Dna微陣列芯片檢測(cè)與ⅱ型糖尿病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種DNA微陣列芯片檢測(cè)與Ⅱ型糖尿病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的方法，屬于DNA微陣列芯片【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明提供的方法利用6條寡核苷酸修飾的金納米粒子作為標(biāo)記物，結(jié)合篩選出的6條用于Ⅱ型糖尿病檢測(cè)的寡核苷酸探針研制了一種可以同時(shí)檢測(cè)6個(gè)與Ⅱ型糖尿病相關(guān)突變位點(diǎn)的微陣列芯片檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)模擬Ⅱ型糖尿病的DNA樣品和Ⅱ型糖尿病的實(shí)際樣品的檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】DNA微陣列芯片檢測(cè)與II型糖尿病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性 的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種DNA微陣列芯片檢測(cè)與II型糖尿病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的方 法，屬于DNA微陣列芯片【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] II型糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素共同作用而引起的一種多基因遺傳異質(zhì)性 疾病。從遺傳學(xué)角度研究其發(fā)病機(jī)制對(duì)糖尿病前期的篩查、診斷和干預(yù)非常重要（A genome-wide association study identified novel risk loci for type 2diabetes. Nature. 2007,445,881-885 ；Genome-ffide Association Analysis Identifies Loci for Type 2Diabetes and Triglyceride Levels. Science, 2007, 316, 1331-1336.)。在復(fù)雜疾 病的遺傳機(jī)制研究中，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNPs)分析能 為復(fù)雜性狀的遺傳機(jī)制研究提供一條便捷、有效的途徑。篩選能應(yīng)用于與II型糖尿病發(fā)病 有關(guān)SNPs檢測(cè)的寡核苷酸探針，對(duì)II型糖尿病的預(yù)防和個(gè)體化治療等具有重要的意義。
[0003] 微陣列生物芯片具有樣品用量少和高通量的特性，能對(duì)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)中的各 種生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行集成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因、配體及抗原等生物活性物質(zhì)乃至細(xì)胞、 組織進(jìn)行高效快捷的測(cè)試和分析。例如DNA微陣列芯片已被廣泛應(yīng)用到基因組學(xué)研究、 藥物篩選和臨床檢測(cè)中（Resolving Individuals Contributing Trace Amounts of DNA to Highly Complex Mixtures Using High-Density SNP Genotyping Microarrays. PLoS Genet, 2008,4，1-9 !Technology Insight:microarrays-research and clinical applications. Nature Rev. Endocrinol.，2007, 3, 594-605.)〇
[0004] 金納米粒子具有優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性和獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)。通過(guò)在金納米粒子表 面修飾不同的生物分子（如DNA、抗體和凝集素等）作為微陣列生物芯片的標(biāo)記探針， 根據(jù)其共振光散射性質(zhì)，可以建立高靈敏度的生物樣品檢測(cè)體系?；谖㈥嚵行酒?共振光散射法比傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)法具有更高的靈敏度和更好的穩(wěn)定性（S c anome tr i c DNA Array Detection with Nanoparticle Probes.Science,2000,289,1757-1760 ； Nanoparticle-Based Bio -Bar Codes for the Ultrasensitive Detection of Proteins. Science，2003, 301，1884-1886.)。