專利名稱：哺乳動(dòng)物生理細(xì)胞的檢驗(yàn)方法
本案是1989年10月20日提交的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)89107981.5的分案申請(qǐng)。
一般地講，本發(fā)明涉及凍干生物學(xué)材料的技術(shù)，更具體地講涉及凍干哺乳動(dòng)物細(xì)胞以制備可儲(chǔ)存的人體細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞系、組織細(xì)胞以及用于免疫檢測(cè)及其它血液學(xué)分析之對(duì)照細(xì)胞的新方法，所有這些凍干細(xì)胞均具有良好的穩(wěn)定性和長(zhǎng)儲(chǔ)存壽命，而且與新鮮細(xì)胞相比，其基本上具有等同的生理學(xué)參數(shù)。
凍干儲(chǔ)存含有生物學(xué)活性分子的脂質(zhì)體及細(xì)菌培養(yǎng)物的方法是已知的。用凍干方法制作藥物片劑也是已知的。美國(guó)專利4678812公開(kāi)了一種使用海藻糖化賦形劑和穩(wěn)定劑制備診斷用藥片的方法。美國(guó)專利4712310則描述了一種制備在診斷檢測(cè)中用作試劑和穩(wěn)定劑制備診斷用藥片的方法。美國(guó)專利4712310則描述了一種制備在診斷檢測(cè)中用作試劑載體的片劑的方法。
現(xiàn)有專利已描述過(guò)在脂質(zhì)體內(nèi)包裹藥物、核酸、蛋白質(zhì)、指示分子(reporter molecules)、酶等材料的方法。這類專利有如美國(guó)專利4515736和4411894。美國(guó)專利3261761、4206200和4246349則介紹了凍干細(xì)菌的方法。1988年3月16日公開(kāi)的歐州專利申請(qǐng)0259739涉及同一研究領(lǐng)域，其題目為“改善凍干培養(yǎng)物的穩(wěn)定性”。
同類現(xiàn)有技術(shù)提到糖在凍干應(yīng)用中具有穩(wěn)定功能。上面提到的海藻糖也具有這種功能。1986年7月17日公開(kāi)的國(guó)際專利申請(qǐng)(PCT)WO86/03938號(hào)中公開(kāi)了在冷凍干燥期間使用海藻糖在脂質(zhì)體內(nèi)和脂質(zhì)體外(溶液中)作為保護(hù)劑的方法。在脂質(zhì)體內(nèi)或脂質(zhì)體外使用海藻糖是已引起注意的優(yōu)選方法。
已述及的現(xiàn)有技術(shù)均未涉及保存哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是人體細(xì)胞。人細(xì)胞如血液細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)不同于細(xì)菌或脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)。就細(xì)菌來(lái)說(shuō)，其細(xì)胞壁是很厚的非脂質(zhì)壁，其作用在于保護(hù)細(xì)胞的液體內(nèi)容物免受熱、滲透壓改變及在無(wú)保護(hù)劑(如糖)存在時(shí)進(jìn)行冷凍干燥所引起的不利影響。因?yàn)橛泻軋?jiān)實(shí)的細(xì)胞壁，所以許多細(xì)菌菌株都能在沒(méi)有某一種儲(chǔ)存保護(hù)劑或被包裹的情況下耐受冷凍和干燥的沖擊。
就脂質(zhì)體來(lái)說(shuō)，其液體內(nèi)容物被單層或多層脂質(zhì)囊泡包圍。囊泡的壁是由一種或多種有極性頭部和非極性尾部之脂質(zhì)成分的一層生物分子形成的。在水溶液中，排成一層的極性頭部朝向周圍介質(zhì)，而脂質(zhì)分子的非極性部分則彼此相互聯(lián)接，從而在囊泡的壁中形成了一個(gè)極性表面和一種非極性核心。單層脂質(zhì)體只有一層生物分子，而多層脂質(zhì)體一般有許多基本上同軸心的生物分子層。因此，當(dāng)將含有或不含類固醇的磷脂混合物于水溶液中分散時(shí)，即可形成一圓形的微球結(jié)構(gòu)。可以想象用其包裹某種試劑，就能在體內(nèi)以識(shí)別的方式運(yùn)送到某一部位。
脂質(zhì)體囊壁是與人細(xì)胞差不多的人造雙脂質(zhì)膜，不過(guò)人細(xì)胞膜的組成要復(fù)雜得多。除了雙脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)外，人細(xì)胞膜還有許多嵌入其脂質(zhì)雙層內(nèi)的額外的蛋白和糖蛋白分子。特別令人感興趣的是這些蛋白質(zhì)分子提供了人造脂質(zhì)體所沒(méi)有的細(xì)胞表面抗原或決定基位點(diǎn)。人細(xì)胞表面標(biāo)志的研究是進(jìn)行免疫檢測(cè)及它與人血液細(xì)胞有關(guān)之血液學(xué)檢測(cè)的關(guān)鍵課題。在使用雜交瘤細(xì)胞系和單克隆抗體時(shí)，顯然脂質(zhì)體也存在同樣差異。另外，還應(yīng)考慮到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)雜液體內(nèi)容物與脂質(zhì)體內(nèi)容物之間的差異。在人血細(xì)胞的例子中，細(xì)胞只能存在于等滲透壓液體介質(zhì)中，而脂質(zhì)體則可能存在于任何介質(zhì)，包括非等滲溶液內(nèi)。
