利用tale轉(zhuǎn)錄抑制子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中模塊化構(gòu)建合成基因線路的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及利用TALE轉(zhuǎn)錄抑制子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中模塊化構(gòu)建合成基因線路。
【背景技術(shù)】
[0002] 合成的基因線路經(jīng)過(guò)精屯、設(shè)計(jì)，依據(jù)功能將基因調(diào)控裝置組裝起來(lái)，感受、整合、 處理細(xì)胞內(nèi)的分子信息，行使一定的功能。各種合成基因線路已發(fā)展在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)可定制、 可編程的功能，包括動(dòng)態(tài)行為、開(kāi)關(guān)和記憶、細(xì)胞間通訊、適應(yīng)性、細(xì)胞極化、數(shù)字和模擬計(jì) 算和復(fù)雜的生物合成途徑。該些基因線路中大多數(shù)是通過(guò)使用有限的基因元件和昂貴、低 效的"嘗試-錯(cuò)誤"的方法構(gòu)建。因此，為了簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)和優(yōu)化對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行復(fù)雜的操作， 研發(fā)出一個(gè)大規(guī)模的、功能定義良好的合成基因元件庫(kù)和相應(yīng)的計(jì)算模型和模擬方法是很 有必要的。
[0003] 在針對(duì)哺乳動(dòng)物的合成生物學(xué)研究領(lǐng)域，工程化的合成轉(zhuǎn)錄激活子和抑制子是 支持可擴(kuò)展的基因線路設(shè)計(jì)的一個(gè)重要的目標(biāo)。目前，構(gòu)建哺乳動(dòng)物/真核生物轉(zhuǎn)錄抑 制子常用的策略是融合一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域和一個(gè)工程化的DNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，比如 鋒指蛋白、轉(zhuǎn)錄激活子類似因子（TAL巧蛋白和失活的Cas9(dCas9)核酸酶在RNA引導(dǎo)的 CRISPR(簇狀周期性間隔短回文重復(fù)序列）系統(tǒng)。然而，轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域，如Kr化pel相關(guān) 盒化RAB)轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域和mSin相互作用結(jié)構(gòu)域（SID4)通常會(huì)導(dǎo)致祀啟動(dòng)子附近的表 觀遺傳學(xué)修飾，因而響應(yīng)時(shí)間很慢。因此，該種轉(zhuǎn)錄抑制不適用于構(gòu)建響應(yīng)快速、可逆的基 因線路。
[0004] 另一種普遍存在于原核生物中的轉(zhuǎn)錄抑制模式是通過(guò)無(wú)功能結(jié)構(gòu)域的空間位阻， 而該在真核生物中并不常見(jiàn)，例如，Lac抑制子（LacI)和四環(huán)素抑制子（TetR)通過(guò)低聚化 結(jié)合在啟動(dòng)子附近的特異DNA序列，使DNA形成一個(gè)環(huán)，從而阻止轉(zhuǎn)錄起始核屯、元件在啟動(dòng) 子區(qū)域的結(jié)合）。已有研究表明，在哺乳動(dòng)物基因調(diào)控的環(huán)境下，在合成基因線路中把LacI 結(jié)合位點(diǎn)放置在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子（CMV)或者CAG啟動(dòng)子下游，可W抑制基因表達(dá)，雖然抑 制效率在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中低于原核表達(dá)系統(tǒng)。類似的，在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中祀as9蛋白 不融合任何轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域也表現(xiàn)出弱的轉(zhuǎn)錄抑制功能。
[0005] TALER蛋白由若干個(gè)特異性識(shí)別DNA的串聯(lián)"蛋白模塊"和兩側(cè)的N-末端及C-末 端序列組成。每個(gè)"蛋白模塊"包含33-35個(gè)氨基酸殘基，第12、13位氨基酸殘基是祀向識(shí) 別的關(guān)鍵位點(diǎn)，被稱作重復(fù)可變的雙連氨基酸殘基（RVDs)位點(diǎn)。TALER蛋白上的每個(gè)RVD 僅能識(shí)別一個(gè)堿基。TALEN("Transcription Activator-Uke Effector Nuclease)是一種 人工改造的限制性內(nèi)切酶，是將TAL邸蛋白（作為DM結(jié)合域）與限制性內(nèi)切酶化k I (作 為DNA切割域，又稱抑制結(jié)構(gòu)域）融合而得到的TALEN融合蛋白。TALEN在細(xì)胞中與基因組 的祀位點(diǎn)結(jié)合，形成二聚體發(fā)揮內(nèi)切酶活性，導(dǎo)致左右TALEN的spacer區(qū)域發(fā)生雙鏈DNA 斷裂值SB，Double-Strand化eaks)，從而誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞可W通過(guò)非同源性 末端接合機(jī)制（N肥J, Non-homologous化d化ining)修復(fù)DNA。畑EJ修復(fù)機(jī)制并不精確， 極易發(fā)生錯(cuò)誤（缺失/插入），從而造成移碼突變，因此可w達(dá)到基因敲除的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供利用TALE轉(zhuǎn)錄抑制子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中模塊化構(gòu)建合成基 因線路。