目前，一種金納米粒子標(biāo)記物通常只能針對(duì)一種生物分 子進(jìn)行檢測(cè)，因此，制備一種可以同時(shí)對(duì)多種待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)的金納米粒子標(biāo)記物對(duì)簡(jiǎn)化 微陣列生物芯片的檢測(cè)方法具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種DNA微陣列芯片檢測(cè)與II型糖尿病相關(guān)的 單核苷酸多態(tài)性的方法，該方法利用6條寡核苷酸修飾的金納米粒子作為標(biāo)記物，及篩選 出6條用于II型糖尿病檢測(cè)的寡核苷酸探針研制了一種可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)與II型糖尿病 相關(guān)突變位點(diǎn)的微陣列芯片檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)模擬II型糖尿病的DNA樣品和II型糖尿病 的實(shí)際樣品的檢測(cè)。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：
[0007] -種DNA微陣列芯片檢測(cè)與II型糖尿病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括以下 步驟：
[0008] (1)合成6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物；
[0009] (2)篩選出用于II型糖尿病6個(gè)突變位點(diǎn)檢測(cè)的6條特定寡核苷酸探針；
[0010] (3)利用標(biāo)準(zhǔn)制作方法將所述特定寡核苷酸探針點(diǎn)樣液點(diǎn)樣到芯片上制備得到 DNA微陣列芯片；
[0011] (4)用所述的DNA微陣列芯片對(duì)模擬II型糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)和II型糖尿病實(shí) 際樣品進(jìn)行檢測(cè)，再用6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)記。
[0012] 在上述技術(shù)方案中，步驟（1)的具體步驟如下：
[0013] 6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物的合成：將6條100 μ M巰基修飾的寡核苷 酸以 SP1: SP2: SP3: SP4: SP5: SP6 = I. 2:1. 2: 0· 6:1:1. 6:1. 6 的比例混合；取 5 μ 1 該寡核苷酸 混合溶液與300 μ I 8ηΜ的金納米粒子混合均勻，室溫靜置反應(yīng)10h，再加入等體積的PBS緩 沖溶液，混合均勻后反應(yīng)過(guò)夜；將反應(yīng)后的溶液真空離心濃縮至100 μ 1，通過(guò)離心提純反 應(yīng)產(chǎn)物，獲得6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物；
[0014] 其中所述寡核苷酸序列分別為：
[0015] SP1 ： (T10) CTCTCTTACATA, SP2 ： (T10) ATTTAAACCTTC,
[0016] SP3 ： (T10) TTCCTGGTTTCA, SP4 ： (T10) ACTTGATGCAAT,
[0017] SP5 : (Tltl) ATAGACTTACTG，SP6 : (Tltl) GGCAATTAAATT。
[0018] 在上述技術(shù)方案中，所述6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物的平均粒徑為 13nm〇
[0019] 在上述技術(shù)方案中，步驟⑵中所述的6個(gè)突變位點(diǎn)分別為：rslll96205， rslll96218, rs6585205, rsl0946398, rsl0811661, rs7903146 ；
[0020] 所述的6條特定寡核苷酸探針序列分別為：
[0021] P1 ：CTGCTCGTAGTTATAA (T10)-NH2,
[0022] P1A : CTGCTGGTAGTTATAA (Tici) -NH2，
[0023] P2 : TCGGGTGCTTATGAAA (Tltl) -NH2，
[0024] P2A : TCGGGTGTTTATGAAA (T10) -NH2，
[0025] P3 : TCTAAGTCGTGGGGCA (Tici) -NH2，
[0026] P3A : TCTAAGTAGTGGGGCA (Tici) -NH2，
[0027] P4 :GACAGCATAACGATAC (T10) -NH2，
[0028] p4A ： gacagcagaacgatac(t10) -nh2,
[0029] P5 : TCATGAGAAAACTAAA (T10) -NH2，
[0030] p5A ： tcatgggaaaactaaa(t10) -nh2,
[0031] P6 ：ATATAGTATCTAAAAA (T10)-NH2,
[0032] P6A :ATATAATATCTAAAAA (T10) -NH2。
[0033] 在上述技術(shù)方案中，步驟（3)中所述特定寡核苷酸探針點(diǎn)樣液的點(diǎn)樣濃度為 30 μ M0
[0034] 在上述技術(shù)方案中，步驟（4)中所述的模擬II型糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)的濃度為 500nM，所述的6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物的濃度為3nM。