本發(fā)明的凍干方法是獨(dú)特的，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞可在沒(méi)有對(duì)細(xì)胞形態(tài)造成不利改變的情況下被冷干，而且當(dāng)用于檢測(cè)試驗(yàn)，如用作對(duì)照細(xì)胞時(shí)在與探針或標(biāo)志物結(jié)合后不會(huì)使細(xì)胞膜成為可通透的。另外，所說(shuō)的凍干可以穩(wěn)定細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其在細(xì)胞壁內(nèi)的定向性質(zhì)，這樣便不會(huì)使膜表面蛋白標(biāo)志受到破壞?？紤]到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜的已知的脆弱特性，相信用本發(fā)明凍干方法所獲得的結(jié)果是出乎預(yù)料的，就凍干的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定性和儲(chǔ)存壽命來(lái)說(shuō)也是令人意想不到的，而且在其重新水化之后所保留的生理學(xué)功能特性可與新鮮細(xì)胞相比擬。
在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，作為保藏或保護(hù)性被膜包裹，只能是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的外表面上。包裹細(xì)胞膜的內(nèi)表面則是不可能作到的。所能達(dá)到的極好穩(wěn)定性及長(zhǎng)儲(chǔ)存壽命，使得本發(fā)明的方法有不能應(yīng)用于制備進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)的對(duì)照細(xì)胞、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)分析、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、按大小分類及分析血細(xì)胞成分的亞群(如紅細(xì)胞和白細(xì)胞)，以及各種類型細(xì)胞的DNA分析中提供適用的樣品制劑。因此，各種類型的細(xì)胞均可凍干并在其后重新水化成為適于進(jìn)行生物學(xué)細(xì)胞分析的樣品。
Stefi Weisburd在“脫水并不造成死亡”(Death Defying Dehydration)一文(Science News，Vol.133，No.7，pp.97-112，F(xiàn)ebruary 13，1988)中描述了使用國(guó)際專利申請(qǐng)(PCT)WO86/03938號(hào)中所述的海藻糖冷凍干燥脂質(zhì)體的方法。該文獻(xiàn)所述的研究工作是用微生物進(jìn)行的，其表明海藻糖(一種低分子量糖)是在這些微生物中當(dāng)它們脫水后以高濃度產(chǎn)生的。一般認(rèn)為海藻糖可起脂質(zhì)穩(wěn)定劑的作用，用以增加人造細(xì)胞膜或脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。該文獻(xiàn)提請(qǐng)注意海藻糖并不是在所有情況下都是有用的添加物，并且應(yīng)該注意海藻糖的毒理學(xué)。
必須有精確而可靠的對(duì)照物以便在檢測(cè)對(duì)照和樣品的同時(shí)能了解準(zhǔn)備樣品的合適技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)設(shè)備的功能，這種要求是持續(xù)的。在流式細(xì)胞計(jì)分析中，除用于構(gòu)成流式細(xì)胞計(jì)工作參數(shù)的熒光素小珠或微球外，并沒(méi)有可利用的確定對(duì)照組。最適合需要的對(duì)照物質(zhì)應(yīng)是可作為所用試劑及適當(dāng)儀器功能有關(guān)的樣品準(zhǔn)備技術(shù)對(duì)照者。因此，在進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)分析時(shí)，保存的表達(dá)必要抗原決定基或決定簇的哺乳動(dòng)物細(xì)胞與試驗(yàn)樣品的細(xì)胞一起檢測(cè)，將提供一種最適對(duì)照物?？蓪⑾惹皽y(cè)定的對(duì)照細(xì)胞的數(shù)值與研究人員測(cè)得的試驗(yàn)結(jié)果相比較。
