一種釀酒酵母基因表達(dá)系統(tǒng)及其構(gòu)建與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是設(shè)及一種整合型釀酒酵母基因表達(dá)系統(tǒng)及 其構(gòu)建方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著基因組學(xué)日新月異地發(fā)展，人們迫切尋求合適的表達(dá)系統(tǒng)用于新型基因的挖 掘和新型工程細(xì)胞的構(gòu)建，為此，各種不同的表達(dá)體系應(yīng)運(yùn)而生，如細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、酵母、 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。近年來W釀酒酵母為代表的酵母表達(dá)系統(tǒng)W其獨(dú)特生物學(xué)特 性，已成為代謝工程改造生產(chǎn)生物基產(chǎn)品、有效表達(dá)新型外源基因，服務(wù)于基礎(chǔ)研究、工業(yè) 和醫(yī)藥應(yīng)用的重要工具。釀酒酵母是迄今為止伴隨人類生產(chǎn)、生活最長，和人類關(guān)系最密切 的一種酵母。不僅可用于釀酒、面包和慢頭制作等，是最具生物安全性的微生物，還可用于 酒精、酶、氨基酸等工業(yè)生產(chǎn)，是現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中重要的真核模式菌株。
[0003] 由于釀酒酵母在工業(yè)生產(chǎn)中具有良好的發(fā)酵性能，在發(fā)酵過程中能夠快速繁殖、 對雜菌污染具有較強(qiáng)抗性，使其在基因工程技術(shù)中常被用于代謝工程改造的出發(fā)菌株。通 過基因表達(dá)和基因敲除等手段的運(yùn)用，所構(gòu)建的釀酒酵母代謝工程菌常被用于大宗化學(xué)產(chǎn) 品的生產(chǎn)，如燃料己醇、了醇、大宗化學(xué)品乳酸、高附加值產(chǎn)品木糖醇、有機(jī)酸類W及微生物 菌體蛋白等多種生物基產(chǎn)品，同時由于其較好的生物安全性，使其在醫(yī)藥、食品行業(yè)也具有 廣泛的應(yīng)用。
[0004] 然而，良好的模式菌株，除自身具有的優(yōu)良特色外，還需要可適用的載體工具 的有效支持，用W充分挖掘相關(guān)菌株優(yōu)良信息，因此，目前發(fā)展了多種類型的表達(dá)載 體。其中，附加型質(zhì)粒是應(yīng)用于釀酒酵母的常規(guī)質(zhì)粒，W釀酒酵母自身2y復(fù)制子序列 作為能夠在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的調(diào)控序列。附加型質(zhì)粒具有較高的轉(zhuǎn)化效率和拷貝數(shù)， 但是在非選擇壓力條件下不穩(wěn)定，傳代易丟失（Malissard M，Zeng S，Berger E.化e yeast expression system for recombinant glycosyltransferases. Glycocon Jugate Journal, 1999, 16 (2) : 125-139)，因此附加型質(zhì)粒難臥有效進(jìn)行外源基因的穩(wěn)定表達(dá)，無法 適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)的要求。
[0005] 因此，為了提高質(zhì)粒系統(tǒng)在釀酒酵母中穩(wěn)定傳代與表達(dá)，需采用整合的方式將質(zhì) 粒有效整合于釀酒酵母的基因組中，在細(xì)胞繁殖過程中使其復(fù)制能夠同基因組的復(fù)制同時 進(jìn)行。同時，也需要兼顧基因的拷貝數(shù)情況來選擇合適的整合位點(diǎn)。早期的整合型質(zhì)粒的 整合位點(diǎn)多為營養(yǎng)標(biāo)記基因，在基因組中的拷貝數(shù)較少，導(dǎo)致整合的質(zhì)?？截悢?shù)也較少，使 得蛋白表達(dá)量低，無法滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。
[0006] rDNA序列在酵母基因組中有100-200個拷貝單元，是整合型質(zhì)粒在釀酒酵母基因 組中優(yōu)良的整合位點(diǎn)。因此可選擇W該序列為基礎(chǔ)構(gòu)建在釀酒酵母中適用的整合型表達(dá)載 體，從而實(shí)現(xiàn)所構(gòu)建的質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中W-定拷貝數(shù)穩(wěn)定存在并表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請人提供了一種應(yīng)用于釀酒酵母的表達(dá)系 統(tǒng)。本發(fā)明的表達(dá)載體可實(shí)現(xiàn)在釀酒酵母中的整合型穩(wěn)定表達(dá)，對釀酒酵母的基礎(chǔ)理論研 究及產(chǎn)品開發(fā)具有重要的意義。
[000引本發(fā)明的技術(shù)方案如下；
[0009] 本發(fā)明一方面設(shè)及一種釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)，包括一種新型表達(dá)載體，其為 環(huán)狀，從5' -3'依次可操作性地連接有W下元件：
[0010] pMD19-Tsimple質(zhì)粒骨架、rDNA同源重組序列、外源基因表達(dá)盒和篩選標(biāo)記基因 表達(dá)盒；
[0011] 所述外源基因表達(dá)盒自上游至下游依次包括啟動子、外源基因插入酶切位點(diǎn)W及 轉(zhuǎn)錄終止子；
[0012] 所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒包括啟動子、抗生素抗性基因、轉(zhuǎn)錄終止子。
[0013] 所述酵母為釀酒酵母。
[0014] 所述的表達(dá)載體中的外源基因表達(dá)盒啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子的DNA序列來自 Spathaspora passalidarum，該酵母全基因組序列在 NCBI (ht1:p://www. ncbi. nlm. nih. gov/)中的編號為NZ_AEIK00000000,其中所述酵母可為來自美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中屯、 的細(xì)胞株NRRL Y-27907。
[00巧]優(yōu)選的，所述的rDNA同源重組序列為18s rDNA,序列如SEQ ID NO: 1所示。另一個 選擇是，所述的rDNA序列與SEQ ID N0:1的相似性不低于90%，優(yōu)選為95%，更優(yōu)為98%。
[0016] 所述rDNA同源重組序列為18s rDNA序列。
[0017] 所述外源基因表達(dá)盒中的啟動子包括SpADHp、SpXYLp;轉(zhuǎn)錄終止子包括SpCYCl T、 SpX化T。
