結(jié)果圖17利用抗GM-CSF抗體IgGB的離體(exvivo)毒理研究的結(jié)果，其基于粒細(xì)胞的吞噬(A-C)和氧化爆發(fā)(D-F)而測(cè)定圖18利用抗GM-CSF抗體IgGB的離體毒理研究的結(jié)果，其基于單核細(xì)胞的吞噬作用(A-C)和氧化爆發(fā)(D-F)而測(cè)定實(shí)施例實(shí)施例1:獲得用于產(chǎn)生中和性人抗體和其片段的重組人("rh，，)GM-CSF抗原實(shí)施例1.1:克隆、表達(dá)和純化rhGM-CSF抗原通過PCR導(dǎo)入的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)Ndel和Xhol,將編碼人GM-CSF抗原的基因從表達(dá)載體pORF-hGM-CSF(Novagen,美國(guó))亞克隆到pET22b(+)載體(Novagene，美國(guó))上。pET22b(+)中編碼hGM-CSF的基因與pdB前導(dǎo)序列融合，其適于在大腸桿菌周質(zhì)中表達(dá)。蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和純化根據(jù)廠商所述來進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，用表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3并于37。C在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，長(zhǎng)到600nm處的光密度為0.5-0.8。加入IPTG至1mM并降低溫度至25。C來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生。利用20%蔗糖溶液的滲透壓休克，選擇性破壞細(xì)胞壁并保持細(xì)胞膜完整，來進(jìn)行周質(zhì)制備。天然的hGM-CSF含兩個(gè)二硫橋接，而在大腸桿菌氧化性周質(zhì)中的表達(dá)能形成這些對(duì)于功能重要的二硫橋接。通過固定化金屬親和層析(IMAC)和凝膠過濾，以2步純化過程來純化重組人GM-CSF("rhGM-CSF，，)。層析使用AktaFPLC系統(tǒng)(Pharmacia)和Unicorn軟件。所有的化學(xué)物質(zhì)都是研究等級(jí)的，購(gòu)自Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。根據(jù)廠商提供的規(guī)程，利用QiagenNi-NTA超流柱進(jìn)行IMAC。用緩沖液A2(20mM磷酸鈉pH7.2，0.4MNaCl)平衡該柱，并將周質(zhì)制品(periplasmicpreparation,"PPP，，)(100mL)以2mL/分的流速上樣于該柱(2mL)。用5倍柱體積的5。/。緩沖液B2(20mM磷酸鈉pH7.2，0.4MNaCl，0.5M咪唑)洗柱以去除未結(jié)合的樣品。用5倍柱體積的100。/。緩沖液B2洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。合并洗脫的蛋白質(zhì)級(jí)分，以進(jìn)一步純化。在用PBS(Gibco)平衡的Superdex200制備級(jí)柱(Pharmacia)上進(jìn)行凝膠過濾層析。洗脫的蛋白質(zhì)樣品(流速1mL/分)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE和免疫印跡檢測(cè)。純化前，校正柱以確定分子量(分子量標(biāo)記試劑盒，SigmaMWGF-200)。測(cè)量OD280nm并利用序列特異性分子消光系數(shù)計(jì)算，來確定蛋白質(zhì)濃度。實(shí)施例1.2:生物素化rhGM-CSF抗原為了進(jìn)行噬菌體文庫(kù)篩選，產(chǎn)自大腸桿菌的rhGM-CSF抗原(見上)被生物素化。在樣品混合器(Dynal)中，在含5%DMSO(Sigma)和摩爾數(shù)過量5倍的易于連接的硫化NHS-LC-LC-生物素(EZ-LinkSulfoNHS-LC-LC-Biotin)(Pierce)的PBS中于室溫進(jìn)行生物素化1小時(shí)。為了分離游離的生物素和生物素化的rhGM-CSF抗原，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行陰離子交才爽層才斤(ResourceQ，AmershamBiosciences)。在兩種方法(#皮命名為A和B，如下所述)中，層析都會(huì)造成兩個(gè)洗脫峰。在A情況下，首先洗脫的峰通過第二步陰離子交換層析步驟(與以上相同的條件)再次被分成兩個(gè)洗脫峰。之后將得到的級(jí)分梯度稀釋(稀釋度1:2;由峰高確定的起始濃度為6|ig/mL),包被于96孔ELISA板，并檢測(cè)。進(jìn)行檢測(cè)時(shí)利用A),用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠Fab2特異性多克隆抗體(Dianova，1Hg/mLPBS/1%BSA)檢測(cè)的抗人GM-CSF抗體M500-A(Sigma,2.5嗎/mL，溶于PBS/1。/。BSA)和B)用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗大鼠Fab2多克隆抗體(Dianova，1pg/mLPBS/1%BSA)檢測(cè)的母本抗體(1jug/mLPBS/1%BSA)。成功的生物素化用相似的ELISA實(shí)驗(yàn)來確證，其利用辣根過氧化物酶綴合的抗生物素蛋白鏈菌素(Dako，lpg/mLPBS/1%BSA)來進(jìn)行。加入OPD底物溶液(Sigma)來放大信號(hào)，并在492nm波長(zhǎng)(參照波長(zhǎng)620nm)處檢測(cè)。為了評(píng)估生物素化的程度，利用陰離子交換級(jí)分直接進(jìn)行上述ELISA,或與6.7x1()7個(gè)抗生物素蛋白鏈菌素磁主朱(DynabeadsM-280-抗生物素蛋白鏈菌素，Dynal)—起孵育并輕微震蕩30分鐘后再進(jìn)行。得到的上清液包被在96孔ELISA板的孔上，并如以上所述地進(jìn)行^r測(cè)。ELISA結(jié)果顯示，第二個(gè)洗脫峰含生物素化的rhGM-CSF,而且95%的洗脫的rhGM-CSF是綴合的。利用原始材料作為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估濃度，得到的濃度約為20)ig/mL。根據(jù)下述表征單鏈抗體(scFv)的規(guī)程，在TF-1增殖測(cè)試中證實(shí)了標(biāo)記了生物素的rhGM-CSF保留了生物活性。實(shí)施例1.3:熒光素標(biāo)記rhGM-CSF抗原為了在TF-1細(xì)胞上進(jìn)行結(jié)合研究，產(chǎn)自大腸桿菌的重組人GM-CSF抗原(參見以上實(shí)施例1.2)與熒光素-5(6)-羧氨基己酸N-琥珀酰亞胺酯(Fluka,熒光素-NHS)綴合在一起。在樣品混合器中，在含17.5。/。DMSO和摩爾數(shù)過量5倍的熒光素-NHS的硼酸鹽緩沖液(0.05M硼酸，O.lMNaCl,pH8.5)中于室溫進(jìn)行綴合步驟1小時(shí)。之后，進(jìn)行凝膠過濾(SephadexG25,AmershamBiosciences)將標(biāo)記了熒光素的rhGM-CSF抗原與游離的熒光素-NHS分離。如在485nm波長(zhǎng)(參照波長(zhǎng)535nm)處所測(cè)得的，凝膠過濾能形成兩個(gè)峰，而首個(gè)峰代表標(biāo)記了FITC標(biāo)記的rhGM-CSF。通過定義綴合物的F/P比率來確定標(biāo)記的程度([mg/mL]=(A28?！?.35xA493)x1.08;F/P=(A493/73.000)x(15扁/([mg/mL]》。確定的濃度為0.041mg/mL,其中F/P比率為1.2。實(shí)施例2:產(chǎn)生并選擇中和性人抗GM-CSF抗體和其片段實(shí)施例2.1:克隆來自于雜交瘤HB-9569的母本VH如前述實(shí)施例中所用的，"母本"(maternal)V區(qū)表示所i侖及的V區(qū)源于完整免疫球蛋白分子。如前述實(shí)施例中所用的，"擊中分子"(hit)表示已知能結(jié)合感興趣的抗原的分子，但是還未定量評(píng)估其結(jié)合。"擊中分子"是處于早期表征階段中的分子，可能已經(jīng)進(jìn)行小規(guī)模生產(chǎn)。該分子處于表征的確認(rèn)階段中。如前述實(shí)施例中所用的，"領(lǐng)導(dǎo)"(lead)分子表示其結(jié)合和中和潛力已被定量的分子。已經(jīng)大規(guī)模進(jìn)行了"領(lǐng)導(dǎo)"分子的生產(chǎn)。在以下實(shí)施例中，描述了產(chǎn)生人GM-CSF的完整人單克隆抗體中和劑并產(chǎn)生其片段的一種可能方式。該實(shí)驗(yàn)的目的是分離和亞克隆編碼母本單克隆抗體中的VH的基因，所述母本單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞系HB-9569產(chǎn)生。雜交瘤HB-9569得自ATCC(USA)。雜交瘤細(xì)胞于37。C在5%C02下被培養(yǎng)在ATCC完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)含2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基，使其含1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖、10mMHEPES、和1.0mM丙酮酸鈉，并補(bǔ)充0.05mM2-疏基乙醇、月臺(tái)牛血清10%。為了制備總RNA,使用lxl0個(gè)細(xì)胞并如QiagenOmni-Skript試劑盒(Qiagen,德國(guó))的產(chǎn)品說明書所述來制備RNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress1989,第二版)來合成cDNA。為了分離重鏈V區(qū)DNA，進(jìn)行RT-PCR，其中使用MHALT1R.V:GCCGAATTCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT和RaceGSPrIgG2a/b:CACACCGCTGGACAGGGCTCCAGAGTTCC引物組。用以下PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增于94°C變性15秒，于52。C引物退火50秒和于72°C引物延伸90秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后于72°C最后延伸10分鐘。然后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程分離重鏈DNAV-片段。根據(jù)廠商說明，將重鏈DNAV-片段克隆進(jìn)PCRscript-CAM(Stratagene)中。測(cè)序鑒定序列。實(shí)施例2.2:選擇人VL該實(shí)驗(yàn)的目的是選擇人VL，其能與上述克隆到的母本VH配對(duì)。實(shí)施例2.2.1:從所選的IgD陽性B細(xì)胞中分離RNA從5個(gè)健康人供體中提取100mL血。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，通過水溶性聚蔗糖梯度來分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。為了選擇出IgD陽性細(xì)胞，用20ng小鼠抗人IgD-抗體(PharMingen)包被1mL抗小鼠IgG珠(CELLectionTM泛小鼠IgG試劑盒；DYNAL)。向珠中加入約2.5乂107個(gè)PBMC,并于4°C孵育15分鐘。用1mLRPMI培養(yǎng)基(BioChrom)洗4次后，加入8(iL釋放緩沖液(DNA酶)，使IgD陽性細(xì)胞從珠上釋放出來并轉(zhuǎn)移至新試管中。通過該方法，可獲得0.9x105至3.7x106個(gè)IgD陽性細(xì)胞。根據(jù)廠商的說明書，用RNeasyMidi試劑盒(QIAGEN)從IgD陽性細(xì)胞中分離出總RNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress1989,第二版)來合成cDNA。實(shí)施例2.2.2:PCR擴(kuò)增可變輕鏈區(qū)(VL區(qū))為了分離輕纟連V區(qū)DNA，進(jìn)行RT-PCR,其中4吏用V-k-(5，-huVKl-SacI-2001(5，-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC-3，)、5'-huVK2/4-SacI-2001(5，-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGATGACYCAGTCTCC-3，)、5'陽huVK3-SacI-2001(5'-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGWTGACRCAGTCTCC-3，)、5，-huVK5-SacI-2001(5，-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC-3，)、5，-huVK6-SacI-2001(5，-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGCTGACTCAGTCTCC-3，)、3'-hu-Vk陽Jl-Spel-BsiWI(5，-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC-3，)、3，-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI(5，-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTGATCTCCASCTTGGTCC-3，)、3，-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI(5'-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCC-3，)、3，-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI(5,-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCC-3，)引物組。來自IgD陽性B細(xì)胞的RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA(如上所述)并用作PCR反應(yīng)中的模板DNA。每個(gè)PCR反應(yīng)，用一種5'引物與一種3'引物組合在一起。由5，-和3，引物的可能組合數(shù)量來確定不同PCR反應(yīng)的數(shù)量。用以下PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增于94。C變性15秒，于52°C引物退火50秒和于72°C引物延伸90秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后于72。