[0007] 本發(fā)明保護(hù)的第一種實(shí)現(xiàn)兩種蛋白可調(diào)控式表達(dá)的試劑盒，為如下（a)或化）；
[000引 （a)包括表達(dá)盒甲-I、表達(dá)盒己-I和表達(dá)盒丙的試劑盒；
[0009] 化）包括具有所述表達(dá)盒甲-I的重組載體甲-I、具有所述表達(dá)盒己-I的重組 載體己-I和具有所述表達(dá)盒丙的重組載體丙的試劑盒；
[0010] 所述表達(dá)盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件；反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子甲、通過(guò)自剪切多膚的編碼基因連接的蛋白甲的編碼基因和TALER蛋白甲的編碼基因、 祀序列甲-I ;所述祀序列甲-I包括1個(gè)W上（具體可為4個(gè)）shRNAl的祀序列；
[0011] 所述表達(dá)盒己-I自上游至下游依次包括如下元件；反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子己、通過(guò)自剪切多膚的編碼基因連接的蛋白己的編碼基因和TALm?蛋白己的編碼基因、 祀序列己-I ;所述祀序列己-I包括1個(gè)W上（具體可為4個(gè)）shRNA2的祀序列；
[0012] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALm?蛋 白己的祀點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子甲的上游不具有所述TALm?蛋白己的祀點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白己的祀點(diǎn)；
[0013] 所述表達(dá)盒己-I中，所述啟動(dòng)子己的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALm?蛋 白甲的祀點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子己的上游不具有所述TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白甲的祀點(diǎn)；
[0014] 所述表達(dá)盒丙自上游至下游依次包括組成型啟動(dòng)子和激活元件的編碼序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反饋元件的編碼序列的下游的DNA表達(dá)。
[0015] 將具有所述表達(dá)盒甲-I的重組載體甲-I、具有所述表達(dá)盒己-I的重組載體 己-I和具有所述表達(dá)盒丙的重組載體丙導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通過(guò)加入shRNAl或shRNA2調(diào)控 所述蛋白甲的表達(dá)和所述蛋白己的表達(dá)。
[0016] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游具有1個(gè)所述TALm?蛋白己的祀點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白己的祀點(diǎn)；
[0017] 所述表達(dá)盒己-I中，所述啟動(dòng)子己的上游具有1個(gè)所述TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白甲的祀點(diǎn)。
[0018] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲上游的TAL邸蛋白己的祀點(diǎn)與所述啟動(dòng)子甲 下游最鄰近的TALm?蛋白己的祀點(diǎn)之間的距離為72-lOObp ;
[0019] 所述表達(dá)盒己-I中，所述啟動(dòng)子己上游的TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)與所述啟動(dòng)子己 下游最鄰近的TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)之間的距離為72-lOObp。
[0020] 本發(fā)明保護(hù)的第二種實(shí)現(xiàn)兩種蛋白可調(diào)控式表達(dá)的試劑盒，為如下（a)或化）；
[002U (a)包括表達(dá)盒甲-I、表達(dá)盒己-I和表達(dá)盒丙的試劑盒；
[0022] 化）包括具有所述表達(dá)盒甲-I的重組載體甲-I、具有所述表達(dá)盒己-I的重組 載體己-I和具有所述表達(dá)盒丙的重組載體丙的試劑盒；
[0023] 所述表達(dá)盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件；反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子甲、通過(guò)自剪切多膚的編碼基因連接的蛋白甲的編碼基因和TALER蛋白甲的編碼基因、 祀序列甲-I ;所述祀序列甲-I包括shRNAl-1的祀序列、……、shRNAl-n的祀序列，n為 2W上的自然數(shù)；
[0024] 所述表達(dá)盒己-I自上游至下游依次包括如下元件；反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子己、通過(guò)自剪切多膚的編碼基因連接的蛋白己的編碼基因和TALm?蛋白己的編碼基因、 祀序列己-I ;所述祀序列己-I包括shRNA2-l的祀序列、……、shRNA2-n的祀序列，n為 2W上的自然數(shù)；