對(duì)所有有表面抗原的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)分析的特點(diǎn)需要建立一種制備對(duì)照細(xì)胞的方法，以便維持細(xì)胞的光散射圖型和膜的完整性，使被研究的細(xì)胞表面抗原的損傷降至最小程度。最好應(yīng)是使用具有待研究之已知性質(zhì)的新鮮細(xì)胞的基礎(chǔ)上比較這些因素。然而，從商品供應(yīng)角度看，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中運(yùn)送和儲(chǔ)存新鮮對(duì)照細(xì)胞是不切實(shí)際的。
為此，使用凍干等方法保存的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可便于運(yùn)送，能夠儲(chǔ)存足夠長(zhǎng)的時(shí)間，并能在使用時(shí)重新恢復(fù)凍干前狀態(tài)或重新水化，同時(shí)保留其必要的特性，這樣即可為進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)分析提供合乎需要的對(duì)照。
這種凍干的哺乳動(dòng)物對(duì)照細(xì)胞也應(yīng)適于使用血液學(xué)分析裝置，如Coulter Electronics公司(Hialeah，F(xiàn)lorida;為Coulter公司的子公司)出售的COULTER COUNTER
血細(xì)胞。
申請(qǐng)人確信由于幾方面的原因而一直沒(méi)有成功地凍干用作對(duì)照物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。例如，冷凍條件會(huì)對(duì)這些細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生有害影響，并可破壞所有膜的完整性。
它使用各種糖類結(jié)合DMSO或甘油進(jìn)行了抵削細(xì)胞內(nèi)冷凍之不利影響的實(shí)驗(yàn)工作。另外還作了在凍干過(guò)程單獨(dú)使用糖的實(shí)驗(yàn)，其中在對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行冷凍和凍干時(shí)將糖加至凍干載體溶液，如標(biāo)準(zhǔn)的正常羊血清中。試驗(yàn)了含有或不含DMSO、磷酸鹽緩沖的白蛋白(PBA)、胎牛血清，人AB型血清及正常羊血清的糖的各種濃度的溶液。
使用蔗糖、?；撬岷推咸烟?，以及DMSO與糖作為載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果均不能令人滿意。例如當(dāng)使用果糖時(shí)，相對(duì)于新鮮細(xì)胞之某些抗原的特異性熒光的減少，超過(guò)允許范圍的光散射及特異的熒光特性等情況都會(huì)出現(xiàn)。使用這些糖處理細(xì)胞仍不能得到令人滿意的凍干細(xì)胞，即不能制得冷凍期間免受明顯損傷的細(xì)胞。所說(shuō)的損傷可表現(xiàn)于細(xì)胞膜蛋白分子水平的改變，如能影響抗原表達(dá)的構(gòu)象改變。一般須使用低溫保護(hù)劑(cryoprotectorants)來(lái)防止細(xì)胞冷凍期間因增加了鹽濃度和結(jié)晶形成所造成的這類損傷。但申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)這些冷凍保護(hù)劑，如DMSO和甘油以及其它血清，均不能成功地用于凍干哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
冷凍和凍干期間，加入正常羊血清作為懸浮細(xì)胞的基質(zhì)或載體并不能有效地保護(hù)細(xì)胞表面標(biāo)志的活性，即血清中的蛋白質(zhì)并不能使細(xì)胞膜免遭氧化作用或其它破壞。只使用海藻糖與正常羊血清及白蛋白的混合物也不能成功地解決上述問(wèn)題。
此后，又使用海藻糖作為與正常羊血清和白蛋白之混合物的一部分，也未能制得適用的凍干對(duì)照細(xì)胞的介質(zhì)。從而證明在凍干期間使用糖，包括海藻糖穩(wěn)定膜細(xì)胞的膜脂質(zhì)是不成功的。
本發(fā)明的方法已被證明可成功地制得適用的凍干哺乳動(dòng)物細(xì)胞，該方法包括在等滲溶液中利用海藻糖制備冷凍和凍干的細(xì)胞。用本發(fā)明方法制得的凍干的對(duì)照細(xì)胞包括雜交瘤細(xì)胞或細(xì)胞系以及保留了便于流式細(xì)胞計(jì)分析之最適特性的外周血單核細(xì)胞。還確定了等滲溶液中海藻糖(其為最適用于本發(fā)明之方法的糖)的最佳濃度。本發(fā)明包括凍干的哺乳動(dòng)物細(xì)胞及其他能用上述凍干方法制備的人體細(xì)胞。