C最后延伸IO分鐘。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程分離輕鏈DNAV-片段。實(shí)施例2.2.3:文庫(kù)構(gòu)建-克隆人VL群噬菌體展示文庫(kù)一般根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)過程來構(gòu)建，例如公開于"PhageDisplay:ALaboratoryManual";編者Barbas,Burton,Scott&Silverman;ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001的。對(duì)于輕鏈V-片段，為PCR擴(kuò)增所選的引物產(chǎn)生了5'-SacI和3，-SpeI識(shí)別位點(diǎn)。進(jìn)行兩次連接反應(yīng)，每次由400ngk輕鏈片段(用Sacl-Spel消化的)和1400ng質(zhì)粒pBluescriptKS+(用Sacl-Spel消化的；大片段)組成。然后將兩種所得到的抗體V-輕鏈群通過電穿孔(2.5kV，0.2cm開口的電擊杯，25mF，200Ohm,Biorad基因脈沖器)轉(zhuǎn)化入300電感受態(tài)大腸桿菌XLlBlue,形成大小為5.8x108個(gè)獨(dú)立克隆的文庫(kù)。來自不同PCR擴(kuò)增的k(輕鏈)DNA片段對(duì)于每個(gè)連接按如下稱重每種5，引物限定了特定的組。在這些組內(nèi)，3，引物限定了亞組。亞組按l:2:1:1稱重，對(duì)應(yīng)于引物3，-hu-Vk-Jl-SpeI-BsiWI:3，-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI:3，-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI:3，-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI。根據(jù)生殖系分布來給組稱重1:1:1:0.2:0.2,對(duì)應(yīng)于引物5,-huVKl-Sac-2001:5，-huVK3-Sac-2001:5，-huVK2/4-Sac-2001:5，-huVK5-Sac-2001:5，-huVK6-Sac-2001。電穿孔后，將測(cè)試物酵育于SOC肉湯(Fluka)中，用來表現(xiàn)出表型。然后將培養(yǎng)物孵育于含50jig/mL羧千青霉素和2%w/v葡萄糖的500mLSB選擇培養(yǎng)基中過夜。第二天，通過離心來收獲細(xì)胞，并利用商品化的質(zhì)粒制備試劑盒(Qiagen)來進(jìn)行質(zhì)粒制備。實(shí)施例2.2.4:構(gòu)建抗體文庫(kù)——人VL-母本VH進(jìn)行PCR來從上述實(shí)施例2.1中的含母本VH的載體中擴(kuò)增母本VH。為了擴(kuò)增，按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行PCR規(guī)程，其中利用了5'引物MVH8(5，-GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGAGCT陽3，)和3'引物3，-MuVHBstEII(5，-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3，)。從分析性瓊脂糖凝膠上純化出約350bp的擴(kuò)增產(chǎn)物之后，用限制性內(nèi)切酶BstEII和Xhol切DNA片段。然后消化噬菌粒pComb3H5BHis(該載體在RalfLutterbiise博士的學(xué)位論文中有述)，并用上述片段連接大片段。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1blue之后，在100mLSB培養(yǎng)基(含50)ig/mL羧千青霉素)中培養(yǎng)單克隆，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來制備質(zhì)粒。通過測(cè)序插入片段來確證克隆成功(Sequiserve,Munich)。用限制性內(nèi)切酶Sacl和Spel消化該載體pComb3H5BHis/母本VH。分離大載體片段。含來自于實(shí)施例2.2.3的VK文庫(kù)的質(zhì)粒DNA被限制性內(nèi)切酶Sacl和Spel限制性酶切。分離小VK片段條帶(約350bp)。用400ngVK片段連接U00ng載體片段，并通過電穿孔(2.5kV，0.2cm開口的電擊杯，25mF,200Ohm)轉(zhuǎn)化入300/iL電感受態(tài)大腸桿菌XL1Blue,形成大小為2.8x108個(gè)獨(dú)立克隆的總scFv文庫(kù)。在表現(xiàn)出表型并緩慢適應(yīng)羧芐青霉素后，抗體文庫(kù)轉(zhuǎn)移到SB-羧芐青霉素(50|ig/mL)選擇培養(yǎng)基中。然后以1x1012粒輔助噬菌體VCSM13的感染劑量來感染抗體文庫(kù)，由此產(chǎn)生絲狀M13噬菌體并使其分泌，其中每個(gè)噬菌體顆粒含編碼半人scFv片段的單鏈pComb3H5BHis-DNA,并展示出與噬菌體衣殼蛋白III翻譯融合的相應(yīng)scFv-蛋白質(zhì)。實(shí)施例2.2.5:噬菌體展示選擇人VL通過PEG8000/NaCl沉淀并離心，由此乂人培養(yǎng)物上清液中收獲帶有scFv庫(kù)的噬菌體顆粒。然后，將約1x10"to1x1012個(gè)scFv噬菌體顆粒重懸于0.4mLPBS/0.1%BSA中，并以0.5mL(1-3輪的抗原濃度100nM;第4輪10nM;第5輪1nM)的總體積與重組生物素化的可溶rhGM-CSF(產(chǎn)自如上述實(shí)施例1的大腸桿菌中)一起孵育2小時(shí)并輕微震蕩。然后加入6.7x107個(gè)抗生物素蛋白鏈菌素磁珠(DynabeadsM-280-抗生物素蛋白鏈菌素，Dynal)并輕微震蕩孵育30分鐘。未特異結(jié)合靶抗原的scFv噬菌體通過用PBS/0.1%BSA洗滌的步驟來去除。為此，生物素化的抗原-抗生物素蛋白鏈菌素珠復(fù)合物(含有潛在的scFv結(jié)合物)用磁體來收集并重懸于1mL洗滌溶液中(一個(gè)洗滌步驟)。該洗滌過程在以后的輪次中重復(fù)多至4次。洗滌后，通過利用HCl-甘氨酸(pH2.2)來洗脫結(jié)合實(shí)體。用2MTris(pH12)中和后，用洗脫物感染新鮮的未感染的大腸桿菌XL1Blue培養(yǎng)物。為了洗脫剩余的高結(jié)合性實(shí)體，用HCl-甘氨酸(pHl.O)重復(fù)該步驟。再中和該第二洗脫物并用于感染新鮮的未感染的大腸桿菌XL1Blue培養(yǎng)物。然后混合兩次感染的大腸桿菌，成功導(dǎo)入編碼人scFv-片段的噬菌?？截惖募?xì)胞再次針對(duì)羧千青霉素抗性進(jìn)行選4奪，接著用VCSM13輔助噬菌體感染，從而開始第二輪抗體展示和體外選擇。對(duì)應(yīng)于第4和5輪淘選的質(zhì)粒分離自大腸桿菌培養(yǎng)物。為了產(chǎn)生可溶的scFv蛋白，從質(zhì)粒上切下(SacI-Spel)VL-DNA片段，并通過質(zhì)粒pComb3H5BFlag/His中相同的限制性位點(diǎn)來克隆，母本VH不同于起始pComb3H5BHis/母本VH，在于表達(dá)構(gòu)建體(如scFv)在scFv和His6標(biāo)簽之間包括Flag標(biāo)簽(TGDYKDDDDK)，并去除了其他噬菌體蛋白。連接后，將每個(gè)群(不同淘選輪次)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入100nL熱休克感受態(tài)大腸桿菌XLlblue中，并鋪板于羧芐青霉素LB-瓊脂上。挑出單克隆，裝入100LB培養(yǎng)液(carb)(50jig/mL)中。10^該細(xì)胞懸液通常在5mlSB培養(yǎng)基中于37。C震蕩孵育約6小時(shí)，其中添加了濃度至50pg/ml的羧千青霉素和終濃度至20mM的MgCl2。然后加入IPTG,至終濃度lmM,并于30。C在震蕩器中持續(xù)孵育過夜。細(xì)胞被離心成小團(tuán)，該小團(tuán)通常重懸于0.5mlPBS中。通過4輪在-70。C冷凍并于37°C熔融，通過滲透壓休克破壞細(xì)菌外膜，包括scFv在內(nèi)的可溶性周質(zhì)蛋白釋放到上清液中。通過進(jìn)一步離心(5分鐘，于10，000xg)去除完整細(xì)胞和細(xì)胞碎片后，收集含scFv的上清液(即PPP)并進(jìn)一步檢查。RhGM-CSF抗原(LeukineLiquid,Immunex)被固定于ELISA板上于4。C過夜(每孔50pi含1抗原/ml的PBS)。用PBS洗孔一次并用PBS3%BSA于室溫封閉1小時(shí)后，向孔中加入含scFv的100piPPP并通常于室溫孵育1小時(shí)。用PBS/0.05%Tween20洗3次后，利用抗標(biāo)簽M2(1嗎/mLPBS/1%BSA)進(jìn)行檢測(cè)與固定的抗原結(jié)合的scFv片段，并用與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠Fab2特異性多克隆抗體(Dianova，1|ig/mLPBS/1%BSA)來檢測(cè)。加入2,2'-連氮基-二[3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸]("ABTS，，)底物溶液來放大信號(hào)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在405nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。在^r測(cè)的20個(gè)克隆(IO個(gè)得自4輪淘選后，而IO個(gè)得自5輪淘選后)中，有5個(gè)溶解產(chǎn)物相對(duì)于用PBS陰性對(duì)照對(duì)重組抗原顯示出更強(qiáng)ELISA信號(hào)。ELISA結(jié)果如圖l所示，其中各種檢測(cè)的scFv分子排列在X軸上，而Y軸顯示了所測(cè)得的吸收強(qiáng)度，吸收越大，則表示結(jié)合越強(qiáng)。PBS陰性對(duì)照顯示在X軸的最左邊。顯示出可評(píng)估的結(jié)合能力的ScFv分子用各自吸收強(qiáng)度柱上的菱形或星形來表示。圖1中的菱形和星形代表兩種不同的序列，即吸收強(qiáng)度柱用菱形表示的scFv是一種序列的，而所有吸收強(qiáng)度柱用星形表示的scFv有相同的共有序列。將5個(gè)ELISA陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。由Sequiserve(Munich)進(jìn)行測(cè)序?？偣?個(gè)克隆帶有對(duì)應(yīng)于scFv5-306的DNA序列，而另一個(gè)序列(4-301)只被鑒定出一次。對(duì)應(yīng)于scFv5-306的占優(yōu)勢(shì)的序列以及序列4-301是人源的，并與人生殖系序列Vkl-012顯示出有非常接近的同源性。實(shí)施例2.2.6:表征來源于huVL選擇的scFv擊中分子構(gòu)建體以下實(shí)驗(yàn)的目的是表征由上述方法產(chǎn)生的scFv擊中分子。實(shí)施例2.2.6.1:在大腸桿菌中小規(guī)模表達(dá)并純化(來源于上述的)scFv擊中分子為了獲得PPP，細(xì)胞生長(zhǎng)于SB培養(yǎng)基中，其中添加了20mMMgCl2和羧千青霉素50pg/mL,并在收獲后再溶解于1mLPBS中。通過溫度休克(4輪于-70。C冷凍并于37。C熔融)破壞細(xì)菌外膜，使包括scFv的可溶性周質(zhì)蛋白釋放到上清液中。離心去除完整細(xì)胞和細(xì)胞碎片后，收集含scFv的上清液并進(jìn)一步4全測(cè)。為了進(jìn)一步純化，向各PPP中加入25pL20mMNaH2P04、400mMNaCl、250mM咪唑(pH7.0)。通過Ni-NTA旋轉(zhuǎn)柱(Qiagen)以說明書推薦的方式純化PPP。簡(jiǎn)而言之，將各PPP溶液加入到預(yù)先平衡的柱上以結(jié)合樹脂。用20mMNaH2PO4、400mMNaCl、20mM咪唑、pH7.0洗旋轉(zhuǎn)柱2次。在200(iL20mMNaH2P04、400mMNaCl、250mM咪唑、pH7.0中洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)2次。如以后的實(shí)施例所述，純化的scFv蛋白質(zhì)被進(jìn)一步分析結(jié)合強(qiáng)度(動(dòng)力學(xué)解離速率)和中和能力(GM-CSF抑制依賴性TF-1增殖)。盡管沒有分開并區(qū)別出scFv的不同的可能的構(gòu)象，但是根據(jù)免疫印跡分析(數(shù)據(jù)未顯示)判斷，該粗純化的PPP產(chǎn)生了80%純的scFv蛋白。實(shí)施例2.2.6.2:抑制標(biāo)記了FITC的rhGM-CSF該實(shí)驗(yàn)的目的是顯示出鑒定出的scFv克隆能抑制rhGM-CSF與展示在TF-1細(xì)胞表面上的GM-CSF受體復(fù)合物的結(jié)合。預(yù)計(jì)中和性scFv構(gòu)建體能竟?fàn)巖hGM-CSF分子上的受體結(jié)合表位，使rhGM-CSF不能結(jié)合GM-CSF受體復(fù)合物?？紤]到以以上方式抑制rhGM-CSF與其受體的結(jié)合，在基于流式細(xì)胞計(jì)的測(cè)試中可預(yù)計(jì)能觀察到標(biāo)記了熒光素的rhGM-CSF(rhGM-CSF-FITC)的TF-1細(xì)胞的焚光染色密度下降。以下描述了該基于流式細(xì)胞計(jì)的測(cè)試的進(jìn)行。溶于PBS的0.4pg/mL終濃度的rhGM-CSF-FITC綴合物與10pg/mlscFv的母本抗體或用NiNTA旋轉(zhuǎn)柱純化的未稀釋的周質(zhì)提取物一起孵育。使蛋白質(zhì)樣品于25°C平衡1小時(shí)，然后加入TF-1細(xì)胞懸液。TF-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%熱失活的FCS、并缺少rhGM-CSF的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco;L-谷氨酰胺，不含酚紅)中過夜。每個(gè)樣品使用終濃度為2x1(^個(gè)細(xì)胞/mL的150細(xì)胞懸液。以500xg于4。C離心細(xì)胞3分鐘并用FACS緩沖液洗2次。洗過的細(xì)胞重懸于100pL預(yù)先平衡的蛋白質(zhì)樣品中，其中含rhGM-CSF-FITC和各母本抗體或scFv。樣品于4。C孵育60分鐘。再洗兩次后，將細(xì)月包重懸于150juL冰冷的FACS緩沖液中，然后用流式細(xì)胞計(jì)分析。結(jié)果如圖2所示。圖2清晰地顯示出一幅圖，其中各種測(cè)試分子沿X軸排列，而且其中Y軸上顯示了平均熒光強(qiáng)度("MFI")。如圖2所見，觀察到用母本抗體的(X軸左邊第二個(gè))明顯喪失了TF-1細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。通過TF-1細(xì)胞熒光染色的喪失來監(jiān)測(cè)被命名為5-306的scFv分子對(duì)rhGM-CSF的竟?fàn)幗Y(jié)合，而scFv分子4-301幾乎不顯示出任何效應(yīng)。