[0025] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TAL邸蛋 白己的祀點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子甲的上游不具有所述TALm?蛋白己的祀點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白己的祀點(diǎn)；
[0026] 所述表達(dá)盒己-I中，所述啟動(dòng)子己的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TAL邸蛋 白甲的祀點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子己的上游不具有所述TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白甲的祀點(diǎn)；
[0027] 所述表達(dá)盒丙自上游至下游依次包括組成型啟動(dòng)子和激活元件的編碼序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反饋元件的編碼序列的下游的DNA表達(dá)。
[002引將具有所述表達(dá)盒甲-I的重組載體甲-I、具有所述表達(dá)盒己-I的重組載 體己-I和具有所述表達(dá)盒丙的重組載體丙導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通過(guò)加入shRNAl-1、……、 shRNAl-n、shRNA2-l、......或shRNA2-n調(diào)控所述蛋白甲的表達(dá)和所述蛋白己的表達(dá)。
[0029] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游具有1個(gè)所述TAL邸蛋白己的祀點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白己的祀點(diǎn)；
[0030] 所述表達(dá)盒己-I中，所述啟動(dòng)子己的上游具有1個(gè)所述TAL邸蛋白甲的祀點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白甲的祀點(diǎn)。
[0031] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲上游的TALm?蛋白己的祀點(diǎn)與所述啟動(dòng)子甲 下游最鄰近的TALm?蛋白己的祀點(diǎn)之間的距離為72-lOObp ;
[0032] 所述表達(dá)盒己-I中，所述啟動(dòng)子己上游的TALER蛋白甲的祀點(diǎn)與所述啟動(dòng)子己 下游最鄰近的TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)之間的距離為72-lOObp。
[0033] 本發(fā)明保護(hù)的第S種實(shí)現(xiàn)兩種蛋白可調(diào)控式表達(dá)的試劑盒，為如下（a)或化）；
[0034] (a)包括表達(dá)盒甲-I、表達(dá)盒己-I、表達(dá)盒丙和表達(dá)盒了 - I的試劑盒；
[0035] 化）包括具有所述表達(dá)盒甲-I的重組載體甲-I、具有所述表達(dá)盒己-I的重組 載體己-I、具有所述表達(dá)盒丙的重組載體丙和具有所述表達(dá)盒了- I的重組載體了- I 的試劑盒；
[0036] 所述表達(dá)盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件；反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子甲、通過(guò)自剪切多膚的編碼基因連接的蛋白甲的編碼基因和TALER蛋白甲的編碼基因、 祀序列甲-I ;所述祀序列甲-I包括shRNAl-1的祀序列、……、shRNAl-n的祀序列，n為 2W上的自然數(shù)；
[0037] 所述表達(dá)盒己-I自上游至下游依次包括如下元件；反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子己、通過(guò)自剪切多膚的編碼基因連接的蛋白己的編碼基因和TALm?蛋白己的編碼基因、 祀序列己-I ;所述祀序列己-I包括shRNA2-l的祀序列、……、shRNA2-n的祀序列，n為 2W上的自然數(shù)；
[003引所述表達(dá)盒了 - I自上游至下游依次包括如下元件；反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子了、通過(guò)自剪切多膚的編碼基因連接的蛋白己的編碼基因和TALm?蛋白己的編碼基因、 祀序列了；所述祀序列了 - I包括shRNA3-l的祀序列、……、shRNA3-n的祀序列，n為2 W 上的自然數(shù)；
[0039] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TAL邸蛋 白己的祀點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子甲的上游不具有所述TALm?蛋白己的祀點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白己的祀點(diǎn)；
[0040] 所述表達(dá)盒己-I中，所述啟動(dòng)子己的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALm?蛋 白甲的祀點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子己的上游不具有所述TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白甲的祀點(diǎn)；