本發(fā)明的方法可用于制備在免疫學(xué)檢測(cè)、流式細(xì)胞計(jì)分析及顯微鏡檢驗(yàn)中用作生物學(xué)對(duì)照的凍干的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并用于保藏可保留其所需抗原性的人細(xì)胞系。凍干的細(xì)胞在使用時(shí)可重新恢復(fù)其含水狀態(tài)或重新水化，同時(shí)使其細(xì)胞膜蛋白構(gòu)象或形態(tài)學(xué)不受損傷或有害影響。據(jù)信本發(fā)明的方法能夠凍干哺乳動(dòng)物生理體液和組織中的所有細(xì)胞?？墒褂媚承?biāo)準(zhǔn)的制備方法，如由待檢測(cè)的全血、培養(yǎng)的細(xì)胞系或組織中收集欲進(jìn)一步處理的所需數(shù)目的細(xì)胞，用于一般的檢測(cè)過(guò)程并經(jīng)離心使之成為細(xì)胞團(tuán)塊。首先，將該細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于磷酸鹽緩沖的白蛋白中達(dá)一定時(shí)間，然后再重新使之成為細(xì)胞團(tuán)塊形式。凍干前，將細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于含特定最適濃度之海藻糖的等滲溶液中，并于室溫下保溫一定時(shí)間。室溫下用含一定比例海藻糖的等滲溶液重復(fù)處理該細(xì)胞懸液一定時(shí)間，然后將細(xì)胞懸液置于小瓶?jī)?nèi)，冷凍并凍干一定時(shí)間。
可用其量等于小瓶全容積的蒸餾水使如此制得的凍干細(xì)胞重新恢復(fù)其含水狀態(tài)，該小瓶是特制用于原位水化冷凍細(xì)胞的。重新恢復(fù)其含水狀態(tài)的細(xì)胞保留了它們用作分析對(duì)照的最適生理學(xué)特性。


圖1A和1B分別是用TII-FITC和MsIgGI-FITC標(biāo)記染色的按本發(fā)明凍干之T細(xì)胞系及與之完全相同的新鮮細(xì)胞系的流式細(xì)胞計(jì)直方圖。
圖2A和2B分別是用B1-FITC和MsIgGZa-FITC標(biāo)記染色的按本發(fā)明方法凍干的B細(xì)胞系及與之完全相同的新鮮B細(xì)胞系的流式細(xì)胞計(jì)直方圖。
圖3是以四個(gè)編號(hào)的方框顯示的復(fù)合流式細(xì)胞計(jì)直方圖，其中比較了用TII和B1單克隆體雙染色的新鮮外周血淋巴細(xì)胞及凍干的外周血淋巴細(xì)胞。
圖4是以四個(gè)編號(hào)的方框顯示的復(fù)合流式細(xì)胞計(jì)直方圖，其中比較了用T4和T8單克隆抗體雙染色的新鮮及凍干的外周血淋巴細(xì)胞。
圖5是圖解說(shuō)明本發(fā)明制備凍干之對(duì)照細(xì)胞、細(xì)胞系及外周血淋巴細(xì)胞的方法。
使用某些術(shù)語(yǔ)來(lái)解釋圖1至4中各直方圖所顯示的比較試驗(yàn)的結(jié)果。本文使用的這些術(shù)語(yǔ)定義如下1.“本底熒光”是指由樣品中并非從被研究的特異性熒光標(biāo)記細(xì)胞，而是從任何其它的材料發(fā)出的熒光。
2.“自身熒光”是本底熒光的一種，其中由細(xì)胞發(fā)出的熒光不是由熒光化學(xué)物質(zhì)如染料誘導(dǎo)的。
3.“非特異性結(jié)合”是指熒光化學(xué)物質(zhì)附著于細(xì)胞表面的現(xiàn)象不是借助特異結(jié)合方式產(chǎn)生的。
4.“光散射”是指入射光束如由激光光源發(fā)出的光束對(duì)著細(xì)胞照射時(shí)發(fā)生在流式細(xì)胞計(jì)儀器內(nèi)的現(xiàn)象，此時(shí)有些光束向許多不同方向反射，有的光束則穿過(guò)細(xì)胞。對(duì)散射的光，包括及由復(fù)蓋于細(xì)胞外的熒光化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生的熒光及其反射角度均可被測(cè)定，并用以確定細(xì)胞的特征，如細(xì)胞大小或體積，細(xì)胞表面光滑度，以及細(xì)胞漿質(zhì)中的顆粒的數(shù)目和其他結(jié)構(gòu)。這些特征可以與正常細(xì)胞的特征相比較。
5.“平均頻道(Mean Channel [MC])”是指對(duì)被分析的細(xì)胞發(fā)出的平均相對(duì)熒光量。
6.“百分陽(yáng)性率”是指其熒光高于本底的被分析細(xì)胞的百分比。
用于完成本發(fā)明之凍干方法的成分如下A.磷酸鹽緩沖的白蛋白溶液(PBA)，為1g PBA溶于100ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)內(nèi)。
B.海藻糖溶液，10g海藻糖溶于100ml等滲溶液。最好使用Coulter Electronics公司注冊(cè)商標(biāo)為ISOTONⅢ的等滲溶液，其特點(diǎn)是絕對(duì)純。