由于這些結(jié)果提示被命名為5-306的scFv分子是有前途的GM-CSF中和劑，因此中和活性的進(jìn)一步分析局限于scFv5-306。實(shí)施例2.2.6.3:大步見才莫表達(dá)并純化領(lǐng)導(dǎo)(lead)scFv如下進(jìn)行大規(guī)模的蛋白質(zhì)生產(chǎn)和純化。簡(jiǎn)而言之，用表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21DE3，并于37。C生長(zhǎng)在1L選擇培養(yǎng)基中，長(zhǎng)至600nm處的光密度為0.5-0.8。加入IPTG至1mM來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生，而且培養(yǎng)物于25°C的溫度震蕩再孵育16小時(shí)。以5，OOOxg離心IO分鐘來收獲細(xì)胞，并重懸于100mLlxPBS中。通過在乙醇/千冰中最佳的連續(xù)冷凍并于37°C水浴中熔融4輪，來提取周質(zhì)蛋白質(zhì)。最終，以10,000xg離心提取物20分鐘。以固定化金屬親和層析(IMAC)和凝膠過濾的兩步純化過程來分離scFv5-306。根據(jù)該方法純化所有的領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子。層析使用了AktaFPLC系統(tǒng)(Pharmacia)和Unicorn軟件。所有化學(xué)物質(zhì)都是研究級(jí)別的，購(gòu)自Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。根據(jù)廠商提供的規(guī)程，利用QiagenNi-NTA超流柱來進(jìn)行IMAC。柱用緩沖液A2(20mM磷酸鈉pH7.2，0.4MNaCl)平衡，并將PPP(100mL)以2mL/分的流速上樣于柱(2mL)。用5倍柱體積的5%緩沖液B2(20mM磷酸鈉pH7.2，0.4MNaCl，0.5M咪唑)洗柱以去除未結(jié)合的樣品。結(jié)合的蛋白質(zhì)用5倍柱體積的100。/。緩沖液B2洗脫。收集洗脫的蛋白質(zhì)級(jí)分以進(jìn)一步純化。在HiLoad16/60Superdex75制備級(jí)柱(Pharmacia)上進(jìn)行凝膠過濾層析，其用PBS(Gibco)平衡。洗脫的蛋白質(zhì)樣品(流速1mL/min)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE和免疫印跡檢測(cè)。在純化前，校正柱以確定分子量(分子量標(biāo)記試劑盒，SigmaMWGF-200)。在Superdex75制備級(jí)柱上的大小依賴性分離產(chǎn)生了明顯可區(qū)分的scFv領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子的單體和相關(guān)二聚體的峰級(jí)分。測(cè)量280nm處的光密度以確定蛋白質(zhì)濃度，并用各scFv領(lǐng)導(dǎo)分子的序列特異性分子消光系數(shù)計(jì)算。實(shí)施例2.2.6.4:通過scFv領(lǐng)導(dǎo)分子抑制TF-1細(xì)胞的rhGM-CSF依賴性增殖該實(shí)驗(yàn)的目的是利用hGM-CSF依賴性細(xì)胞系TF-1(DSMZACC334)來獲得關(guān)于半人scFv5-306中和活性的定性信息。如發(fā)放人(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,Braunschweig,德國(guó))所述，TF-1細(xì)胞在2.5ng/mLrhGM-CSF存在下培養(yǎng)于含10%熱失活的FCS的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco;L-谷氨酰胺，不含酚紅)中。細(xì)胞生長(zhǎng)到細(xì)胞密度為0.5x1(^個(gè)細(xì)胞/mL。為了進(jìn)行增殖測(cè)試，以300xg離心4分鐘以收獲TF-1細(xì)胞并用lxPBS(Dulbecco，s，Gibco)洗滌。細(xì)胞以1x105個(gè)細(xì)胞/mL的終濃度重懸于RPMI1640、10%FCS中，每個(gè)Microtest平底細(xì)胞培養(yǎng)板的孔使用90liL細(xì)胞懸液(0.9x104個(gè)細(xì)胞/孔)。用終濃度為0.3ng/mL的rhGM-CSF來刺激TF-1細(xì)胞增殖。為了中和hGM-CSF依賴性增殖，10jiL純化的scFv以約100|ag/ml至100pg/ml的連續(xù)稀釋度加入到100pLTF-1和rhGM-CSF溶液中。樣品于37。C在5%C02下孵育72小時(shí)。72小時(shí)后，加入WST-1來確定TF-1細(xì)胞的增殖狀態(tài)，并用ELISA讀數(shù)儀在450nm處檢測(cè)比色改變。利用Prism軟件的非線性回歸曲線擬合來將數(shù)據(jù)擬合成增殖的半最大抑制濃度(IC50)?？梢姷絪cFv5-306有明顯的劑量依賴性增殖抑制效應(yīng)，而且對(duì)單體和二聚體構(gòu)象形式是類似的。通過擬合增殖的半最大抑制度，確定單體形式的IC50值為7.3nM，而二聚體形式的為3.5nM。結(jié)果如圖3所示。實(shí)施例2.3:人VH的抗體文庫(kù)構(gòu)建和噬菌體展示選擇以下實(shí)驗(yàn)的目的是選出一組人VH區(qū)，其能與上述選出的scFv5-306的人VH區(qū)配對(duì)。實(shí)施例2.3.1:從外周血單核細(xì)胞(PBMC)中分離出RNA從5個(gè)健康的人供體中取得100mL血。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，通過水溶性聚蔗糖梯度來分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。根據(jù)廠商的說明書，用RNeasyMidi試劑盒(QIAGEN)從PBMC中分離出總RNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook，ColdSpringHarborLaboratoryPress1989，第二版)來合成cDNA。實(shí)施例2.3.2:PCR-擴(kuò)增可變重鏈區(qū)(VH區(qū))構(gòu)建VH文庫(kù)并命名為L(zhǎng)ib134-VH。該VH文庫(kù)由來自PCR擴(kuò)增出的上述PBMC群的VH區(qū)的FR1-CDR2-FR2-CDR2-FR3的人庫(kù)組成，其與母本抗體的VHCDR3可操作地相連，隨后是人FR4生殖系序列。為了分離人模板VH區(qū)，進(jìn)行RT-PCR，其中利用了5'-VH特異性引物集(5，-huVHl，3，5-XhoI-2001(5，-AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG-3，)、5，-huVH4-XhoI-2001(5,-CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG-3，)、5，-huVH4B-XhoI-2001(5，-CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG-3，))和一組共兩個(gè)3，-VH特異性引物(3，-hu-VH-Bs伍II-2001(5'-CTGAGGAGACGGTGACC-3')、3,-hu-VH-J3陽BstEII-2001(5，-CTGAAGAGACGGTGACC-3，))。每個(gè)PCR反應(yīng)，一種5，引物與一種3，引物組合在一起；由5，-和3，引物可能的組合數(shù)來確定不同PCR反應(yīng)的數(shù)量。PBMCcDNA(如上述來自4個(gè)供體)僅用作VH基因的來源。用以下PCR程序來擴(kuò)增于94。C變性15秒，于52°C引物退火50秒和于72°C引物延伸60秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后于72。C最終延伸IO分鐘。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法分離有約350bp大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。為了分離Lib134-VH區(qū)，以兩步進(jìn)行RT-PCR。首先，從分離的模板VH片段中PCR擴(kuò)增出人重鏈VH段(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3),其中利用了與上述相同的5'-VH特異性引物組(5，-huVHl、3，5-XhoI-2001、5，-huVH4-XhoI-2001、5，-huVH4B-XhoI-2001)和3，特異性引物組(3，-Lib134-VH-1A-MH3(5'-GTAATCAAAGTAGACTGCTATCAGACCCGATCTYGCACAGTAATACACGGC-3，)、3'-Lib134-VH-1B陽MH3(5'-GTAATCAAAGTAGACTGCTATCAGACCCGATCTYGCACAGTAATACAYRGC-3，)、3，-Lib134-VH-3A-MH3(5，-GTAATCAAAGTAGACTGCTATCAGACCCGATCTNGYACAGTAATACACRGC-3，)、3,-Lib134-VH-3B-MH3(5，-GTAATCAAAGTAGACTGCTATCAGACCCGATCTNGCACAGTAATACAARGC-3，)、3，-Lib134-VH-4-MH3(5'-GTAATCAAAGTAGACTGCTATCAGACCCGATCTSGCACAGTAATACACRGC-3，))，它們針對(duì)與FR3最末端區(qū)域相匹配的人VH亞家族1、3和4。使用以下引物組合a)5,.-huVHl，3，5-XhoI-2001x3，-Lib134-VH-lA陽MH3b)5，-huVHl，3,5-XhoI-2001x3'-Lib134-VH-1B-MH3c)5，.-huVHl，3，5-XhoI-2001x3，-Lib134-VH-3A-MH3d)5，-huVHl，3,5-XhoI-2001x3,-Lib134-VH-3B-MH3e)5，.-huVH4--XhoI-2001x3，-Lib134-VH-4-MH3f)5，-huVH4B-XhoI-2001x3，-Lib134-VH-4-MH3每個(gè)PCR反應(yīng)，一種5'引物與一種3'引物組合在一起；由5，-和3，引物可能的組合數(shù)來確定不同PCR反應(yīng)的數(shù)量。PBMCcDNA(如上述4個(gè)供體僅用作VH基因的來源)。用以下PCR程序來擴(kuò)增于94。C變性15秒，于52。C引物退火50秒和于72。C引物延伸90秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后于72。C最終延伸IO分鐘。通過該P(yáng)CR步驟和各個(gè)3，引物序列，人VH段延長(zhǎng)到母本VHCDR3的部分，然后將其接著作為用于第二步PCR3'引物的引導(dǎo)位置。然后將這些VH-(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)DNA-片段用作為第二個(gè)PCR反應(yīng)中的模板，其中再次利用各5，VH特異性引物和與擴(kuò)增出的通用DNA片段所有3'末端匹配的通用3'引物(3，-Lib134-JH3-BstE2，5，-AGAGACGGTGACCATTGTCCCTTGGCCCCAGTAATCAAAGTAGACTGC-3，)。用以下PCR程序來擴(kuò)增于94°C變性15秒，于52°C引物退火50秒和于72°C引物延伸60秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后于72°C最終延伸10分鐘。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程分離DNAV片段。實(shí)施例2.3.3:文庫(kù)構(gòu)建-克隆人VH群在前述方法的第二輪中，首先鑒定出scFv5-306的人VL,選擇以前的選擇物，然后與實(shí)施例2.3.2所述的人VH片段文庫(kù)結(jié)合在一起，其目的在于產(chǎn)生人scFv。噬菌體展示文庫(kù)一般根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來構(gòu)建，例如公開于"PhageDisplay:ALaboratoryManual";編者為Barbas,Burton,Scott&Silverman;ColdSpringHarborlaboratoryPress,2001的。來自于不同PCR擴(kuò)增的重鏈DNA片段按如下量進(jìn)行每個(gè)連接a:b:c:d:e:f=3:1:3:1:1:1，其中a-f具有以下含義3，5-XhoI-2001x3,-Lib134-VH-1A-MH3x3，-Lib-XhoI-2001x3,-Lib134-VH-1B-MH3x3,-Lib3，5-XhoI-2001x3，-Lib134-VH-3A-MH3x3，-Liba)5，-huVHl134-JH3-BstE2b)5'-huVHl134-JH3-Bsffi2c)5'-huVHl134-JH3-BstE2d)5，-huVHl134-JH3-BstE2e)5，-huVH4-XhoI-2001x3'-Lib134-VH-4-MH3x3，-Lib134-JH3-BstE2373-XhoI-2001x3，-Lib134-VH畫3B陽MH3x3，-Libf)5，-huVH4B-XhoI-2001x3'-Lib134-VH-4-MH3x3，-Lib134陽JH3-BstE2設(shè)計(jì)的一個(gè)連接反應(yīng)，其由400ng人Lib134-VH片段群(用XhoI-BstEII消化的)和1200ng質(zhì)粒pComb3H5BHis/5-306VL(4艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)過程，編碼scFv5-306的VL區(qū)的DNA通過限制性位點(diǎn)Sacl和Spel被克隆入pComb3H5Bhis中)組成。然后，將產(chǎn)生的抗體人VH群通過電穿孔(2.5kV,0.2cm開口的電擊杯，25mF,200Ohm,Biomd基因脈沖儀)轉(zhuǎn)化入300)iL電感受態(tài)大腸桿菌XLlBlue中，由此形成總共大小有1.6x108個(gè)獨(dú)立克隆的文庫(kù)。電穿孔后，將測(cè)試物在SOC肉湯(Fluka)中孵育，以表現(xiàn)出表型。然后將每個(gè)培養(yǎng)物孵育在500mL含50)ig/mL羧千青霉素和2%v/v葡萄糖的SB選擇培養(yǎng)基中過夜。第二天，離心收集培養(yǎng)物中的細(xì)胞，并利用商品化的質(zhì)粒制備試劑盒(Qiagen)進(jìn)行質(zhì)粒制備以保存DNA文庫(kù)。然后將1.5這種編碼各scFv群的質(zhì)粒群電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌XLlblue中(2.5kV,0.2cm開口的電擊杯，25mF,200Ohm，Biorad基因脈沖儀)，由此形成總共大小有2.4x109個(gè)獨(dú)立克隆的文庫(kù)。