[0035] 在上述技術(shù)方案中，步驟（4)中用所述的DNA微陣列芯片對(duì)模擬II型糖尿病的寡 核苷酸靶標(biāo)和II型糖尿病實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)、及再用6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記 物對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)記的反應(yīng)溫度均為30°C。
[0036] 在上述技術(shù)方案中，步驟（4)中所述的模擬II型糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)序列分別 為：
[0037] T1 ： TTATAACTACGAGCAGTATGTAAGAGAG,
[0038] Tia : TTATAACTACCAGCAGTATGTAAGAGAG,
[0039] T2 ： TTTCATAAGCACCCGAGAAGGTTTAAAT,
[0040] T2A:TTTCATAAACACCCGAGAAGGTTTAAAT,
[0041] T3：TGCCCCACGACTTAGATGAAACCAGGAA,
[0042] T3A ： TGCCCCACTACTTAGATGAAACCAGGAA,
[0043] T4：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT,
[0044] T4A ： GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT,
[0045] T5 ： TTTAGTTTTCCCATGACAGTAAGTCTAT,
[0046] T5A ： TTTAGTTTTCTCATGACAGTAAGTCTAT,
[0047] T6 ： TTTTTAGATACTATATAATTTAATTGCC,
[0048] T6A :TTTTTAGATATTATATAATTTAATTGCC。
[0049] 在上述技術(shù)方案中，步驟（4)中所述：
[0050] 用所述的DNA微陣列芯片對(duì)模擬II型糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所述模 擬II型糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)?\、T 2、T3、T4、T5、T6、T 1A、T2A、T3A、T4A、T5a和T 6a的濃度分別為： 0· 005、0· 01、0· 05、0· 1、0· 5、1、5、10、50、100、500 和 ΙΟΟΟηΜ，寡核苷酸探針 PpPpPyPpPp P6、P1A、P2A、P3A、P 4A、P5A 和 P6A 的點(diǎn)樣濃度均為 30 μ M ;
[0051] 用所述DNA微陣列芯片對(duì)II型糖尿病實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，實(shí)際樣品的濃度分別 為：0· 5、1、5 和 ΙΟηΜ，寡核苷酸探針 P2、P3、P4、P5、P6、P 1A、P2A、P3A、P4A、P5a 和 P6a 的點(diǎn)樣濃 度均為30 μ Μ。
[0052] 在上述技術(shù)方案中，在步驟（4)之后還包括如下步驟：
[0053] 將所述DNA微陣列芯片與ImL銀增強(qiáng)溶液反應(yīng)8min ;
[0054] 所述銀增強(qiáng)溶液為硝酸銀溶液與氫醌溶液的混合溶液，硝酸銀溶液與氫醌溶液的 體積比為1:1。
[0055] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0056] (1)本發(fā)明提供的方法是以6條寡核苷酸修飾的金納米粒子作為標(biāo)記物結(jié)合篩選 出來(lái)的探針制作DNA微陣列芯片，對(duì)模擬樣品和實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)（模擬樣品和實(shí)際樣品 即為寡核苷酸靶標(biāo)）。應(yīng)用本方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)與II型糖尿病相關(guān)的模擬DNA樣品和實(shí)際樣品 的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
[0057] (2)本發(fā)明用于合成多條寡核苷酸修飾的金納米粒子的方法，具有簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，快 速的特點(diǎn)。使用該方法合成的6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物可以同時(shí)對(duì)多個(gè)與II 型糖尿病相關(guān)的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。
[0058] (3)本發(fā)明的方法篩選出多個(gè)能用于II型糖尿病檢測(cè)的特定寡核苷酸探針，通過(guò) 對(duì)單核苷酸多態(tài)性和等位基因頻率的分析證明，這些特定寡核苷酸探針對(duì)靶標(biāo)寡核苷酸檢 測(cè)具有高特異性。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0059] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0060] 圖1為本發(fā)明提供的方法的過(guò)程示意圖。
[0061] 圖2用本發(fā)明的方法合成的6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物與未修飾的金 納米粒子的對(duì)比圖；