C.“FITC”，即熒光素異硫氰酸鹽。
D.“RDI”，即Coulter公司使用的藻膽蛋白熒光素標(biāo)記物。
下面參照?qǐng)D5全面地描述實(shí)施本發(fā)明方法的方法學(xué)。首先由全血或培養(yǎng)的細(xì)胞系，或組織中收集作為待檢測(cè)細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。對(duì)于一次一般的檢測(cè)工作，收集30×106個(gè)細(xì)胞并懸浮于4-8℃的1%PBS溶液中。室溫下將懸浮的細(xì)胞以1500rpm離心約10分鐘。棄去上清，將細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于在等滲液(如ISOTON
)中制得的10%海藻糖溶液中，并于室溫下保溫10分鐘，或最好于2-8℃保溫10分鐘。然后于4-8℃以1500rpm離心10分鐘。再將所得細(xì)胞沉淀團(tuán)塊重新懸浮于用ISOTON 制備的10%海藻糖(如4-8℃)中。將海藻糖處理的細(xì)胞懸浮置于每瓶含300μl溶液的凍干小瓶?jī)?nèi)，小瓶擰上蓋并于4℃冷卻，然后振蕩小瓶使細(xì)胞散布均勻，再于-70℃冷凍機(jī)中至少放置1小時(shí)。到時(shí)間后將小瓶立即放入凍干機(jī)內(nèi)約凍干15小時(shí)。
到時(shí)間后由凍干機(jī)內(nèi)取出凍干的小瓶并保存于2-8℃下。為了使凍干品重新恢復(fù)含水狀態(tài)，向小瓶?jī)?nèi)加入蒸餾水或去離子水，使其體積達(dá)到300μl。作為流式細(xì)胞光度計(jì)分析中的對(duì)照細(xì)胞，將重新懸浮的細(xì)胞染色，然后按標(biāo)準(zhǔn)的流式細(xì)胞計(jì)分析法分析。當(dāng)然，這些對(duì)照細(xì)胞也可用于其他類型的檢測(cè)法或其他適當(dāng)?shù)脑\斷試驗(yàn)。
下面將參考附圖1至4的流式細(xì)胞計(jì)直方圖對(duì)本發(fā)明的凍干方法作更詳細(xì)的討論，以從中了解按本發(fā)明方法制得的凍干細(xì)胞的實(shí)用有效性圖1A和1B的流式細(xì)胞計(jì)直方圖中，對(duì)同種新鮮的和凍干的T細(xì)胞系(定名為PB 44細(xì)胞)進(jìn)行染色并使用Coulter公司(Hialeah，F(xiàn)lorida)出售的EPICS 流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行比較。隔兩周分別制備兩份PB 44 T細(xì)胞并按本發(fā)明的方法凍干。使用去離子水使細(xì)胞重新恢復(fù)含水狀態(tài)或水化，并用Coulter公司出售、注冊(cè)商標(biāo)為COULTER CLONE 的帶色的單克隆抗體MsIgGI-FITC和帶色的單克隆抗體TII-TITC著染細(xì)胞表面標(biāo)記。所使用的免疫熒光細(xì)胞表面染色方法詳見(jiàn)Coulter公司分發(fā)的“Coulter Proceduces Book”一書(shū)第4頁(yè)。染色后，在EPICS
流式細(xì)胞計(jì)中分析這些重新恢復(fù)含水狀態(tài)的凍干細(xì)胞，以測(cè)定百分陽(yáng)性率及各抗體之平均頻道熒光的相對(duì)量。在進(jìn)行檢測(cè)分析的同一天制得新鮮培養(yǎng)的PB 44 T細(xì)胞，并用相似方法進(jìn)行分析，以與分析染色的凍干細(xì)胞所得結(jié)果相比較。直方圖所示的結(jié)果如下PB 44 T細(xì)胞新鮮細(xì)胞 凍干細(xì)胞MC %陽(yáng)性率 MC %陽(yáng)性率TII-TITC 84 99 92 100MsIgGI-TI -- 0 16 5對(duì)凍干T細(xì)胞的百分反應(yīng)活性等于被分析的新鮮T細(xì)胞的百分反應(yīng)活性。各例中平均細(xì)胞熒光也基本上相等，84與92的少許差異并不足以影響檢測(cè)結(jié)果。由圖1A和圖1B的直方圖可以看出，用新鮮T細(xì)胞和凍干T細(xì)胞測(cè)得的結(jié)果十分相似。很顯然，本發(fā)明的凍干方法具有許多應(yīng)歸功于本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。
還使用一系列COULTER CLONE
單克隆抗體，在EPICS
流式細(xì)胞計(jì)上對(duì)PB44細(xì)胞系的新鮮和凍干T細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的檢測(cè)。其中制備染色細(xì)胞的方法同前所述。進(jìn)一步的檢測(cè)的結(jié)果如下
PB 44 T 細(xì)胞分析結(jié)果Coulter clone
新鮮PB 44 凍干PB 44抗體實(shí)驗(yàn) MC