表型表現(xiàn)出并緩慢適應(yīng)羧千青霉素之后，將抗體文庫(kù)轉(zhuǎn)移至SB-羧芐青霉素(50嗎/mL)選擇培養(yǎng)基中。然后以1x10'2粒輔助噬菌體VCSM13的感染劑量來感染抗體文庫(kù)，產(chǎn)生絲狀M13噬菌體并使分泌，其中每個(gè)噬菌體顆粒包含編碼人scFv-片段的單鏈pComb3H5BHis-DNA，并展示出與噬菌體衣殼蛋白III翻i奪融合的相應(yīng)scFv-蛋白。實(shí)施例2.3.4:噬菌體展示選擇人VH通過PEG8000/NaCl沉淀和離心，從培養(yǎng)物上清液中收獲得到的帶有克隆的scFv庫(kù)的噬菌體文庫(kù)。約lxl0"至lxl02個(gè)scFv噬菌體顆粒重懸于0.4mLPBS/0.1%BSA，并以0.5mL的總體積與重組生物素化的可溶rhGM-CSF(大腸桿菌材料，其如實(shí)施例1所述)一起輕微震蕩孵育1小時(shí)。然后，加入6.7x107個(gè)抗生物素蛋白鏈菌素石茲3朱(DynabeadsM-280-抗生物素蛋白鏈菌素，Dynal),并再輕微震蕩孵育30分鐘。通過洗滌步驟，用PBS/0.1。/oBSA去除未特異結(jié)合靶抗原的scFv噬菌體。為此，通過磁體收集生物素化的抗原-抗生物素蛋白鏈菌素珠復(fù)合物(含有潛在的scFv結(jié)合物)，并重懸于1mL洗滌溶液(一個(gè)洗滌步驟)。該洗滌步驟重復(fù)多至4次。洗滌后，通過利用HCl-甘氨酸(pH2.2)來洗脫結(jié)合實(shí)體，并在用2MTris(pH12)中和后，將洗脫物用于感染新鮮的未感染的大腸桿菌XLlBlue培養(yǎng)物。為了洗脫剩余的高結(jié)合性實(shí)體，將珠直接重懸于200inL新鮮的大腸桿菌XL1blue培養(yǎng)物(OD600》0.5)中，并輕微震蕩孵育10分鐘。然后混合兩種培養(yǎng)物，并再次針對(duì)羧節(jié)青霉素抗性篩選成功轉(zhuǎn)導(dǎo)編碼人scFv-片段的噬菌?？截惖募?xì)胞，然后用VCMS13輔助噬菌體感染，從而開始第二輪抗體展示和體外篩選。對(duì)兩種抗體進(jìn)行總共4輪選擇。選擇期間，抗原濃度減少到如下終濃度第1輪100nM第2輪10nM第3輪10nM第4輪10nM分離來自大腸桿菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA，對(duì)應(yīng)于第3和4輪淘選。為了產(chǎn)生可溶性scFv-蛋白質(zhì)，從質(zhì)粒上切下VH-VL-DNA片段(XhoI-Spel)，并通過質(zhì)粒pComb3H5BFlag/His(不含噬菌體感染所需的另外的噬菌體蛋白)中相同的限制性位點(diǎn)克隆。連接后，質(zhì)粒DNA的每個(gè)群(不同淘選輪次)被轉(zhuǎn)化入100)liL熱休克感受態(tài)大腸桿菌TG1，并鋪板于羧芐青霉素LB瓊脂上。挑出單克隆，并孵育在96孔板(Greiner)的120含1%葡萄糖的LB培養(yǎng)液(carb)(50嗎/mL)中。用半透膜(Greiner)密封孔，并將板在震蕩孵育箱(主平板)中于37。C孵育過夜。然后，lOiaL主平板培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)入第二個(gè)96孔板(工作板)，每孔含90iaLLB培養(yǎng)液(5(^g/mL)和0.1%葡萄糖。在37。C震蕩孵育箱中孵育4小時(shí)，向每個(gè)孔中加入20)iLLB培養(yǎng)液(carb)和6mMIPTG，來誘導(dǎo)scFv產(chǎn)生。在于30。C震蕩孵育過夜的步驟之后，于室溫用40裂解緩沖液(400mM硼酸，320mMNaCl，4mMEDTApH8，2.5mg/mL溶菌酶)孵育1小時(shí)，裂解細(xì)胞。以l,900xg離心(Hettich)12分鐘來分離掉剩余的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后，用含scFv分子的上清液在ELISA測(cè)試中進(jìn)行結(jié)合測(cè)試。檢測(cè)與固定的rhGM-CSF抗原(Leukine)結(jié)合的scFv片段，其利用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠Fab2特異性多克隆抗體(Dianova,1pg/mLPBS/1%BSA)檢測(cè)抗標(biāo)簽M2(lpg/mLPBS/1%BSA)。加入ABTS底物溶液放大信號(hào)，并在405nm波長(zhǎng)處4全測(cè)。在3輪選擇后測(cè)試的約100個(gè)克隆中，12個(gè)克隆顯示出能與rhGM-CSF強(qiáng)結(jié)合。在4輪選擇后測(cè)試的約160個(gè)克隆中，超過80%的溶解產(chǎn)物與用PBS作的陰性對(duì)照相比對(duì)重組抗原顯示出強(qiáng)ELISA信號(hào)。來自有代表性的克隆的結(jié)果如圖4所述，其中這些有代表性的克隆沿X軸排列，而吸收強(qiáng)度顯示在Y軸上。如圖4所見，PBS陰性對(duì)照(X軸右邊第二個(gè))未顯示出可評(píng)估的結(jié)合性，而有代表性的scFv克隆scFvA、scFv3035、scFv3039、scFv3080和scFv5-306通過ELISA顯示出不同程度的結(jié)合強(qiáng)度。在平行實(shí)驗(yàn)中，所有溶解產(chǎn)物在沒有rhGM-CSF的情況下測(cè)試，測(cè)試其與封閉劑的非特異性結(jié)合。沒有觀察到顯著的可檢測(cè)的信號(hào)，這顯示了與rhGM-CSF的結(jié)合特異性。確定了超過13個(gè)ELISA陽性scFv克隆的DNA序列?？偣茶b定出6種不同的序列。所有的序列都是人源的，并與人生殖系序列VH-11-02密切相關(guān)。實(shí)施例2.3.5:表征含人VL和VH區(qū)的人scFv構(gòu)建體實(shí)施例2.3.5.1:大規(guī)模制備并純化通過實(shí)施例3所述方法產(chǎn)生的scFv領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子構(gòu)建體如實(shí)施例2.2.6.3所述，分離scFv領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子并純化。實(shí)施例2.3.5.2:通過表面等離子共振(SPR)對(duì)scFv(lead)分子的動(dòng)力學(xué)結(jié)合進(jìn)行分析該實(shí)驗(yàn)的目的是深入表征scFv領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子。通過注入10juL以10pg/mL至1pg/mL純化scFv的連續(xù)稀釋的純化蛋白質(zhì)，并在25°C監(jiān)測(cè)解離100秒，來測(cè)量scFv領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(kd和ka)。蛋白質(zhì)于HBS-EP(O.OlMHEPES，pH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA,0.005%表面活性劑P20)中緩沖。利用BIAevalution軟件擬合數(shù)據(jù)，根據(jù)1:1朗繆爾結(jié)合方程(式1和2)，確定了解離和結(jié)合動(dòng)力學(xué)的速率常數(shù)，其中A為注入的分析物的濃度，而B為配體的濃度。必/^=-0"〗-fe/*[AS])(1)=-(2)每種要分析的scFv領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子以多至8個(gè)濃度，來確定動(dòng)力學(xué)結(jié)合曲線。原始數(shù)據(jù)的獨(dú)立擬合形成了解離和結(jié)合速率常數(shù)，將其用于計(jì)算平衡解離常數(shù)(KD,結(jié)果如表l所述)。表1ka顧s_kd[1/sl_KD[M_IC50[函130351.6x105±1.1x1051.5x10—3士0.4x10-30.9xl(T83.230390.6x104±0.4x1040.9x10-4±0.1x10-41.7x10-6130.5scFvA1.7x106±1.1x1061.6x10-3±0.2xl(T31.2x10-92.63080l.Ox105±0.5x1053.5x10-3±0.2x10-33.5x10-819.12.3.5.3:通過scFv領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子抑制TF-1細(xì)胞的rhGM-CSF依賴性增殖在確證了scFv領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子中保留了特異結(jié)合強(qiáng)度之后，該實(shí)驗(yàn)的目的是評(píng)估scFv領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子與抗原rhGM-CSF相互作用的特異性。在TF-1增殖抑制實(shí)驗(yàn)中表征了用scFv結(jié)合抗原rhGM-CSF對(duì)生物功能的抑制力。如上所述，進(jìn)行TF-1增殖抑制實(shí)驗(yàn)。以1x1()s個(gè)細(xì)胞/mL的終濃度將細(xì)月包重懸于RPMI1640、10%FCS,每孔使用90)iL細(xì)月包懸液(0.9x104個(gè)細(xì)胞/孔)。用終濃度為0.3ng/mL的rhGM-CSF刺激TF-1細(xì)胞增殖。為了中和rhGM-CSF依賴性增殖，加入溶于lxPBS的純化的scFv,其被連續(xù)稀釋，使最終蛋白質(zhì)濃度達(dá)到100)ag/mL至10pg/mL。將10經(jīng)透析、無菌過濾的蛋白質(zhì)溶液(0.22(im濾膜)力。入100jiLTF-1和rhGM-CSF溶液中。樣品于37。C在5。/。C02下孵育72小時(shí)。72小時(shí)后，加入WST-1來確定TF-1細(xì)胞的增殖狀態(tài)，并用ELISA讀數(shù)儀監(jiān)測(cè)450nm處的比色改變(圖5)。如圖5所見，清楚地證實(shí)了有人GM-CSF中和活性。ScFvA展示出最強(qiáng)的中和活性。實(shí)施例2.4:最優(yōu)化所選的scFv的結(jié)合特征通過增加中和劑和配體間的結(jié)合強(qiáng)度，尤其增加中和劑的解離速率，預(yù)計(jì)可改善或甚至優(yōu)化中和劑對(duì)單體配體的生物活性。這優(yōu)選通過以隨機(jī)的方式突變各VH和VL區(qū)的序列來實(shí)現(xiàn)，其通過(i)在整個(gè)序列中隨機(jī)插入一個(gè)或兩個(gè)突變，或通過(ii)在有高度可能性與抗原相互作用的scFv區(qū)中插入單突變或多個(gè)連續(xù)的突變(如五、六、七、八、九或十個(gè)氨基酸的片段)。然后，必須表征各突變體是否增加了活性，或在表征前，必須通過合適的選擇方法(即噬菌體展示)對(duì)具有優(yōu)選性質(zhì)(如較強(qiáng)的結(jié)合力)的進(jìn)行富集。實(shí)施例2.4.1:通過在一個(gè)或多個(gè)位置上突變VHCDR3而來增加親和力為了通過單個(gè)點(diǎn)或短氨基酸片段突變改善抗體片段(例如scFv分子)的結(jié)合特征，則必須靶向于有很高的可能性與各抗原相互作用的氨基酸殘基。用該方法，不必篩選超過有限數(shù)量的突變體而且不會(huì)減少成功的可能性?？贵w或其片段的重鏈CDR3通常對(duì)該抗體或抗體片段全面結(jié)合抗原起重要的作用。因此預(yù)計(jì)增加抗體或抗體片段的結(jié)合親和力的有前途的方式是突變編碼VHCDR3的核苷酸序列。有各種不同的方法用來進(jìn)行該靶向隨機(jī)誘變，其中一些描述于以下各項(xiàng)中，以下各項(xiàng)描述了上述scFv分子的結(jié)合親和力如何能增加A)為了靶向VHCDR3，必須將合適的限制性位點(diǎn)導(dǎo)入VHCDR3內(nèi)的核苷酸序列中，優(yōu)選通過基因合成含修飾的CDR3核苷酸序列、并保留了原有的氨基酸序列的整個(gè)VH區(qū)來實(shí)現(xiàn)(Entelechon,德國(guó))。通過用各限制性酶裂解并加入S1核酸酶/KlenowDNA聚合酶I和dGTP，然后加入突變的寡聚物二4咅體，可才艮據(jù)Matteucci和Heyneker,NucleicAcidsResearch11:3113ff(1983)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上進(jìn)行靶向隨機(jī)誘變。然后，誘變的VH與各VL(通過合適的接頭)在合適的scFv表達(dá)載體中組合，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞中。然后，挑取表達(dá)變體scFv的單個(gè)克隆，并如在以前實(shí)施例中篩選和表征scFv擊中(hit)分子和領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子中所述的來篩選出改善了的scFv。B)可選的方法是通過雙引物法進(jìn)行的寡核苷酸介導(dǎo)的突變，其詳情如Sambrook、Fritsch、Maniatis(1989)"Alaboratorymanual"中所述。主要是將VH區(qū)克隆進(jìn)基于M13的載體中，并分離單鏈質(zhì)粒。能與含隨機(jī)序列的單鏈質(zhì)粒模板雜交的引物退火并延伸。在大腸桿菌中增殖各質(zhì)粒群之后，可從質(zhì)粒群中收獲突變的VH，并與原VL(通過合適的接頭)組合在合適的scFv表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞中。挑取表達(dá)變體scFv的單個(gè)克隆，并如在以前實(shí)施例中篩選和表征scFv擊中(hit)分子和領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子中所述的來篩選出改善了的scFv。C)另外可選的是突變多至6個(gè)或更多的連續(xù)氨基酸。為該目標(biāo)，可構(gòu)建VH核香酸序列的缺失變體，使其缺失CDR3和FR4。該構(gòu)建體被用作模板來進(jìn)行一步或兩步PCR擴(kuò)增，其中合適的5'引物(能與VH序列的5'末端雜交，而且加入了合適的克隆位點(diǎn))與一組3'引物組合在一起，所述3'引物能退火在作為模板的FR3區(qū)的3'末端上并能將CDR3和FR4區(qū)(以合適的限制性位點(diǎn))加到擴(kuò)增片段上。該組3'引物包含一個(gè)或多個(gè)三聯(lián)體序列以在CDR3序列內(nèi)插入隨機(jī)密碼子。然后，該群含隨機(jī)化的CDR3區(qū)的VH區(qū)接著與各VL(通過合適的接頭)組合在合適的scFv表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞中。然后，挑取表達(dá)變體scFv的單個(gè)克隆，并如在以前實(shí)施例中篩選和表征scFv擊中(hit)分子和領(lǐng)導(dǎo)(lead)分子中所述的來篩選出改善了的scFv。各群具有較高多樣性的突變scFv(可被容易地篩選出)可被克隆入合適的噬菌體展示載體中，然后通過對(duì)感興趣的抗原進(jìn)行噬菌體展示(優(yōu)選在逐漸降低的抗原濃度的條件下)來選擇改善的scFv，來選擇更高的親和力。