[0062] 其中圖2a為未修飾的金納米粒子的電鏡圖和溶液照片；圖2b為用本發(fā)明的方法 合成的6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物的電鏡圖和溶液照片。
[0063] 圖3用本發(fā)明的方法對(duì)模擬II型糖尿病6個(gè)易感基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0064] 圖4用本發(fā)明的方法對(duì)模擬II型糖尿病6個(gè)易感基因突變位點(diǎn)的等位基因頻率檢 測(cè)結(jié)果及對(duì)應(yīng)的掃描圖。
[0065] 圖5用本發(fā)明的方法對(duì)15例II型糖尿病實(shí)際樣品的風(fēng)險(xiǎn)基因檢測(cè)結(jié)果以及相對(duì) 應(yīng)的掃描圖。

【具體實(shí)施方式】
[0066] 一種DNA微陣列芯片檢測(cè)與II型糖尿病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的方法，具體包括 以下步驟：
[0067] (1)合成6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物
[0068] 將六條ΙΟΟμΜ巰基修飾的寡核苷酸以SP1:SP2:SP 3:SP4:SP5:SP6 = 1. 2:1. 2:0. 6:1:1. 6:1. 6的比例混合。取5 μ 1該混合物與300 μ 18nM的金納米粒子混合 均勻（按摩爾吸光系數(shù)為4. 2 X IO8Cm^T1計(jì)算），室溫靜置反應(yīng)10h，加入等體積的PBS緩 沖溶液（IOmM ΡΒ，0. 2M NaCl，pH 7. 5)，混合均勻后反應(yīng)過(guò)夜。將上述溶液真空離心濃縮至 10(^1，通過(guò)離心（13000印111，（9000印111，3\))提純反應(yīng)產(chǎn)物，獲得6條寡核苷酸修飾的金 納米粒子標(biāo)記物。將純化后的產(chǎn)物溶解在探針?lè)磻?yīng)緩沖溶液（〇. 67XSSC，0. 1% (w/v)SDS) 中，在4°C下保存。所述6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物的平均粒徑為13nm。
[0069] 其中所述寡核苷酸序列分別為：
[0070] SP1 ： (T10) CTCTCTTACATA, SP2 ： (T10) ATTTAAACCTTC,
[0071] SP3 ： (T10) TTCCTGGTTTCA, SP4 ： (T10) ACTTGATGCAAT,
[0072] SP5 : (Tltl) ATAGACTTACTG，SP6 : (Tltl) GGCAATTAAATT。
[0073] 圖2a為未修飾的金納米粒子的電鏡圖和溶液照片；圖2b為用本發(fā)明的方法合成 的6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物的電鏡圖和溶液照片。通過(guò)對(duì)比說(shuō)明我們已經(jīng)將 6條寡核苷酸修飾到了金納米粒子表面。
[0074] (2)篩選出用于II型糖尿病6個(gè)突變位點(diǎn)檢測(cè)的6條特定寡核苷酸探針；
[0075] 所述的 6 個(gè)突變位點(diǎn)分別為：rslll96205, rslll96218, rs6585205, rsl0946398， rsl0811661, rs7903146 ；
[0076] 所述的6條特定寡核苷酸探針序列分別為：
[0077] P1 ：CTGCTCGTAGTTATAA (T10)-NH2,
[0078] P1A : CTGCTGGTAGTTATAA (Tici) -NH2，
[0079] P2 : TCGGGTGCTTATGAAA (Tltl) -NH2，
[0080] P2A : TCGGGTGTTTATGAAA (T10) -NH2，
[0081] P3 ：TCTAAGTCGTGGGGCA (T10)-NH2,
[0082] P3A : TCTAAGTAGTGGGGCA (Tici) -NH2，
[0083] P4 ：GACAGCATAACGATAC (T10)-NH2,
[0084] P4A :GACAGCAGAACGATAC (T10) -NH2，
[0085] P5 : TCATGAGAAAACTAAA (T10) -NH2，
[0086] P5A : TCATGGGAAAACTAAA (T10) -NH2，
[0087] P6 ：ATATAGTATCTAAAAA (T10)-NH2,
[0088] P6A :ATATAATATCTAAAAA (T10) -NH2。
[0089] (3)利用標(biāo)準(zhǔn)制作方法將所述特定寡核苷酸探針點(diǎn)樣液點(diǎn)樣到芯片上制備得到 DNA微陣列芯片；
[0090] 將特定寡核苷酸探針溶于3XSSC，1.5M甜菜堿，0.005% (w/v)SDS的點(diǎn)樣液中。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制作方法使用博奧SmartArrayer 136微陣列芯片接觸式針點(diǎn)系統(tǒng)在三維高分子 D基片上點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量約為InL/點(diǎn)，點(diǎn)樣濃度為30 μ M。將得到DNA微陣列芯片放入反應(yīng)盒 中于37 °C，75 %相對(duì)濕度恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。