百分陽(yáng)性率 MC 百分陽(yáng)性率序號(hào)IgG1-FITC 1 10 0 19 13(同型對(duì)照) 2 12 0 16 5IgG1-RD1 1 3 0 4 1(同型對(duì)照) 2 6 0 5 0TII-FITC 1 84 100 86 992 103 100 108 99T8-FITC 1 86 97 96 982 113 100 116 100T4-FITC 1 40 71 50 842 69 93 67 954B4-FITC 1 40 79 51 922 75 100 70 99TII-RD1 1 98 100 77 952 120 100 105 100T8-RD1 1 110 91 109 982 141 100 126 99對(duì)于試驗(yàn)各種抗體來(lái)說(shuō)，對(duì)凍干PB 44細(xì)胞的百分反應(yīng)活性基本上等于新鮮細(xì)胞的百分反應(yīng)活性。另外，用于度量染色細(xì)胞之相對(duì)熒光強(qiáng)度的平均頻道值在凍干和新鮮細(xì)胞也大致相似。用IgG1-FITC同型對(duì)照染色證明，在某些情況下凍干細(xì)胞確實(shí)顯現(xiàn)出較大程度的非特異性熒光。但這部分熒光因其強(qiáng)度不大，故不會(huì)影響對(duì)檢測(cè)結(jié)果的解釋。
圖2A和2B所示的流式細(xì)胞計(jì)直方圖中，使用B1-FITC染色并在EPICS
流式細(xì)胞計(jì)中比較了定名為PB 11的同種新鮮和凍干的B細(xì)胞系。按本發(fā)明的方法凍干相隔兩周分別制備的兩份PB 11B細(xì)胞。用去離子水使細(xì)胞重新水化，并用Coulter公司商標(biāo)為“COULTER CLONE”的B1-FITC和B4-FITC細(xì)胞標(biāo)記染色。染色方法與圖1A和1B所述者相同。染色后在EPICS
儀器中分析水化的凍干細(xì)胞，以測(cè)定對(duì)各種抗體的百分陽(yáng)性率及平均頻道熒光相對(duì)量。在進(jìn)行上述檢測(cè)時(shí)也對(duì)同一天由培養(yǎng)瓶中得到的新鮮PB 11 B細(xì)胞作了相似的檢測(cè)和分析。對(duì)B1-FITC和B4-FITC染色之新鮮和凍干細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果如下所示PB 11 B 細(xì)胞新鮮細(xì)胞 凍干細(xì)胞MC %陽(yáng)性率 MC %陽(yáng)性率B1-FITC 82 99 118 100B4-FITC 92 100 69 9970 99 71 99凍干B細(xì)胞的百分反應(yīng)活性和平均頻道熒光與新鮮細(xì)胞相當(dāng)。在同型對(duì)照中，凍干細(xì)胞出現(xiàn)了較大程度的非特異性熒光，但這是由于該細(xì)胞系在不同時(shí)間出現(xiàn)的非特異性本底染色造成的。這一程度的非特異性熒光，因其強(qiáng)度很低，故不會(huì)影響分析結(jié)果。
圖3是以分別標(biāo)明為1)、2)、3)和4)的四個(gè)方框顯示的復(fù)合流式細(xì)胞計(jì)直方圖，使用雙色TII和B1 COULTER CLONE 單克隆抗體對(duì)新鮮外周血淋巴細(xì)胞(PBLS)和凍干的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行比較。用Ficoll-Hypaque 標(biāo)準(zhǔn)方法分離細(xì)胞。按上述方法凍干細(xì)胞并染色，然后作細(xì)胞分析。所得結(jié)果是新鮮細(xì)胞 凍干細(xì)胞MC %陽(yáng)性率 MC %陽(yáng)性率B1-FITC 70 12 59 19TII-RDI 64 77 57 67就試驗(yàn)的各抗體來(lái)說(shuō)，外周血淋巴細(xì)胞凍干制品的百分反應(yīng)活性與新鮮PBLS基本相同。兩者的平均頻道熒光也大致相當(dāng)。
圖4是以四個(gè)編號(hào)的方框顯示的復(fù)合流式細(xì)胞計(jì)直方圖，其中使用雙染色的T4和T8 COULTER CLONE 單克隆抗體對(duì)新鮮和凍干的外周血淋巴細(xì)胞(PBLS)進(jìn)行分析比較。所用的制備方法與上述者相同。分析的結(jié)果是新鮮細(xì)胞 凍干細(xì)胞MC %陽(yáng)性率 MC %陽(yáng)性率T4RDI 102 47 105 58T8-FITC 119 31 99 32對(duì)試驗(yàn)的各單克隆抗體來(lái)說(shuō)，凍干PBLS的百分陽(yáng)性率基本上與新鮮PBLS相同。兩種形式PBLS的平均頻道熒光也大致相同，雖然凍干PBLS上用T8染色的單克隆抗體MC稍低，但這并不影響總體分析或比較試驗(yàn)結(jié)果。