根據(jù)本文其他部分所述的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，進(jìn)行噬菌體展示篩選。以上方法A至C之任一可組合在一起，或以重復(fù)循環(huán)的形式來進(jìn)行，以此進(jìn)一步改善并優(yōu)化已經(jīng)4務(wù)飾的scFv。實(shí)施例2.4.2:通過在整個(gè)序列中隨機(jī)突變V區(qū)來增加親和力除了突變有高度的可能性與各抗原相互作用的特定scFv位點(diǎn)，可進(jìn)行更注重實(shí)效的方法，其通過在整個(gè)VH和/或VL序列中導(dǎo)入點(diǎn)突變，然后篩選優(yōu)化的scFv或選擇并篩選優(yōu)化的scFv而實(shí)現(xiàn)。例如，利用大腸桿菌突變體菌林(如Low等260:359ffJMolBiol(1996)所述)或通過DNA聚合酶錯(cuò)摻入核苦酸，來誘變VH和/或VL序列，所述錯(cuò)摻入核苷酸具體如Sambrook,Fritsch，Maniatis(1989)"Alaboratorymanual"所述?？寺　⒈磉_(dá)和選擇優(yōu)化的scFv分子變體，可通過噬菌體展示或通過常用的核糖體展示技術(shù)(如EP0975748Al中所述)來進(jìn)行。最優(yōu)的方式是在合適的載體/大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)，從而篩選出改善的scFv候選物。分子(scFvA),由此形成一類單克隆人抗GM-CSF中和性抗體片段，其用scFv分子B-N表示。在以下實(shí)施例中將進(jìn)一步闡述并描述這些scFv分子的特征。從所選的scFv分子中產(chǎn)生單克隆IgG分子將在以下實(shí)施例中描述。實(shí)施例3:從所選的scFv中克隆并真核表達(dá)單克隆抗體盡管已知細(xì)菌能表達(dá)功能性Fab片段，然而它們通常不能產(chǎn)生完整的功能性免疫球蛋白。為了產(chǎn)生完整的功能性抗體，必須用哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因此在前面實(shí)施例中所選出的scFv5-306的VL區(qū)和scFv分子的不同VH區(qū)(尤其是scFvA和scFvB的VH區(qū))^皮亞克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。實(shí)施例3.1:基于scFv5-306來克隆人輕鏈為了產(chǎn)生合適的末端限制性位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增編碼scFv5-306VL區(qū)的DNA片段，這形成Vk片段，其在5，末端處帶有Bsu36I位點(diǎn)并在3，末端處帶有XhoI位點(diǎn)。然后，通過Bsu36I和Xhol，該片段被亞克隆到質(zhì)粒BSPOLL中，其中利用5，引物(5，-ACGTCACCTTAGGTGTCCACTCCGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGC-3，)和3，引物(5，-CATGCACTCGAGCTTGGTCCCTCCGCCGAAAG-3，)，由此加入了哺乳動(dòng)物前導(dǎo)序列和人Ck恒定區(qū)，并通過測(cè)序-瞼i正。利用EcoRI和Sail,/人BSPOLL中切下5-306VL-CkDNA,并通過用編碼鼠腺苦脫氨酶(ADA)的cDNA來代替編碼鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)的cDNA，亞克隆入源自表達(dá)載體pEF-DHFR的真核表達(dá)載體pEF-ADA中(Mack等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92，7021-5)。實(shí)施例3.2:克隆人重鏈可變結(jié)構(gòu)域從以前實(shí)施例中所選的不同人VH區(qū)(尤其是scFvA和scFvB的VH區(qū))中，通過PCR重新擴(kuò)增出可變區(qū)，在兩端都產(chǎn)生Bsu36I限制性位點(diǎn)。對(duì)所有構(gòu)建體，使用兩種引物組合5'引物VH-Bsu36I(5，-ACGTCACCTTAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTCCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGC隱3，)和3、引物(5，-ACGTCACCTGAGGAGACGGTGACCATTGTCCCTTG-3')。然后用這些限制性位點(diǎn)將產(chǎn)生的DNA-片段亞克隆入已經(jīng)含真核前導(dǎo)序列和編碼人IgGl重鏈恒定區(qū)的DNA片段的真核表達(dá)載體pEF-DHFR。由此將重鏈可變區(qū)插入前導(dǎo)序列和重鏈恒定區(qū)之間。通過測(cè)序來確證可變區(qū)的正確序列。實(shí)施例3.3:將scFv片段轉(zhuǎn)變?nèi)胪暾娜薎gG中根據(jù)用于瞬時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，將編碼輕鏈(VL5-306/CK)的質(zhì)粒和編碼一個(gè)重鏈(VH/人IgGl恒定區(qū))的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK細(xì)胞中，培養(yǎng)細(xì)胞使免疫球蛋白表達(dá)并產(chǎn)生，進(jìn)入培養(yǎng)基。以這種方式，產(chǎn)生源自scFvA的IgGA,和源自scFvB的IgGB。產(chǎn)生出各種抗體之后，收獲上清液，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，通過蛋白質(zhì)A層析來分離人免疫球蛋白，以此純化免疫球蛋白。然后用免疫球蛋白以進(jìn)行進(jìn)一步的表征實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3.4:重新將IgG專一性轉(zhuǎn)變?nèi)雜cFv片段根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，來自于IgG構(gòu)建體(IgGA和IgGB,如上述的)的VH區(qū)被亞克隆入合適的scFv表達(dá)載體中，并通過柔性接頭可操作地與源于實(shí)施例3.1的人輕鏈的VL區(qū)可操作地偶聯(lián)。在上述大腸桿菌周質(zhì)中產(chǎn)生了這些構(gòu)建體，其為可溶的。這些scFv(源于IgGA的scFvO,和源于IgGB的scFvP)的特征在以下實(shí)施例中有描述。實(shí)施例4:評(píng)估針對(duì)靈長(zhǎng)類和人GM-CSF的人單克隆抗GM-CSF抗體的結(jié)合特異性該實(shí)驗(yàn)的目的是顯示如上所述而獲得的抗體特異結(jié)合GM-CSF。因此通過ELISA,比較該抗體與不同的重組人("rh")集落刺激因子(rhG-CSF和rhM-CSF,Strathmann)的結(jié)合力與相同抗體對(duì)rhGM-CSF的結(jié)合力。將50特定的抗原(1pg/mL，溶于PBS)于室溫包被于ELISA板(Nunc,Maxisorp)上1小時(shí)。用PBS/0.05%Tween20洗3次后，每孔用200)iLPBS/3%脫脂奶粉于室溫封閉孔1.5小時(shí)，然后用PBS/0.05%Tween20洗3次。50pL/孔的一系列人抗體(例如IgGA和IgGB)，其中每一個(gè)與SEQIDNO.34所述序列的輕鏈相同，但帶有SEQIDNO.35-48所述的不同重鏈，將它們以1(ig/mL至0.5ng/mL(溶于PBS/0.05%Tween20/3%脫脂奶粉)連續(xù)稀釋后而被加入，并孵育l小時(shí)。PBS/0.05%Tween20洗3次之后，用50辣4艮過氧化物酶綴合的山羊抗人IgG抗體(Dianova;用PBS/0.05%Tween20/3%脫脂奶粉以1:1000稀釋)檢測(cè)結(jié)合的抗體。加入50pL/孔ABTS溶液(Roche)來力文大信號(hào)并在405nm處測(cè)量吸收，其中將450nm波長(zhǎng)用作參照。分別對(duì)rhM-CSF和rhG-CSF有特異性的商品化的兔抗體(StrathmannBiotechAG)用作陽性對(duì)照來結(jié)合這些抗原，所述結(jié)合用堿性磷酸酶綴合的山羊抗兔抗體4全測(cè)。用50jnL/孔pNpp溶液(Sigma)放大信號(hào)，并測(cè)量405nm處的吸收，其中利用450nm波長(zhǎng)作為參照。對(duì)于兩個(gè)有代表性的人抗體，IgGA和IgGB，其結(jié)果如圖6A、6B和6C所示。如圖6A所見，抗體滴定濃度的增加會(huì)導(dǎo)致吸收增加，這表明有代表性的抗體IgGA和B都能很好地結(jié)合rhGM-CSF。圖6B顯示了還是這兩個(gè)有代表性的抗體與rhM-CSF結(jié)合的結(jié)果。如該圖所見，兔抗rhM-CSF抗體濃度的增加會(huì)導(dǎo)致吸收增加，即該對(duì)照抗體結(jié)合(實(shí)心點(diǎn))增加，而上述這兩個(gè)有代表性的抗體(實(shí)心方塊和實(shí)心三角)疊加作為連續(xù)基線吸收，所述連續(xù)基線吸收不隨測(cè)試抗體濃度的增加而增加。對(duì)于對(duì)照抗體以及有代表性的測(cè)試的IgGA和B，圖6C可見到完全類似的結(jié)果，這表示與rhG-CSF結(jié)合的結(jié)果。綜合而言，圖6A、6B和6C中所示的數(shù)據(jù)表明，這兩個(gè)有代表性的測(cè)試抗體IgGA和B能特異結(jié)合rhGM-CSF，但不結(jié)合其他集落刺激因子，如M-CSF和G-CSF。該抗原結(jié)合特異性對(duì)于有前景的抗體治療劑來說是至關(guān)重要的。實(shí)施例5:表征人單克隆抗GM-CSF抗體和其片段的結(jié)合數(shù)據(jù)希望能夠通過實(shí)施例2中的上述ELISA得出各種被鑒定為rhGM-CSF的陽性結(jié)合物的成員的定性等級(jí)排名。該等級(jí)排名要能反映出由此鑒定出的各有代表性的抗體結(jié)合物的動(dòng)力學(xué)(解離速率)和平衡(親和力)參數(shù)。為此，在BIAcore2000設(shè)備(BiacoreAB(Uppsala，瑞典))上于25。C進(jìn)行表面等離子共振(SPR)，其中流速為5nL/分并將HBS-EP(0.01MHEPES,pH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA，0.005%表面活性劑P20)用作運(yùn)行緩沖液。產(chǎn)自酵母的重組人GM-CSF(Leukine,Berlex，下文也可被稱為"抗原"或"rhGM-CSF，)固定在CM5感應(yīng)芯片的流動(dòng)單元(flowcell)2-4上。通過注入80fiL0.1M羥基琥珀酰亞胺鈉、0.4MN-乙基-N，(3-二曱基氨丙基)-碳化二亞胺(NHS/EDC),來活化芯片表面。通過人工注入溶于0.01M乙酸鈉(pH4.7)的10ng/mLrhGM-CSF，來偶聯(lián)抗原。將不同密度的抗原固定在流動(dòng)單元2-4上，調(diào)節(jié)人工注入次數(shù)。不修飾流動(dòng)單元1，而流動(dòng)單元2用盡可能高的密度的rhGM-CSF(800RU)來包被。流動(dòng)單元3以固定在流動(dòng)單元2上的抗原量的50%來包被，而流動(dòng)單元4用最低密度的rhGM-CSF(通常為10%)來包被。注入85pL1M乙醇胺來封閉感應(yīng)芯片的活化表面，并使芯片以5pL/分HBS-EP的恒定流速來平衡過夜。實(shí)施例5.1:定量確定人單克隆抗GM-CSF抗體的scFv片段的動(dòng)力學(xué)結(jié)合參數(shù)〖解離速率)如上一段所示來進(jìn)行Biacore實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前，周質(zhì)制品("PPP")的蛋白質(zhì)洗脫溶液用PBS于25。C透析2小時(shí)并用HBS-EP1:1稀釋。通過將10pL純化的周質(zhì)蛋白溶液于25。C注入感應(yīng)芯片，來測(cè)量所述類型的成員的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。從固定rhGM-CSF的流動(dòng)單元(FC2，F(xiàn)C3,FC4)中的響應(yīng)信號(hào)中扣除蛋白質(zhì)與未修飾的感應(yīng)芯片表面(FC1)的非特異性背景吸收。確定相對(duì)響應(yīng)信號(hào)(FC2-1，F(xiàn)C3-1,FC4-1)，并監(jiān)測(cè)特定解離速率100秒。對(duì)于一系列在ELISA實(shí)驗(yàn)中被鑒定為陽性rhGM-CSF結(jié)合物的有代表性的scFv片段，這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖7A所示。圖7A所示Biacore數(shù)據(jù)所針對(duì)的有代表性的scFv抗體片段如下scFvA，scFvB,scFvC,scFvD,scFvE，scFvF,scFvG，scFvH,scFvI，scFvJ,scFvK,scFvL,scFvM和scFVN。一般而言，在Biacore結(jié)果的解釋過程中，結(jié)合峰的幅度(RUmax)直接與注射的樣品中的蛋白質(zhì)濃度相關(guān)。動(dòng)力學(xué)結(jié)合率(ka)是濃度依賴性的，而且由于PPP中蛋白質(zhì)濃度會(huì)變化，不能用作為所述類型成員的定量等級(jí)排名。動(dòng)力學(xué)解離速率(kd)是蛋白質(zhì)濃度非依賴性的，而且對(duì)所述類型各成員的結(jié)合強(qiáng)度具有特征性。所述類型的所有鑒定出的成員顯示出與固定的rhGM-CSF的特異結(jié)合。鑒定出具有最佳表觀解離速率的所述類型成員，并通過在BIAcore上的平衡結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將SPR數(shù)據(jù)與提交的抑制數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，從而確定出親和力。然后，在檢視圖7A的過程中，察看每個(gè)有代表性的scFv抗體片段A-N的特異峰，其上部分分別顯示出有特征的曲率，外推該曲率以獲得所論及的scFv片段的解離速率。然后可定量地?cái)喽ǎ總€(gè)有代表性的scFv片段能很好地結(jié)合人GM-CSF。實(shí)施例5.2:定量確定某些人抗GM-CSF抗體和其scFv片段的平衡結(jié)合參數(shù)(親和力)既然已經(jīng)在實(shí)施例5.1中定性地建立了已經(jīng)在先前通過ELISA測(cè)得其為GM-CSF結(jié)合陽性的抗GM-CSF抗體的許多scFv片段在與人GM-CSF結(jié)合時(shí)證明有合理的動(dòng)力學(xué)解離速率，然后希望通過關(guān)注重組人GM-CSF實(shí)施例4所示，與抗原(本文中的rhGM-CSF)的特異性結(jié)合是本文所述的抗GM-CSF抗體及其片段類型的特有而且特定的特征。