[0091] (4)用所述的DNA微陣列芯片對(duì)模擬II型糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)（也稱(chēng)為模擬II 型糖尿病DNA樣品）和II型糖尿病實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，再使用6條寡核苷酸修飾的金納米 粒子標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)記；
[0092] 在制作好的DNA微陣列芯片的每個(gè)子陣列中先加入25 μ 1待測(cè)樣品反應(yīng)lh，再加 入3nM的6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物反應(yīng)lh，反應(yīng)溫度均為30°C，清洗并離心 甩干。
[0093] 所述模擬II型糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)序列分別為：
[0094] T1 ： TTATAACTACGAGCAGTATGTAAGAGAG,
[0095] Tia : TTATAACTACCAGCAGTATGTAAGAGAG,
[0096] T2 ： TTTCATAAGCACCCGAGAAGGTTTAAAT,
[0097] T2A: TTTCATAAACACCCGAGAAGGTTTAAAT,
[0098] T3：TGCCCCACGACTTAGATGAAACCAGGAA,
[0099] T3A ： TGCCCCACTACTTAGATGAAACCAGGAA,
[0100] T4：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT,
[0101] T4A ： GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT,
[0102] T5：TTTAGTTTTCCCATGACAGTAAGTCTAT,
[0103] T5A ： TTTAGTTTTCTCATGACAGTAAGTCTAT,
[0104] T6：TTTTTAGATACTATATAATTTAATTGCC,
[0105] T6A : TTTTTAGATATTATATAATTTAATTGCC。
[0106] 用所述的DNA微陣列芯片對(duì)模擬II型糖尿病DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所述模擬II型 糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)?\、T 2、T3、T4、T5、T6、T 1A、T2A、T3A、T4A、T5a和T 6a的濃度分別為：0. 005、 0· 01、0· 05、0· 1、0· 5、1、5、10、50、100、500 和 100011]\1，寡核苷酸探針？1、？2、？3、？4、？ 5、？6、？14、 Ρ2Α、Ρ3Α、Ρ4Α、P5A和P6A的點(diǎn)樣濃度均為30 μ M ;
[0107] 用所述DNA微陣列芯片對(duì)II型糖尿病實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，實(shí)際樣品的濃度分別 為：0· 5、1、5 和 ΙΟηΜ，寡核苷酸探針 P2、P3、P4、P5、P6、P 1A、P2A、P3A、P4A、P5a 和 P6a 的點(diǎn)樣濃 度均為30 μ Μ。
[0108] 為了進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，還可以將步驟（4)所述的DNA微陣列芯片與ImL銀 增強(qiáng)溶液反應(yīng)8min ;根據(jù)金納米粒子的共振光散射原理對(duì)DNA微陣列芯片進(jìn)行檢測(cè)。
[0109] 所述銀增強(qiáng)溶液為硝酸銀溶液與氫醌溶液的混合溶液，硝酸銀溶液與氫醌溶液的 體積比為1:1。
[0110] 實(shí)施例1 :模擬II型糖尿病DNA樣品的檢測(cè)
[0111] 結(jié)合圖1，圖3,圖4和表1說(shuō)明本實(shí)施例。
[0112] 應(yīng)用美國(guó)斯坦福大學(xué)布朗實(shí)驗(yàn)室所制定的標(biāo)準(zhǔn)方法，將固定濃度（30 μ mol/L)的 寡核苷酸探針（P1-P6)點(diǎn)樣在基片上制備DNA微陣列芯片。通過(guò)使用PBS (PH = 7.4, 50mmol/ L磷酸緩沖液+0. 15mol/L氯化鈉）和0. lmol/L乙醇胺封閉芯片。并依次與寡核苷酸靶標(biāo) T1J2J3J4J5J 6JiaJ2aJ3aJ4aJ 5a 和 T6a 的濃度分別為：0· 005nM，0· OlnM, 0· 05nM，0· InM, 0· 5ηΜ，ΙηΜ，5ηΜ，ΙΟηΜ，50ηΜ，ΙΟΟηΜ，500nM 和 IOOOnM 的混合物，Tia-T6a 在混合物中所占的百 分比分別為：〇,〇. 2,0. 5,1，2, 5,10, 20, 50, 70,90和100%，及3nM寡核苷酸修飾的金納米粒 子（SPnOGNPs)，30°C各反應(yīng)Ih。再進(jìn)一步與ImL銀增強(qiáng)溶液反應(yīng)8分鐘后使用共振光散射 微陣列生物芯片掃描儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0113] 圖3用本實(shí)施例的方法對(duì)模擬II型糖尿病6個(gè)易感基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。如 圖3所示，利用這個(gè)方法獲得的DNA微陣列芯片可以對(duì)6個(gè)與II型糖尿病相關(guān)的易感基因 位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。篩選出的6個(gè)位點(diǎn)的寡核苷酸探針對(duì)寡核苷酸靶標(biāo)檢測(cè)具有高特異性。圖 4為利用本實(shí)施例的方法對(duì)模擬II型糖尿病6個(gè)易感基因突變位點(diǎn)的等位基因頻率檢測(cè)結(jié) 果及對(duì)應(yīng)的掃描圖。圖中（a)-(f)分別對(duì)應(yīng)1-6個(gè)易感基因突變位點(diǎn)。如圖4所示，利用 這一方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)低至0. 2%的等位基因頻率。