將凍干的哺乳動(dòng)物細(xì)胞存放于2-8℃冰箱內(nèi)進(jìn)行保存壽命試驗(yàn)。所獲結(jié)果表明，凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性可維持5個(gè)月以上。
在EPICS
流式細(xì)胞計(jì)中測(cè)定按本發(fā)明方法凍干的兩種穩(wěn)定化人T和B細(xì)胞制劑，與新鮮的人T和B細(xì)胞制備相比較，以證實(shí)其結(jié)構(gòu)保護(hù)作用的程度。第一份混合物由80%T細(xì)胞和20%B細(xì)胞組成;第二份混合物由各50%的T和B細(xì)胞組成。用去離子水使凍干細(xì)胞恢復(fù)含水狀態(tài)并在流式細(xì)胞計(jì)上記錄它們的光散射圖形，即前方位角光散射(FALS)和90°光散射。同時(shí)使用EPICS
流式細(xì)胞計(jì)記錄了相應(yīng)新鮮T和B細(xì)胞制劑的光散射試驗(yàn)圖形。記錄的試驗(yàn)結(jié)果表明凍干之細(xì)胞混合物的光散射圖形與相應(yīng)的新鮮細(xì)胞混合物者相似，從而證實(shí)了凍干細(xì)胞的極好結(jié)構(gòu)保護(hù)作用。
試驗(yàn)還表明細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原性沒(méi)有受到損害。使用了適當(dāng)?shù)厝旧腃OULTER CLONE
單克隆抗體，包括T4、T8、TII、B1、B4、I2和4B4單克隆抗體。
對(duì)陽(yáng)性染色的凍干細(xì)胞進(jìn)行了一系列試驗(yàn)，并且是，將其作為DNA分析的生物學(xué)對(duì)照在EPICS
流式細(xì)胞計(jì)中進(jìn)行的。染色并試驗(yàn)了新鮮和凍干的細(xì)胞，以分析新鮮和凍干的細(xì)胞制劑中細(xì)胞群體周期的進(jìn)度。
在不同的日期并由不同供體(即PBL供體)和定名為PB11和PB44的不同培養(yǎng)物中得到新鮮和凍干的細(xì)胞。這些試驗(yàn)記錄的結(jié)果證實(shí)凍干的細(xì)胞適于用作細(xì)胞周期分析的對(duì)照細(xì)胞。新鮮和凍干細(xì)胞在細(xì)胞周期分析中出現(xiàn)的某些差異可能是因?yàn)槭占辉嚰?xì)胞的時(shí)間不同而導(dǎo)致的。
由上述對(duì)按本發(fā)明方法凍干的細(xì)胞及相應(yīng)新鮮細(xì)胞所作比較分析，可以得出下列結(jié)論1.這些凍干的細(xì)胞可在流式細(xì)胞計(jì)分析法的質(zhì)量控制中，用于體外診斷分析。
2.在用流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志分析時(shí)，這些凍干的細(xì)胞在功能上可作為陽(yáng)性染色的生物學(xué)對(duì)照。從而可用于判定試劑的可靠性、樣品制備技術(shù)，以及流式細(xì)胞計(jì)的正常功能。它們可作為細(xì)胞對(duì)照物，用于鑒定抗細(xì)胞活化抗原和白血病抗原的單克隆抗體。在對(duì)細(xì)胞表面抗原密度進(jìn)行定量分析時(shí)，可用作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。
3.進(jìn)行DNA分析時(shí)，這些凍干的細(xì)胞可起陽(yáng)性染色的生物學(xué)對(duì)照物的作用，以估價(jià)試劑可靠性、樣品制備技術(shù)，以及流式細(xì)胞計(jì)的正常功能。另外還可在細(xì)胞群體的細(xì)胞周期分析中用作標(biāo)準(zhǔn)品。
據(jù)信，由于這些凍干的細(xì)胞保留了形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面抗原的完整性，故也可作為對(duì)照細(xì)胞被用于其他類型的分析檢測(cè)，如用于ELISA和顯微鏡檢驗(yàn)中。用本發(fā)明的凍干方法制備的細(xì)胞可用于免疫檢測(cè)所有的正?；虍惓２溉閯?dòng)物細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)。只要能夠得到檢測(cè)介質(zhì)，如單克隆抗體，是能夠完成檢測(cè)目的。本發(fā)明的凍干方法也可產(chǎn)生適于血液學(xué)顆粒分析儀使用的凍干的對(duì)照細(xì)胞。也可用本發(fā)明方法保存組織細(xì)胞。
與目前普遍使用的熒光小珠或微球相比，在流式細(xì)胞計(jì)中使用凍干的對(duì)照細(xì)胞可具有多種優(yōu)點(diǎn)。熒光微球不適于作為對(duì)照用于樣品制備，不能用于將流式或細(xì)胞計(jì)調(diào)試合適以進(jìn)行細(xì)胞光散射分析，而且它們的熒光是細(xì)胞內(nèi)的而不是細(xì)胞表面的。此外，用流式細(xì)胞計(jì)分析時(shí)，凍干的細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上更相似于新鮮細(xì)胞。