通過以10pg/mL至1pg/mL純化蛋白質(zhì)的連續(xù)稀釋注入純化的蛋白質(zhì)(即抗體或其片段)，并于25。C監(jiān)測(cè)解離100秒，來測(cè)量人抗GM-CSF抗體及其片段類型中某些有代表性的成員的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(解離速率(kd)和結(jié)合率(ka))。純化的蛋白質(zhì)溶于HBS-EP緩沖液。利用BIAevalutionTM軟件來擬合數(shù)據(jù)，通過l:1朗繆爾結(jié)合方程(參見下式1和2)確定解離和結(jié)合動(dòng)力學(xué)率常數(shù)，其中a為注入的純化的蛋白質(zhì)分析物的濃度和b[o]為Rmax:W/&=-(fo-feif*[4(式1)=-(/taU*[/f5])(式2)用要分析的每種有代表性的人抗GM-CSF抗體或其片段的多至8種濃度來確定結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線。對(duì)原始數(shù)據(jù)的獨(dú)立擬合得出了解離和結(jié)合速率常數(shù)，其用于計(jì)算平衡解離常數(shù)(KD)。由每種有代表性的人抗GM-CSF抗體或其片段所得的結(jié)果如圖7B-I所示。具體地，圖7B顯示了得自有代表性的IgGB的結(jié)合數(shù)據(jù)；圖7C顯示了得自有代表性的IgGA的結(jié)合數(shù)據(jù)；圖7D顯示了得自有代表性的scFvC的結(jié)合數(shù)據(jù)；圖7E顯示了得自有代表性的scFvI的結(jié)合數(shù)據(jù)；圖7F顯示了得自有代表性的scFvB的結(jié)合數(shù)據(jù)，圖7G顯示了得自有代表性的scFvA的結(jié)合數(shù)據(jù)；圖7H顯示了得自有代表性的scFvE的結(jié)合數(shù)據(jù)；和圖71顯示了得自有代表性的scFvD的結(jié)合數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)在下表2中有總結(jié)。表2:某些有代表性的人抗GM-CSF抗體和其片段的親和力結(jié)合定量<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>實(shí)施例6:人抗GM-CSF抗體中某些有代表性的片段所需的最小表位希望確定如本文所述并要求的人抗GM-CSF抗體及其片段結(jié)合的表位。為此，用scFvA作為該類分子的有代表性的成員并用人GM-CSF作為抗原，由此進(jìn)4亍肽點(diǎn)樣(peptidespotting)("肽點(diǎn)"(pepspot))分析。一般而言，肽點(diǎn)樣實(shí)驗(yàn)按如下方式進(jìn)行。源自hGM-CSF的氨基酸序列(對(duì)于人和其他某些靈長(zhǎng)類的GM-CSF序列，參見上文以及圖8A、以及SEQIDNO:49-51)的重疊的13-mer肽的C-末端共價(jià)連接于Whatman50纖維素膜上，而乙?；腘-末端仍保持游離。(由JPTPeptideTechnologiesGmbH產(chǎn)生的)單個(gè)13聚肽分別如下表3所示。任意兩個(gè)不同肽的重疊序列長(zhǎng)度被設(shè)定為ll個(gè)氨基酸。根據(jù)廠商規(guī)程，用無水EtOH洗膜1分鐘，然后用TBS洗，并用TBS/3。/。BSA封閉過夜。在每次隨后的孵育和洗滌中，于室溫進(jìn)行封閉。用TBS/0.05%Tween20洗3次，每次10分鐘，然后用溶于TBS/3%BSA的1|ig/mLscFvA聘育膜2.5小時(shí)，之后如前所述進(jìn)行洗滌。通過用抗Penta-His抗體(Qiagen,0.2嗎/mL,溶于TBS/3%BSA)并接著用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(Fc-y-特異性的)抗體(Dianova,1:10.000，溶于TBS/3%BSA)，用這些抗體中的每一個(gè)分別進(jìn)行孵育1小時(shí)，進(jìn)行scFv檢測(cè)。用TBS/0.05%Tween20洗3次，每次10分鐘，通過增強(qiáng)的4匕學(xué)發(fā)光(SuperSignalWestPicoLuminol/Enhancer〉容'液和SuperSignalWestPicoStablePeroxide溶液；Pierce)來放大信號(hào)并在BioMax膠片(Kodak)上曝光。在點(diǎn)A和B間的肽點(diǎn)串上以及在點(diǎn)C上，檢測(cè)scFvA與人GM-CSF片段的強(qiáng)結(jié)合信號(hào)(參見下表3、和圖8B)。如圖8B所見，與其它點(diǎn)的結(jié)合看上去強(qiáng)度較低。跨越點(diǎn)A和B的點(diǎn)串對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基第15-35位。所有組成該區(qū)域的13-mer肽含有氨基酸第23-27位(RRLLN)的一個(gè)最小氨基酸片段。點(diǎn)C對(duì)應(yīng)于人GM-CSF的氨基酸殘基第65-72位(GLRGSLTKLKGPL)。這些發(fā)現(xiàn)暗示scFvA很可能識(shí)別非連續(xù)的表位。在人GM-CSF的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，氨基酸第15-35位位于螺旋A中，而對(duì)應(yīng)于點(diǎn)C的殘基是位于螺旋C和D之間的環(huán)結(jié)構(gòu)的一部分。分子的三維折疊模型顯示出這些位點(diǎn)相互在空間上接近。點(diǎn)A-B的肽中的最小氨基酸序列基序?qū)?yīng)于人GM-CSF的殘基第23-27位(RRLLN)。從點(diǎn)A至B逐漸增加的信號(hào)強(qiáng)度可以被解釋為，對(duì)應(yīng)于點(diǎn)B的肽比對(duì)應(yīng)于點(diǎn)A的肽中的RRLLN表位有更好的可接近性。在肽A中，表位直接位于與膜相連的C-末端上，而在肽B中，它位于更易接近的肽的N-末端上。表3:固定在纖維素膜上的重疊的13-mer肽的序列。1.APARSPSPST(JPW2.ARSPSPST(JPWEH3.SPSPSTQPWEHVN4.SPS，WEHVNAI5.STQPWEHVNAIQE6.QPWEHVNAIQEAR7.WEHVNAIQEARRL8.HVNAIOEARRLLN(A)9.NA10CARIU,LNLS10.IOI:ARRiLLNI一SRD11.EARRI丄NI.SRDTA12.RRI丄NLSRDTAAE(B)13.LLNLSRDTAAEMN14.NLSRDTAAEMNET15.SRDTAAEMNETVE16.DTAAEMNETVEVI17.AAE畫ETVEVISE18.EMNETVEVISEMF19.NETVEVISEMFDL20.TVEVISEMFDLGE21.EVISEMFDLQEPT22.ISEMFDLQEPTSL23.EMFDLQEPTSUyr24.FDLQEPTSLQTRL25.LQEPTSWTRLEL26.EPTSLQTRLELYK27.TSLQTRLELYKQG28.LQTRLELYKQGLR29.TRLELYK(JGLRGS30.LELYK(JGLRGSLT31丄YKQGLRGSLTKL32.K(GLRGSLTKUCG33.GLRGSI.I.ia,K(;l'l.(C)34.RGSLTKLKGPLTM35.SLTKLKGPLTMMA36.TKLKGPLTMMASH37.LKGPU"MMASHYK38.GPLTMMASHYKCH39.LTMMASHYKQHSP40.MMASHYKQHSPPT41.ASHYKQHSPPTPE42.HYKQHSPPTPETS43.K(JHSPPTPETSSA44.HSPPTPETSSATQ45.PPTPETSSATQTI46.TPETSSATQTITF47.ETSSATQTITFES48.SSATQTITFESFK49.AT(JTITFESFKEN50.QTITFESFKENLK51.1TFESFKENUCDF52.FESFKENLKDFIX53.SFKENUCDFIXVI54.KENLKDFLLVIPF55.NLKDFIXVIPFDS56.KDF1XVIPFDSWE57.FLLVIPFDSWEPV58.LVIPFDSWEPVgE實(shí)施例7:某些人抗人GM-CSF抗體/抗體片段的中和能力實(shí)施例7.1:定性評(píng)估某些有代表性的人抗人GM-CSF抗體和其片段的中和能力該實(shí)驗(yàn)的目的是獲得關(guān)于有代表性的人抗GM-CSF中和抗體和其片段中和活性的定性信息。為此，使用人GM-CSF依賴性細(xì)胞系TF-1(DSMZ,ACC334)。該細(xì)胞系的增殖率取決于人GM-CSF的存在，由此在存在和不存在懷疑具有GM-CSF-中和活性的抗體的條件下將細(xì)胞與人GM-CSF孵育后測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)被用于確定事實(shí)上是否存在該中和活性。如分發(fā)人(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,Braunschweig,德國(guó))所述，TF-1細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco;L-谷氨酰胺，不含酚紅)、10%熱失活FCS中，其中存在2.5ng/mLrhGM-CSF。細(xì)胞生長(zhǎng)至細(xì)胞密度為0.5x106個(gè)細(xì)胞/mL。為了進(jìn)行增殖測(cè)試，以300xg離心4分鐘來收獲TF-1細(xì)胞并用lxPBS(Dulbecco，s，Gibco)洗。細(xì)胞以1x105個(gè)細(xì)胞/mL的終濃度重懸RPMI1640、10%FCS中，每個(gè)Microtest平底細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中使用90pL細(xì)胞懸液(0.9x104個(gè)細(xì)胞/孔)。終濃度為0.3ng/mL的rhGM-CSF被用來刺激TF-1細(xì)胞的增殖。為了中和GM-CSF依賴性的增殖，含人抗GM-CSF抗體的有代表性的片段的純化的PPP于25。C用lxPBS透析2小時(shí)。將lOpl經(jīng)透析并無菌過濾的蛋白質(zhì)溶液(0.22,濾膜)力口到100pl含TF-1和rhGM-CSF的溶液中。于37。C在5%C02下孵育72小時(shí)后，用基于活細(xì)胞中線粒體脫氫酶裂解四唑鹽(WST-1，Roche)的比色測(cè)試來確定TF-1細(xì)胞的增殖狀態(tài)。由代謝活性細(xì)胞產(chǎn)生的曱臘染料通過用ELISA讀數(shù)儀測(cè)量其在450mii處的吸收來定量。測(cè)試的人抗人GM-CSF抗體片段的有代表性的片段對(duì)TF-1細(xì)胞的人GM-CSF依賴性增殖的抑制，其強(qiáng)度參差不齊(圖9)。盡管兩種這樣的片段不具有中和效果(scFvF和scFvL);五種構(gòu)建體(scFvJ,scFvK，scFvM，scFvN，和scFvH)顯示出中度的抑制,而有七種構(gòu)建體(scFvB，scFvI,scFvE，scFvD,scFvG,scFvC，scFvA)顯示出-十TF-1細(xì)月包的GM-CSF依賴性增殖的強(qiáng)抑制。缺乏中和效果或較低程度的中和效果可能是由于特定的有代表性的scFv的較低的表達(dá)水平而造成的，或由特定的有代表性的scFv和rhGM-CSF在37°C孵育的72小時(shí)期間形成了較不穩(wěn)定的復(fù)合物而造成的。實(shí)施例7.2:通過細(xì)胞增殖測(cè)定來定量評(píng)估某些有代表性的人抗人GM-CSF抗體和其片段的中和能力然后對(duì)選出的以上顯示出有強(qiáng)TF-1增殖抑制性的有代表性的scFv分子進(jìn)行中和功效的定量分析。為此，使用相同的人GM-CSF依賴性細(xì)胞系TF-1(DSMZACC334)。如以上實(shí)施例7.1中所詳細(xì)描述的，培養(yǎng)并制備TF-1細(xì)胞以進(jìn)行增殖測(cè)試。終濃度為0.3ng/mL的rhGM-CSF被用于刺激TF-1細(xì)胞增殖。為了中和GM-CSF依賴性的增殖，將10^1有代表性的人抗人GM-CSF中和性單克隆抗體或其片段的純化的樣品加入到含100(ilTF-1和連續(xù)稀釋的rhGM-CSF的溶液中。最終蛋白質(zhì)濃度為10|ig/ml至10pg/ml。樣品于37。C在5。/。C02下孵育72小時(shí)。72小時(shí)后，如以上實(shí)施例7.1所述來確定TF-1細(xì)胞的增殖狀態(tài)。利用Prism軟件的非線性回歸曲線擬合，使數(shù)據(jù)被擬合成增殖的半最大抑制濃度(ICso)?？纱_定并定量如以上實(shí)施例7.1中所述的定性增殖-抑制實(shí)驗(yàn)中清楚可見的GM-CSF中和效應(yīng)。在該增殖-抑制實(shí)驗(yàn)中，所有測(cè)試的人抗人GM-CSF單克隆中和抗體的scFv片段顯示出在納摩爾水平的半最大抑制常數(shù)(ICso)。如圖10A所見，可確立中和效應(yīng)的清楚等級(jí)排名。測(cè)試的人抗人GM-CSF單克隆中和IgG抗體顯示出顯著高于它們scFv對(duì)應(yīng)物的中和功效。該實(shí)驗(yàn)中得到的IgG分子的半最大抑制常數(shù)是在亞納摩爾范圍內(nèi)的。如圖10B所見，由IgGA所評(píng)估出的IC50為0.9nM，而IgGB具有0.3nM的IC50。為了檢查得自IgGA和B的scFv抗體片段(分別是scFvO和P)的中和能力是否在量上與scFvA和B相當(dāng)，如上所述來進(jìn)行類似的TF-1中和測(cè)試，但其中利用scFvO和P作為測(cè)試分子。對(duì)于scFvP和O,結(jié)果分別如圖10C和10D所示。如圖IOD所見，scFvO與scFvA具有相同的中和潛力，這顯示將IgG還原為scFv形式是可能的，并且不喪失生物活性。實(shí)施例7.3:通過測(cè)定降低的IL-8產(chǎn)量來定量評(píng)估某些有代表性的人抗rhGM-CSF抗體和其片段的中和能力通過測(cè)量U-937細(xì)胞的GM-CSF依賴性IL-8產(chǎn)量，進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)以定量有代表性的人抗人GM-CSF抗體及其片段的中和活性。前述實(shí)驗(yàn)中所用的GM-CSF抗原是rhGM-CSF。如分發(fā)人(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,Braunschweig,德國(guó))所述，單核細(xì)胞U-937細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基Gibco(L-谷氨酰胺，不含酚紅)中，其中補(bǔ)加了10%熱失活的FCS。細(xì)胞生長(zhǎng)至細(xì)胞密度為1x106個(gè)細(xì)胞/mL。為了進(jìn)行基于測(cè)量IL-8產(chǎn)量的抑制測(cè)試，以300xg離心4分鐘來收獲細(xì)胞，并以1x106個(gè)細(xì)胞/mL的終濃度重懸于RPMI1640、10%FCS中。1.8x105個(gè)細(xì)胞/孔(180fiL細(xì)胞懸液)接種于Microtest平底細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中。