[0018] 所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒中的啟動子包括SpTEFlp;抗生素抗性基因可W是表達(dá) 載體中常用的，包括潮霉素抗性基因、博來霉素抗性基因、G418 ;轉(zhuǎn)錄終止子包括SpCYCIt、 ScCYCIt。
[0019] 所述的18s rDNA序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0020] 所述的SpADHp啟動子為Spathaspora passalidarum來源的己醇脫氨酶基因ADHl 啟動子，該啟動子的DM序列如SEQ ID NO: 2所示；
[0021] 所述的SpXYLp啟動子為Spathaspora passalidarum來源的木糖還原酶基因XYL 啟動子，該啟動子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
[0022] 所述的SpTEFlp啟動子為Spathaspora passalidarum來源的轉(zhuǎn)錄起始因子基因 TEF1啟動子，該啟動子的DNA序列如SEQ ID N0:4所示；
[002引 所述的SpCYCli終止子為Spathaspora passal idarum來源的細(xì)胞色素C基因CYC1 終止子，該終止子的DNA序列如SEQ ID NO: 5所示；
[0024] 所述的SpXYLi終止子為Spathaspora passalidarum來源的木糖還原酶基因XYL 終止子，該終止子的DM序列如SEQ ID NO:6所示。
[0025] 所述的ScCYCIt終止子為Saccharomyces cerevisiae來源的細(xì)胞色素C基因CYCl 終止子，該終止子的DM序列如SEQ ID NO: 7所示。
[0026] 所述外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和篩選標(biāo)記基因，所述外源基因插 入所述外源基因表達(dá)盒中啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子之間。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述外源 基因?yàn)榧镻基因，該基因的DM序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0027] 所述的篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒中可包括一個W上的標(biāo)記基因，所述標(biāo)記基因可為潮 霉素B抗性基因、博來霉素抗性基因和/或G418;在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)記基 因是潮霉素B抗性基因。
[002引所述的潮霉素B抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
[0029] 所述的博來霉素抗性基因的DM序列如SEQ ID NO:9所示。
[0030] 所述的G418的DNA序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0031] 本發(fā)明所使用的宿主酵母為釀酒酵母。具體的，該釀酒酵母為a型單倍體菌株 Saccharomyces cerevisiae ANGA1。所述 Saccharomyces cerevisiae ANGA1 的制備方法 為；郭忠鵬.代謝工程改善工業(yè)酒精酵母發(fā)酵性能巧]:[博±學(xué)位論文].無錫：江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，2011，第二章內(nèi)容所述。
[0032] 具體而言，發(fā)明人按照下述技術(shù)方案制備得到了新型表達(dá)載體：
[0033] W Spathaspora passalidarum 基因組 DNA 為模板，W引物 P1 和 P2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 獲得18s rDNA同源重組序列；W引物P5和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得SpTEFlp啟動子；W引物 P7和P8進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得SpA畑Ip啟動子；W引物P9和P10進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得SpXYL P啟 動子；W引物P11和P12進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得SpCYCli終止子；W引物P13和P14進(jìn)行PCR擴(kuò) 增獲得SpXYLt終止子。W PRS303H質(zhì)粒DNA為模板，W引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得片 段hph-ScCYClT。所述引物P1-P2的核巧酸序列如SEQ ID NO. 13-14所示，所述P5-P14的 核巧酸序列如SEQ ID N017-26所示。
[0034] W PMD19-Tsimple為骨架，將上述各片段連接，所述連接是在適當(dāng)?shù)南拗泼该盖?位點(diǎn)上進(jìn)行的。具體連接方式為；在pMD19-Tsimple的EcoR V酶切位點(diǎn)連接18s rDNA后，沿 著18s rDNA的方向依次連接外源基因表達(dá)盒啟動子、外源基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄終止子、SpTEFlp 啟動子、h地-ScCYCIt。
[0035] 酵母基因表達(dá)調(diào)控是一個非常復(fù)雜的過程，選擇合適的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子對外 源蛋白的表達(dá)至關(guān)重要。本發(fā)明提供了可供外源蛋白表達(dá)的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子組合， 包括 SpADHp-SpCYCli、SpXYLp-SpCYClT、SpADHp-SpXYLi、SpXYLp-SpXYLi、SpTEFl廣SpCYClj、、 SpX 化廣 SpXYLj。
[0036] 所述啟動子根據(jù)W下方法預(yù)測獲得：
[0037] (1)根據(jù)Spathaspora passalidarum基因組序列，選擇酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟 動子所屬基因與上一個基因的開放閱讀框之間的所有核巧酸片段；
[003引 （2)采用啟動子在線測評軟件，對可能的啟動子序列進(jìn)行在線預(yù)測；
[0039] (3)根據(jù)高評分值的潛在啟動子序列，設(shè)計引物擴(kuò)增獲得待測啟動子序列。
[0040] 所述終止子根據(jù)W下方法獲得：
[004U (1