還應(yīng)提到的是，用本發(fā)明方法凍干的儲(chǔ)存細(xì)胞不需要絕對(duì)的儲(chǔ)藏條件，重新水化時(shí)也不需復(fù)雜的操作程序，這與使用冷凍保護(hù)劑并在液氮溫度下儲(chǔ)存以保藏正常外周血細(xì)胞(PBL)時(shí)所遇到的情況完全不同。
值得注意的是，在不背離待批權(quán)利要求中所限定的本發(fā)明基本內(nèi)容的前題下，本領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，可以對(duì)若干技術(shù)細(xì)節(jié)如試劑量或保溫時(shí)間等作某些小的改動(dòng)。
權(quán)利要求
1.一種哺乳動(dòng)物生理細(xì)胞的檢驗(yàn)方法，其中為實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)試劑和檢驗(yàn)儀器的標(biāo)準(zhǔn)化而使用了對(duì)照介質(zhì)，其改進(jìn)包括用能夠在水中重新恢復(fù)含水狀態(tài)后保留新鮮哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性和細(xì)胞表面抗原性的凍干哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并將這種凍干細(xì)胞代替新鮮細(xì)胞作為檢驗(yàn)的生物學(xué)對(duì)照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的檢驗(yàn)方法，其中所說(shuō)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自于外周血細(xì)胞、培養(yǎng)的細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞系或組織細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)方法，其中檢驗(yàn)方法是檢驗(yàn)外周血細(xì)胞的分離的細(xì)胞群體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的檢驗(yàn)方法，其中所說(shuō)的作為生物學(xué)對(duì)照的凍干細(xì)胞其進(jìn)一步特征在于該細(xì)胞在凍干前是通過(guò)使用含10%海藻糖等滲液來(lái)保存的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的檢驗(yàn)方法，其中所說(shuō)的凍干細(xì)胞能夠被陽(yáng)性染色而用作流式細(xì)胞計(jì)方法學(xué)的生物學(xué)對(duì)照。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的檢驗(yàn)方法，其中所說(shuō)的凍干細(xì)胞能夠被陽(yáng)性染色，在流式細(xì)胞計(jì)方法學(xué)中用作DNA分析的生物學(xué)對(duì)照。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的檢驗(yàn)方法，其中所說(shuō)的凍干細(xì)胞能夠用作細(xì)胞群體之細(xì)胞周期分析的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的檢驗(yàn)方法，其中所說(shuō)的凍干細(xì)胞可具有正常或異常的生理狀態(tài)。
全文摘要
一種凍干哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以產(chǎn)生保藏的人細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、組織細(xì)胞及免疫檢測(cè)和其它血液學(xué)檢驗(yàn)所需之對(duì)照細(xì)胞的方法。在冷凍和凍干之前，將已制備的哺乳動(dòng)物細(xì)胞沉淀團(tuán)塊懸浮于以特定最適濃度制成的海藻糖等溶液內(nèi)，并于室溫下保溫一定時(shí)間。當(dāng)重新水化后，凍干的細(xì)胞保留了其適于用作分析對(duì)照的最佳生理學(xué)特性，并可在于2—8°下儲(chǔ)存超過(guò)5個(gè)月之后仍然保留上述特性。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1080322SQ9310156
公開(kāi)日1994年1月5日 申請(qǐng)日期1993年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1988年10月20日
發(fā)明者羅伯特H·雷納, 史蒂文F·小希利, 肯尼思H·科特萊特 申請(qǐng)人:庫(kù)爾特公司