終濃度為1ng/mL的rhGM-CSF被用來刺激U-937細(xì)胞產(chǎn)生IL-8。將純化的scFv或IgG加入到180piU937細(xì)胞和連續(xù)稀釋成10|ug/mL至10pg/mL最終蛋白質(zhì)濃度的rhGM-CSF溶液中。于37。C和5%C02孵育18小時(shí)后，以600xg離心培養(yǎng)板2分鐘來沉淀細(xì)胞。通過吸入新的板中來收獲培養(yǎng)物上清液，并利用OptEIA人IL-8ELISA套件(BectonDickensonandCompany)分析以確定其中IL-8的濃度。才艮據(jù)廠商的說明書進(jìn)行ELISA檢測(cè)。簡(jiǎn)而言之，50用0.1M碳酸鈉(pH9.5)稀釋的捕獲抗體于4°C包被于Microtest板上過夜。用PBS/0.05%Tween20洗3次后，每孔用200PBS/10%FCS于室溫封閉孔1小時(shí)，然后用PBS/0.05%Tween20洗三次。然后，將50)iL培養(yǎng)物上清液樣品加到孔中并于室溫孵育2小時(shí)。對(duì)于此后對(duì)IL-8濃度的定量，在過程中使用由廠商提供的連續(xù)稀釋的IL-8標(biāo)準(zhǔn)品。用PBS/0.05%Tween20洗5次后，利用OptEIA人IL-8ELISA套件提供的50|iLWorkingDetector(檢測(cè)Ab+Av-HRP)進(jìn)行檢測(cè)。于室溫孵育1小時(shí)后，再洗孔7次。加入OPD底物溶液(Sigma)放大信號(hào)，并在4卯nm波長(zhǎng)處檢測(cè)(利用參照波長(zhǎng)620nm)。畫出IL-8標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行校正，并根據(jù)該校正曲線計(jì)算出培養(yǎng)物上清液樣品中的IL-8濃度。利用Prism軟件的非線性回歸曲線，將數(shù)據(jù)擬合成IL-8產(chǎn)量的半最大抑制濃度(IC50)。如圖11中所清晰可見的隨著scFv濃度增加而IL-8濃度減少，所有測(cè)試的人抗rhGM-CSF單克隆中和抗體的有代表性的片段顯示能明顯抑制U-937細(xì)胞的GM-CSF依賴性IL-8產(chǎn)生。在該實(shí)驗(yàn)中所見的中和功效等級(jí)排名符合在上述TF-l增殖-抑制實(shí)驗(yàn)中測(cè)試相同分子中和效應(yīng)所得的等級(jí)排名。將能注意到，在該實(shí)驗(yàn)中所確定的ICso值比在之前TF-l增殖實(shí)驗(yàn)中相同分子所得的那些要大。這是由于刺激U-937細(xì)胞產(chǎn)生IL-8所需的GM-CSF濃度比刺激TF-1所需的要大而造成的。實(shí)施例7.4:通過測(cè)定細(xì)胞增殖來定量評(píng)估有代表性的人抗人GM-CSF抗體和其片段對(duì)重組獼猴GM-CSF的中和能力該實(shí)驗(yàn)的目的是顯示有代表性的人抗人GM-CSF抗體及其片段對(duì)來自于獼猴科非人靈長(zhǎng)類的GM-CSF("macGM-CSF")的中和能力。為了顯示所選的scFv和IgG分子對(duì)macGM-CSF的中和效應(yīng)，根據(jù)實(shí)施例7.1和7.2中所述的規(guī)程進(jìn)行增殖-抑制實(shí)驗(yàn)，其中利用了macGM-CSF來代替hGM-CSF。hGM-CSF和macGM-CSF都以相同的半最大功效(ECso)來刺激TF-1細(xì)胞的增殖。在測(cè)試scFv分子的實(shí)驗(yàn)中，終濃度為3ng/ml的macGM-CSF被用于刺激TF-l細(xì)胞增殖，而在測(cè)試作為有代表性的人抗人GM-CSF抗體的IgGB的實(shí)驗(yàn)中，用0.3ng/mLrhGM-CSF細(xì)胞。為了中和TF-1細(xì)胞的增殖，將10pi純化的人抗人GM-CSF抗體或其片段加入到100piTF-l和連續(xù)稀釋的macGM-CSF溶液中。最終蛋白質(zhì)濃度為10pg/ml至10pg/ml。樣品于37。C在5。/。C02下孵育72小時(shí)。72小時(shí)后，如實(shí)施例7.1和7.2所述來確定TF-1細(xì)胞的增殖狀態(tài)。利用Prism軟件的非線性回歸曲線，將數(shù)據(jù)擬合成增殖的半最大抑制濃度(IC50)。如圖12A所見，某些有代表性的人抗人GM-CSF單克隆抗體片段也顯示出明顯的macGM-CSF中和潛力(scFvB，scFvE,scFvC,scFvI,scFvA)。另外，如圖12B所見，有代表性的人抗人GM-CSF單克隆抗體IgGB的濃度增加清楚地使TF-1增殖降低，這證明了該抗體的中和潛力。有趣的是，在該實(shí)驗(yàn)中利用IgGB抑制由macGM-CSF誘導(dǎo)的TF-1細(xì)胞增殖而得到的IC50值(0.3nM)等于在利用hGM-CSF的實(shí)驗(yàn)中得到的，這顯示IgGB對(duì)這些物種中的GM-CSF有清楚的交叉反應(yīng)性。實(shí)施例8:IgGB與來自各種物種的GM-CSF的交叉反應(yīng)性研究IgGB與來自各種非人物種的GM-CSF的交叉反應(yīng)性以確定適于進(jìn)行以后體內(nèi)研究的物種。在第一組實(shí)驗(yàn)中，在ELISA實(shí)驗(yàn)中測(cè)試IgGB與來自人(Leukine⑧，Berlex)、豬、狗、大鼠(R&DSystems,Wiesbaden,德國(guó))和小鼠(StrathmannBiotech,Hamburg,德國(guó))的商品化的重組GM-CSF的結(jié)合。具體地，用來自所述各種物種的1pg/mLGM-CSF來包被ELISA板。加入連續(xù)稀釋的IgGB并用辣根過氧化物酶綴合的抗人IgGl抗體一企測(cè)。加入鄰苯二氨("OPD",與過氧化物酶反應(yīng)時(shí)呈黃-橘黃色)底物溶液(Roche，德國(guó))使ELISA顯色，并測(cè)定490nm處。如圖13所見，IgGB顯示出與重組人GM-CSF強(qiáng)結(jié)合，而來自于其他測(cè)試的物種的GM-CSF不被識(shí)別。因此，豬、狗、大鼠或小鼠不是合適的用于體內(nèi)測(cè)試的物種?？墒牵缫陨蠈?shí)施例7.4所見，IgGB顯示出與macGM-CSF(來自于食蟹猴(cynomolgousmonkey),macaco/as"'cw/鎖's)有顯著的交叉反應(yīng)性，這暗示至少一種來自于獼猴科的猴子物種適于進(jìn)行IgGB的體內(nèi)研究。實(shí)施例9:IgGB與GM-CSF的不同糖基化變體的結(jié)合該實(shí)驗(yàn)的目的是確定IgGB與GM-CSF的結(jié)合程度依賴于后者糖基化模式。為此，測(cè)試連續(xù)稀釋的含天然hGM-CSF(人糖基化)、以及來自于大腸桿菌(未糖基化)和酵母(酵母糖基化)的重組hGM-CSF、以及重組獼猴GM-CSF的條件培養(yǎng)基，測(cè)試它們誘導(dǎo)TF-1增殖的能力。人糖基化的GM-CSF得自IL-113處理的BEAS-2B細(xì)胞(人肺細(xì)胞，其得自ATCCCRL-9609)的培養(yǎng)物上清液。BEAS-2B細(xì)胞在用BEGMBullet試劑盒(Cambrex，Verviers,比利時(shí))替換的BEBM培養(yǎng)基中增殖，但培養(yǎng)于RPMI1640、10%FCS中，其中存在50ng/mLIL-1J3(StrathmannBiotech,Hamburg,德國(guó))，由此請(qǐng)導(dǎo)GM-CSF產(chǎn)生。于37°C、5%C02孵育48小時(shí)后，根據(jù)廠商的說明書，利用OptEIA人GM-CSFElisa套件(BDBiosciences,Heidelberg,德國(guó))分析培養(yǎng)物上清液的GM-CSF含量。如WO2005/105844實(shí)施例1.1所示，來內(nèi)在產(chǎn)生來自大腸桿菌的重組hGM-CSF。來自酵母的重組hGM-CSF來自商業(yè)途徑，其商品名為"Leukine"(Berlex,美國(guó))。獼猴GM-CSF在HEK293細(xì)胞中重組產(chǎn)生。首先測(cè)試連續(xù)稀釋的含天然hGM-CSF、以及來自于大腸桿菌和酵母的重組hGM-CSF、和獼猴GM-CSF的條件培養(yǎng)基，測(cè)試其誘導(dǎo)TF-1增殖的能力。所有三種人GM-CSF的糖基化變體和獼猴GM-CSF對(duì)于TF-1活化都顯示出非常相似的EC50值。這些分別為，對(duì)于大腸桿菌產(chǎn)生的hGM-CSF為10pg/mL，對(duì)于酵母產(chǎn)生的hGM-CSF為15pg/mL對(duì)于人肺細(xì)胞產(chǎn)生的hGM-CSF為36pg/mL,而且對(duì)于獼猴GM-CSF為11pg/mL(圖14A)。然后，在存在0.3ng/mL重組hGM-CSF、或0.2ng/mL生理hGM-CSF的情況下，確定IgGB的中和活性，72小時(shí)后，通過比色反應(yīng)來定量存在不同IgGB濃度的情況下的TF-1細(xì)胞的增殖狀態(tài)(圖14B)。綜合而言，圖14中所示的數(shù)據(jù)顯示IgGB以亞摩爾濃度抑制TF-1細(xì)胞的GM-CSF依賴性增殖，明顯不依賴于人GM-CSF的糖基化模式。因此，人GM-CSF的糖基化模式基本不影響IgGB中和GM-CSF活性的能力。5實(shí)施例10:IgGB對(duì)嗜曙紅細(xì)胞上GM-CSF的生物活性的影響實(shí)施例10.1:IgGB對(duì)GM-CSF介導(dǎo)的嗜曙紅細(xì)胞存活的影響GM-CSF的各種生物活性之一是延長(zhǎng)嗜曙紅和嗜中性粒細(xì)胞的存活。因?yàn)榉窝仔约膊∨c在維持炎癥中起實(shí)質(zhì)作用的嗜曙紅細(xì)胞局部積聚相關(guān)，因此可以測(cè)試IgGB抑制GM-CSF介導(dǎo)的嗜曙紅細(xì)胞存活的功效。通過從密度梯度離心而得到的粒細(xì)胞群中去除CD16+嗜中性白細(xì)胞并裂解紅血球，自健康供體的外周血中分離嗜曙紅細(xì)胞。新分離的外周血嗜曙紅細(xì)胞以5x104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔平板Microtest板中的RPMI1640/10%FCS和Pen/Strep中。將GM-CSF連續(xù)稀釋成33ng/mL至10pg/mL,將其加入以監(jiān)測(cè)濃度依賴性的嗜曙紅細(xì)胞的存活。為了分析IgGB對(duì)GM-CSF依賴性嗜曙紅細(xì)胞存活的抑制潛力，加入抗體，其被連續(xù)稀釋至10pg/mL至0.1ng/mL。終濃度為0.1ng/mL的GM-CSF被用于影響嗜曙紅細(xì)胞存活。于37。C、5。/。C02孵育72小時(shí)，加入WST-1試劑。通過測(cè)量450nm處的吸收，來定量所得到的對(duì)應(yīng)于活細(xì)胞部分的比色反應(yīng)。利用prism軟件包的非線性回歸曲線擬合來分析數(shù)據(jù)，并擬合出存活的半最大抑制濃度(ICSO)。如圖15A所見，確定rhGM-CSF的半最大效應(yīng)劑量(EC50)為0.02ng/mL。如圖15B所見，觀察到IgGB的有效中和效應(yīng)，嗜曙紅細(xì)胞存活的半最大抑制濃度達(dá)到0.13nM抗體濃度。這些數(shù)據(jù)顯示IgGB能以劑量依賴性方式來有效抑制GM-CSF依賴性-嗜曙紅細(xì)胞存活。實(shí)施例10.2:IgGB對(duì)GM-CSF誘導(dǎo)的嗜曙紅細(xì)胞活化的影響也希望研究IgGB對(duì)GM-CSF誘導(dǎo)的嗜曙紅細(xì)胞活化的影響。在刺激20小時(shí)或3天后的分離自人血的外周嗜曙紅細(xì)胞(CD16-)上，發(fā)現(xiàn)CD69表達(dá)能被上調(diào)，其中所述細(xì)胞的刺激用(a)0.1ng/mLGM-CSF或(b)0.1ng/mLGM-CSF、IL-3和IL-5，但不單用(c)0.1ng/mLIL-3和IL-5(圖16A)。在僅存在培養(yǎng)基的情況下培養(yǎng)的嗜曙紅細(xì)胞顯示出不能上調(diào)CD69。因此，CD69可被當(dāng)作GM-CSF活化嗜曙紅細(xì)胞的標(biāo)記，而且監(jiān)測(cè)CD69的表達(dá)水平來測(cè)量GM-CSF依賴性嗜曙紅細(xì)胞活化。如在流式細(xì)胞計(jì)中缺少CD69表達(dá)而見到的，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(20小時(shí)和3天)上，IgGB(10|ag/mL)幾乎能完全防止嗜曙紅細(xì)胞的GM-CSF依賴性活化。如上述實(shí)施例10.1來分離嗜曙紅細(xì)胞并以5x105個(gè)細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)于48孔平底Microtest板中的RPMI1640/10%FCS和Pen/Strep中。單獨(dú)用培養(yǎng)基孵育細(xì)胞，或在只存在0.1ng/mLGM-CSF的情況下，或同時(shí)用O.lng/mLIL-3或IL-5。用10|ag/mLIgGB中和GM-CSF。孵育1或3天后，通過流式細(xì)胞計(jì)來分析細(xì)胞的CD69表達(dá)。通過流式細(xì)胞計(jì)檢測(cè)CD69:在FACSCalibur儀器(BectonDickinson)上確定CD69在嗜曙紅細(xì)胞上的表達(dá)。105個(gè)細(xì)胞與5FITC-綴合的抗人CD16(克隆3G8，BDBiosciences)和PE綴合的抗人CD69抗體(克隆FN50，BDBiosciences)于4°C分別孵育1小時(shí)。使用無關(guān)的、同型匹配的FITC-和PE綴合的抗體作為陰性對(duì)照。孵育后，細(xì)胞用PBS、1%FCS、0.05%NaN3洗兩次，并重懸于250)LiLPBS、1%FCS、0.05%NaN3中。加入碘化丙錠至終濃度1)ig/mL，以標(biāo)記死細(xì)胞，然后立即進(jìn)行FACS分析。利用CellQuestPro軟件(BDBiosciences)進(jìn)行數(shù)據(jù)解釋。碘化丙錠陽性(即，死的)細(xì)胞排除出CD69表達(dá)的分析中。如通過亞丙基石典染色CD167CD69+細(xì)胞而監(jiān)測(cè)到的，存在0.1ng/mLGM-CSF時(shí)，IgGB也降低了活的和活化的嗜曙紅細(xì)胞的百分比。IgGB降低了活化細(xì)胞的百分比，在1天后從35%降至8%，而在3天培養(yǎng)后從43%降至3%。在存在0.1ng/mLGM-CSF、IL-3和IL-5的情況下，活的和活化的嗜曙紅細(xì)胞的百分比在1和3天后分別從32%降至8%和從48%降至11%。即使CD69的上調(diào)完全被IgGB抑制了，但在存在0.1ng/mLGM-CSF、IL-3和IL-5的情況下，相對(duì)于只用培養(yǎng)基或GM-CSF孵育的細(xì)胞，有更多的靜息嗜曙紅細(xì)胞(CD167CD69-)存活了3天(圖16A，最后一欄)。對(duì)于存在0.1ng/mLIL-3和IL-5的情況下孵育的細(xì)胞，觀察到了相同結(jié)果。在劑量發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中，將連續(xù)稀釋的IgGB加入到在存在0.1ng/mLGM-CSF的情況下培養(yǎng)的嗜曙紅細(xì)胞中(圖16B)。觀察到了IgGB對(duì)CD69依賴性平均焚光強(qiáng)度(MFI)的抑制效應(yīng)，其半最大濃度為0.22nMIgGB。