[0114] 表1為本發(fā)明方法對(duì)II型糖尿病易感基因突變位點(diǎn)的定量檢測(cè)結(jié)果，如表1所示， 利用這一方法可以對(duì)檢測(cè)模擬II型糖尿病易感基因突變位點(diǎn)的檢出限可低至〇. 〇〇5nM。
[0115] 實(shí)施例2 : II型糖尿病的實(shí)際樣品檢測(cè)
[0116] 結(jié)合圖1，圖5和表1說(shuō)明本實(shí)施例。
[0117] 收集15例II型糖尿病患者的血液，針對(duì)rsl0811661位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。應(yīng)用美 國(guó)斯坦福大學(xué)布朗實(shí)驗(yàn)室所制定的標(biāo)準(zhǔn)方法，將固定濃度（30 μ mol/L)的寡核苷酸探針 (Pn)點(diǎn)樣在基片上制備DNA微陣列芯片。通過(guò)使用PBS (PH = 7. 4, 50mmol/L磷酸緩沖液 +0· 15mol/L氯化鈉）和0· lmol/L乙醇胺封閉芯片。并依次與不同濃度（0· 5ηΜ，1ηΜ，5ηΜ和 IOnM)的II型糖尿病患者血液的PCR產(chǎn)物，及3nM寡核苷酸修飾的金納米粒子（SPnOGNPs)， 30°C各反應(yīng)lh。再進(jìn)一步與ImL銀增強(qiáng)溶液反應(yīng)8分鐘后使用共振光散射微陣列生物芯片 掃描儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0118] 圖5為利用本實(shí)施例方法對(duì)15例II型糖尿病患者rsl0811661位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)基因進(jìn) 行檢測(cè)的結(jié)果。如圖5所示，15例患者中有11例患者的rsl0811661位點(diǎn)為T(mén)/C雜合基因 型，2例患者為C/C純合基因型，2例患者為T(mén)/T純合基因型。
[0119] 表1為利用本發(fā)明方法對(duì)II型糖尿病易感基因突變位點(diǎn)的定量檢測(cè)結(jié)果，如表I 所示，利用該方法對(duì)II型糖尿病實(shí)際樣品的的檢出限可以低至〇. 5nM。
[0120] 表1. 11型糖尿病易感基因突變位點(diǎn)的定量檢測(cè)結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種DNA微陣列芯片檢測(cè)與II型糖尿病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 合成6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物； (2) 篩選出用于II型糖尿病6個(gè)突變位點(diǎn)檢測(cè)的6條特定寡核苷酸探針； (3) 利用標(biāo)準(zhǔn)制作方法將所述特定寡核苷酸探針點(diǎn)樣液點(diǎn)樣到芯片上制備得到DNA微 陣列芯片； (4) 用所述的DNA微陣列芯片對(duì)模擬II型糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)和II型糖尿病實(shí)際樣 品進(jìn)行檢測(cè)，再用6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)記。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)的具體步驟如下： 6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物的合成：將6條100 y M巰基修飾的寡核苷酸以 SPi: SP2: SP3: SP4: SP5: SP6 = 1. 2:1. 2: 0? 6:1:1. 6:1. 6 的比例混合；取 5 ill 該寡核苷酸混合 溶液與300 yl 8nM的金納米粒子混合均勻，室溫靜置反應(yīng)10h，再加入等體積的PBS緩沖溶 液，混合均勻后反應(yīng)過(guò)夜；將反應(yīng)后的溶液真空離心濃縮至100 U 1，通過(guò)離心提純反應(yīng)產(chǎn) 物，獲得6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物； 其中所述寡核苷酸序列分別為： SPi ： (T10)CTCTCTTACATA, SP2 ： (T10) ATTTAAACCTTC, SP3 ： (T10)TTCCTGGTTTCA, SP4 ： (T10) ACTTGATGCAAT, SP5 : (T1(I)ATAGACTTACTG，SP6 : (T1(I)GGCAAITAAAIT。