[0041] 所述表達(dá)盒了 - I中，所述啟動(dòng)子了的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALm?蛋 白甲的祀點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子了的上游不具有所述TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白甲的祀點(diǎn)；
[0042] 所述表達(dá)盒丙自上游至下游依次包括組成型啟動(dòng)子和激活元件的編碼序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反饋元件的編碼序列的下游的DNA表達(dá)。
[0043] 將具有所述表達(dá)盒甲-I的重組載體甲-I、具有所述表達(dá)盒己-I的重組載體 己-I、具有所述表達(dá)盒丙的重組載體丙和具有所述表達(dá)盒了- I的重組載體了- I導(dǎo)入 宿主細(xì)胞，通過(guò)加入 shRNAl-1、......、shRNAl-n、shRNA2-l、......、shRNA2-n、shRNA3-l、...... 或shRNA3-n調(diào)控所述蛋白甲的表達(dá)和所述蛋白己的表達(dá)。
[0044] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游具有1個(gè)所述TALm?蛋白己的祀點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALm?蛋白己的祀點(diǎn)；
[0045] 所述表達(dá)盒己-I中，所述啟動(dòng)子己的上游具有1個(gè)所述TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白甲的祀點(diǎn)；
[0046] 所述表達(dá)盒了 - I中，所述啟動(dòng)子了的上游具有1個(gè)所述TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白甲的祀點(diǎn)。
[0047] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲上游的TAL邸蛋白己的祀點(diǎn)與所述啟動(dòng)子甲 下游最鄰近的TALER蛋白己的祀點(diǎn)之間的距離為72-lOObp ;
[0048] 所述表達(dá)盒己-I中，所述啟動(dòng)子己上游的TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)與所述啟動(dòng)子己 下游最鄰近的TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)之間的距離為72-lOObp ;
[0049] 所述表達(dá)盒了 - I中，所述啟動(dòng)子了上游的TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)與所述啟動(dòng)子了 下游最鄰近的TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)之間的距離為72-lOObp。
[0050] 本發(fā)明保護(hù)的第一種從混合細(xì)胞中分選細(xì)胞甲和/或細(xì)胞己的試劑盒，為如下 姑或化）；
[0化1] (a)包括表達(dá)盒甲-II、表達(dá)盒己-II和表達(dá)盒丙的試劑盒；
[0052] 化）包括具有所述表達(dá)盒甲-II的重組載體甲-II、具有所述表達(dá)盒己-II的重組 載體己-II和具有所述表達(dá)盒丙的重組載體丙的試劑盒；
[0化3] 所述表達(dá)盒甲-II自上游至下游依次包括如下元件；反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子甲、通過(guò)自剪切多膚的編碼基因連接的巧光蛋白甲的編碼基因和TALER蛋白甲的編碼基 因、祀序列甲-II ;所述祀序列甲-II包括1個(gè)W上（具體可為4個(gè)）miRNAl的祀序列；
[0化4] 所述表達(dá)盒己-II自上游至下游依次包括如下元件；反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子己、通過(guò)自剪切多膚的編碼基因連接的巧光蛋白己的編碼基因和TALm?蛋白己的編碼基 因、祀序列己-II ;所述祀序列己-II包括1個(gè)W上（具體可為4個(gè)）miRNA2的祀序列； [0化5] 所述表達(dá)盒甲-II中，所述啟動(dòng)子甲的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALm?蛋 白己的祀點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子甲的上游不具有所述TALm?蛋白己的祀點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白己的祀點(diǎn)；
[0化6] 所述表達(dá)盒己-II中，所述啟動(dòng)子己的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALm?蛋 白甲的祀點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子己的上游不具有所述TALm?蛋白甲的祀點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白甲的祀點(diǎn)；
[0化7] 所述表達(dá)盒丙自上游至下游依次包括組成型啟動(dòng)子和激活元件的編碼序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反饋元件的編碼序列的下游的DNA表達(dá)；
[0化引所述miRNAl為所述細(xì)胞甲具有的特定miR