綜合而言，這些數(shù)據(jù)顯示了，在與炎性氣道疾病(例如哮喘)高度相關(guān)的生物狀況中，IgGB是有效的GM-CSF活性中和劑。實(shí)施例11:利用IgGB的初步離體毒理研究如上所解釋的，中和GM-CSF活性對(duì)于許多疾病情況有治療優(yōu)勢(shì)。可是同時(shí)，GM-CSF在正常的免疫系統(tǒng)功能中起重要作用，能對(duì)抗外來病源，例如通過嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞而起吞噬作用。在存在治療量的IgGB的情況下，該嗜中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞的天然功能應(yīng)當(dāng)仍舊不受影響。因此，我們研究了吞噬過程的兩個(gè)方面1)消化細(xì)菌(吞噬作用)；和2)氧化爆發(fā)(burst)活性(預(yù)示細(xì)胞內(nèi)殺傷)。這些研究在以下實(shí)施例中有詳述。實(shí)施例11.1:消化細(xì)菌(吞噬作用)利用Orpegen(Heidelberg,德國(guó))的Phagotest試劑盒，從而在肝素化的全血中確定粒細(xì)胞和單核細(xì)胞吞噬活性。該測(cè)試基于吞噬細(xì)胞調(diào)理素作用的、熒光標(biāo)記的大腸桿菌的消化。然后，在流式細(xì)胞計(jì)中通過綠色熒光來檢測(cè)這些細(xì)胞。將20pl熒光素標(biāo)記的調(diào)理素作用的大腸桿菌加入到100jil肝素化的全血中并于37。C孵育。在0。C孵育用以作為陰性對(duì)照。10分鐘后，在冰上冷卻樣品并加入100pl淬滅溶液(Orpegen)來停止吞噬過程。通過淬滅表面結(jié)合的細(xì)菌的FITC焚光，該溶液能區(qū)分細(xì)菌的粘附和內(nèi)在化，而內(nèi)在化的顆粒的焚光仍不受影響。用3ml洗滌溶液(Orpegen)進(jìn)行3次洗滌步驟后，溶解紅血球。剩下的白細(xì)胞用3ml洗滌溶液(Orpegen)洗一次。加入200nlDNA染色溶液，其能排除集聚的細(xì)菌或細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞計(jì)分析細(xì)胞。通過FITC-熒光法來確定已進(jìn)行吞噬作用的細(xì)胞百分比。為了確定IgGB對(duì)吞噬作用的影響，將lgGB加入3個(gè)一致的血樣中，其終濃度為10pg/ml。然后使這些3個(gè)樣品于37。C與IgGB孵育不同時(shí)間，然后加入大腸桿菌。將大腸桿菌立即加入到第一個(gè)樣品中，而在24和48小時(shí)后分別將大腸桿菌加入到第二個(gè)和第三個(gè)樣品中。通過粒細(xì)胞所觀察到的結(jié)果直接取血后，在存在或缺失IgGB的情況下，超過98。/。的粒細(xì)胞消化細(xì)菌(圖17A)。將血樣與IgGB孵育24小時(shí)后，測(cè)定到無IgGB的情況下下降到約92%，而在存在IgGB的情況下下降到卯％(圖17B)。48小時(shí)后，在缺失IgGB的情況下有81%的粒細(xì)胞是吞噬作用陽性的，而在存在IgGB的情況下有89。/。(圖nc)。通過單核細(xì)胞所觀察到的結(jié)果無論IgGB存在與否，直接取血后，有98。/。單核細(xì)胞是能進(jìn)行吞噬的(圖18A)。與IgGB預(yù)先孵育24小時(shí)后，90%的單核細(xì)胞是陽性的(圖18B)。在沒有IgGB的情況下預(yù)先孵育24小時(shí)后，有92%的單核細(xì)胞。48小時(shí)后，我們發(fā)現(xiàn)在不存在IgGB的情況下有81。/o的單核細(xì)胞，而在存在IgGB的情況下有89。/。為吞噬作用陽性的(圖18C)。實(shí)施例11.2:氧化爆發(fā)利用Orpegen(Heiddberg，德國(guó))的Phagotest試劑盒，從而在肝素化的全血中確定粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的氧化爆發(fā)活性。該測(cè)試能確定吞噬細(xì)胞的百分比，所述細(xì)胞通過將底物二氫若丹明(DHR)123氧化成焚光R123,能產(chǎn)生反應(yīng)性氧化劑。在流式細(xì)胞計(jì)中能鑒定出顯示氧化爆發(fā)活性的細(xì)胞。肝素化的血與不同刺激物一起孵育以誘導(dǎo)出氧化爆發(fā)活性將佛波醇12-豆蔻酰13-乙酯("PMA")作為強(qiáng)刺激物；將未標(biāo)記的、調(diào)理素作用的大腸桿菌作為中度刺激物，并將趨化肽N-曱酰-MetLeuPhe(fMLP)作為弱刺激物。100pl全血與這些刺激物于37。C在一起孵育。作為陰性對(duì)照，不刺激而進(jìn)行孵育。IO分鐘后，加入孵育DHR123底物溶液，并再孵育10分鐘。通過氧化細(xì)胞，將DHR123轉(zhuǎn)化為有萸光的R123。用3ml洗涂溶液(Orpegen)進(jìn)行3次洗滌步驟后，溶解紅血球。剩下的白細(xì)胞用3ml洗滌溶液(Orpegen)洗一次。加入200plDNA染色溶液，其能排除集聚的細(xì)菌或細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞計(jì)分析細(xì)胞。為了確定IgGB對(duì)氧化爆發(fā)的影響，將IgGB加入3個(gè)一致的血樣中，其終濃度為10pg/ml。然后使這些3個(gè)樣品的每一個(gè)分成3等分并使之于37。C孵育不同時(shí)間，然后向每個(gè)等分加入大腸桿菌、fMLP或PMA。將大腸桿菌、艦LP或PMA立即加入到第一個(gè)樣品的三個(gè)等分中，而在24和48小時(shí)后分別將大腸桿菌加入到第二個(gè)和第三個(gè)樣品的三個(gè)等分中。缺乏IgGB的平行血樣如上一樣地處理，作為對(duì)照。結(jié)果如下表4所示，其中左邊第二個(gè)柱中的"+，，表示IgGB存在于所測(cè)試的樣品等分中，而左邊第二欄中的"-"表示不含IgGB的對(duì)照。表4:IgGB對(duì)粒細(xì)胞氧化爆發(fā)行為的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>因此整體上來說可以斷定，在生理相關(guān)溫度下，IgGB的存在并不對(duì)粒細(xì)胞或單核細(xì)胞的吞噬作用或氧化殺死細(xì)菌作用產(chǎn)生不利影響。然后，這些結(jié)果提示，在體內(nèi)情況下，治療性給藥IgGB預(yù)計(jì)不會(huì)不利地影響患者的正常免疫防御。權(quán)利要求1.人單克隆抗體或其片段，其特異結(jié)合并中和靈長(zhǎng)類GM-CSF。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人單克隆抗體或其片段，其中所述靈長(zhǎng)類是人或非人靈長(zhǎng)類。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人單克隆抗體或其片段，其中所述非人靈長(zhǎng)類是食蟹猴、恒河猴或長(zhǎng)臂猿。4.根據(jù)以上權(quán)利要求之任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體，其中所述抗體是IgG。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人單克隆抗體，其中所述IgG是IgGl或IgG4。6.根據(jù)權(quán)利要求1至3之任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體片段，其中所述片段是scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fv、VHH抗體、雙抗體、串聯(lián)雙抗體、Fab、Fab，或F(ab)2。7.以上權(quán)利要求之任一項(xiàng)的人單克隆抗體或其片段，其中所述人單克隆抗體或其片段特異結(jié)合靈長(zhǎng)類GM-CSF的表位，優(yōu)選是不連續(xù)表位，所述表位包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/或氨基酸第65-77位(GLR/QGSLTKLKGPL)。8.權(quán)利要求7的人單克隆抗體或其片段，其中所述不連續(xù)表位進(jìn)一步包含氨基酸第28-31位(LSRD)。9.權(quán)利要求7或8的人單克隆抗體或其片段，其中所述不連續(xù)表位進(jìn)一步包含氨基酸第32-33位(TA)和/或氨基酸第21-22位(EA)。10.以上權(quán)利要求之任一項(xiàng)的人單克隆抗體或其片段，其中所述人單克隆抗體或其片段在其重鏈可變區(qū)中包含CDR3,所述CDR3包含選自由SEQIDNO:1-13或56之任一所示的序列組成的組的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的人單克隆抗體或其片段，其中所述重鏈可變區(qū)CDR3序列之任一和SEQIDNO:14所示的重鏈可變區(qū)CDR1序列和SEQIDNO:15所示的重鏈可變區(qū)CDR2序列一起存在于重鏈可變區(qū)中。12.根據(jù)權(quán)利要求IO或11所述的人單克隆抗體或其片段，其中所述人單克隆抗體或其片段在其輕鏈可變區(qū)中包含含有SEQIDNO:16所示氨基酸序列的CDR1、含有SEQIDNO:17所示氨基酸序列的CDR2、和含有SEQIDNO:18所示氨基酸序列的CDR3。13.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的人單克隆抗體或其片段，其中所述人單克隆抗體或其片段在其輕鏈可變區(qū)中進(jìn)一步包含如SEQIDNO.19、54或55所示的氨基酸序列。14.根據(jù)權(quán)利要求10-13之任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或其片段，其中所述人單克隆抗體或其片段在其重鏈可變區(qū)中包含如SEQIDNO:20-33、52或53之任一所示的氨基酸序列。15.根據(jù)以上權(quán)利要求之任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或其片段，其在其輕鏈可變區(qū)中包含含有如SEQIDNO.16所示氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO.17所示氨基酸序列的CDR2和具有如SEQIDNO.18所示氨基酸序列的CDR3;并且在其重鏈可變區(qū)中包含含有如SEQIDNO.14所示氨基酸序列的CDR1區(qū)、具有如SEQIDNO.15所示氨基酸序列的CDR2區(qū)和具有如SEQIDNO.1-13或56之任一所示氨基酸序列的CDR3。16.權(quán)利要求10-15之任一項(xiàng)的人單克隆抗體，其包含如SEQIDNO:34所示的輕鏈氨基酸序列和如SEQIDNO:35-48之任一所示的重鏈氨基酸序列。17.權(quán)利要求10-16之任一項(xiàng)的人單克隆抗體或其片段，所述人單克隆抗體或其片段包含與如SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一所示的各氨基酸序列有至少70%同源性的氨基酸序列。18.多核苷酸分子，其具有編碼如SEQIDNO.1-48和/或52至56之任一項(xiàng)所示氨基酸序列的核苷酸序列、或與其顯示出有至少70%同源性的核苷酸序列，其中同源性可通過序列比對(duì)將具有編碼SEQIDNO:l-48和/或52-56之任一氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子與具有所論及的核苷酸序列的多核苷酸分子進(jìn)行比較而確定，其中，如果所述序列中的核苷酸與編碼SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一的相應(yīng)氨基酸序列的核苷酸序列中的相應(yīng)核苷酸一致，或者如果所論及的序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸相對(duì)于編碼SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一氨基酸序列的核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)核苷酸有差別，使核苷酸三聯(lián)體在被翻譯后產(chǎn)生與SEQIDNO:1-48和/或52-56之任一的相應(yīng)氨基酸序列中相應(yīng)氨基酸相同(由于簡(jiǎn)并三聯(lián)體而造成)或保守替代，則所論及的序列中的核苦酸被認(rèn)為是同源的。19.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或其片段或權(quán)利要求18所述的多核苷酸分子。20.權(quán)利要求l-17任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或其片段或權(quán)利要求18所述的多核苦酸分子在制備用于治療炎性疾病的藥物中的用途，所述藥物任選包含一種或多種其他炎性試劑。21.權(quán)利要求20的用途，其中所述炎性疾病選自由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(包括對(duì)用TNF-a中和劑治療有抗性的RA)、哮喘、多發(fā)性硬化(MS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、特發(fā)性肺纖維變性(IPF)、炎性腸病(IBD)、色素層炎、黃斑變性、結(jié)腸炎、牛皮癬、沃勒變性、抗磷脂綜合癥(APS)、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、復(fù)發(fā)性多軟骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失敗的整形外科植入、腎小球腎炎、狼瘡或自身免疫疾病組成的組。22.權(quán)利要求l-17任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或其片段或權(quán)利要求18所述的多核苷酸分子在制備用于治療腫瘤性疾病或其他具有延遲細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞存活或增殖的病癥的藥物中的用途，所述藥物任選包含一種或多種其他抗癌劑。23.權(quán)利要求22的用途，其中所述腫瘤性疾病是癌。24.權(quán)利要求23的用途，其中所述癌是白血病、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌或皮膚癌。全文摘要本發(fā)明涉及特異結(jié)合并中和靈長(zhǎng)類GM-CSF的人單克隆抗體或其片段。文檔編號(hào)C07K16/24GK101184777SQ200680018858公開日2008年5月21日申請(qǐng)日期2006年4月18日優(yōu)先權(quán)日2005年4月18日發(fā)明者伊娃·維瑟,安德烈亞斯·沃爾夫,托拜厄斯·勞姆,斯蒂文·澤曼,朱莉婭·赫普(尼亨克爾),桑德拉·布魯克梅爾,西爾克·佩奇(尼米特爾斯特拉斯)申請(qǐng)人:米克羅麥特股份公司