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記 物的平均粒徑為13nm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)中所述的6個(gè)突變位點(diǎn)分別為： rslll96205,rslll96218, rs6585205, rsl0946398, rsl0811661, rs7903146 ； 所述的6條特定寡核苷酸探針序列分別為： p: ：ctgctcgtagttataa(t10)-nh2, P1A ：CTGCTGGTAGTTATAA(T10) -NH2, P2 ：TCGGGTGCTTATGAAA(T10)-NH2, p2A :tcgggtgtttatgaaa(t10)-nh2， p3 ：tctaagtcgtggggca(t10)-nh2, p3A :tctaagtagtggggca(t10)-nh2, p4 ：gacagcataacgatac(t10)-nh2, p4A :gacagcagaacgatac(t10)-nh2， p5 ：tcatgagaaaactaaa(t10)-nh2, p5A :tcatgggaaaactaaa(t10)-nh2， p6 ：atatagtatctaaaaa(t10)-nh2, p6A :atataatatctaaaaa(t10)-nh2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)中所述特定寡核苷酸探針點(diǎn)樣液 的點(diǎn)樣濃度為30iiM。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4)中所述的模擬II型糖尿病的寡核 苷酸靶標(biāo)的濃度為500nM，所述的6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標(biāo)記物的濃度為3nM。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4)中用所述的DNA微陣列芯片對(duì)模 擬II型糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)和II型糖尿病實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)、及再用6條寡核苷酸修飾 的金納米粒子標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)記的反應(yīng)溫度均為30°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4)中所述的模擬II型糖尿病的寡核 苷酸靶標(biāo)序列分別為： T: ： TTATAACTACGAGCAGTATGTAAGAGAG, T1A:TTATAACTACCAGCAGTATGTAAGAGAG, T2 ： TTTCATAAGCACCCGAGAAGGTTTAAAT, T2A:TTTCATAAACACCCGAGAAGGTTTAAAT, T3 ： TGCCCCACGACTTAGATGAAACCAGGAA, T3A ： TGCCCCACTACTTAGATGAAACCAGGAA, T4 ： GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT, T4A：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT, T5 ： TTTAGTTTTCCCATGACAGTAAGTCTAT, T5A ： TTTAGTTTTCTCATGACAGTAAGTCTAT, T6 ： TTTTTAGATACTATATAATTTAATTGCC, T6A : TTTTTAGATATTATATAATTTAATTGCC。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑷中所述： 用所述的DNA微陣列芯片對(duì)模擬II型糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所述模擬II 型糖尿病的寡核苷酸靶標(biāo)1'1、1'2、1'3、1'4、1' 5、1'6、1^、1^、1^、1^、1^和1^的濃度分別為：0.005、 0? 01、0. 05、0. 1、0. 5、1、5、10、50、100、500 和 10001^，寡核苷酸探針？1、？2、？3、？4、？ 5、？6、卩14、 P2A、P3A、P4A、P5A和P6A的點(diǎn)樣濃度均為30 y M ; 用所述DNA微陣列芯片對(duì)II型糖尿病實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，實(shí)際樣品的濃度分別為： 0? 5、1、5 和 10nM，寡核苷酸探針 Pi、P2、P3、P4、P5、P6、P 1A、P2A、P3A、P4A、P5A 和 P6A 的點(diǎn)樣濃度均 為 30 u M。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（4)之后還包括如下步驟： 將所述DNA微陣列芯片與lmL銀增強(qiáng)溶液反應(yīng)8min ; 所述銀增強(qiáng)溶液為硝酸銀溶液與氫醌溶液的混合溶液，硝酸銀溶液與氫醌溶液的體積 比為1:1。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104388555SQ201410628972
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】王振新, 李桃, 邢雪峰, 鄔東陽(yáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所